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脊索瘤中候选抗增殖小分子的鉴定
  • 　　每个脊索瘤细胞系对测试化合物的响应定量如下：对数转化的重复数据在发光值归一化到载体处理期间取平均值，并且在每个化合物浓度下，计算平均百分比-存活率得分。在所有细胞系，化合物和浓度下计算百分比-活力响应点测量值。曲线与非线性S形函数拟合，每个CCL-化合物对的AUC通过在8点浓度-响应曲线下数值积分计算。在研究人员的分析中，研究人员与公布的程序不同测试浓度的数量;对所有化合物的AUC使用固定浓度的积分限值;AUC值的标准化范围从1到0;通过DMSO标准化从仪器文件进行数据预处理在PipelinePilot中进行，曲线拟合，数值积分和后续分析步骤在MATLAB中进行。
    　　 为了鉴定脊索瘤中的候选抗增殖小分子，应用阈值仅包括有效化合物。为了评估化合物相对于在CTRP中测试的其他细胞系是否在脊索瘤细胞系中具有选择性细胞毒性作用，研究人员计算了四个脊索瘤细胞系的中位数AUC，并且相对于所有其他细胞系的平均值和标准偏差对该中位数进行了z评分。用该化合物测试细胞系。研究人员应用这种选择性分析来过滤掉细胞毒性作用对脊索瘤细胞系无选择性的强效化合物。一些化合物仅在脊索瘤细胞系中进行了测试，因此没有关于它们在CTRP细胞系中表现的数据;在这种情况下，在初始效力过滤器之外应用任何额外的过滤步骤。28种化合物通过了这些标准，过滤掉了431种化合物。靶向目的蛋白质的化合物被用于二次筛选。
    　　 将UM-Chor1，MUG-Chor1，U-CH1，JHC7和CH22细胞各自在384孔BioCoatCollagenI微量滴定板中以每孔1,200,1,800,2,000,1,600和1,200个细胞的密度接种过夜，分别。第二天，使用HPD300数字分配器仪器将化合物或DMSO加入孔中。使用9种浓度测试每种化合物，一式四份。在用CellTiter-Glo试剂加入化合物后6天测定细胞活力。发光值与初步筛选数据一样处理。从仪器文件到DMSO标准化的数据预处理在用于UM-Chor1的管道试验，MUG-Chor1，U-CH1，JHC7或用于CH22的MicrosoftExcel中进行;和曲线拟合，数值积分和后续分析步骤在MATLAB中进行。扩展数据在每个细胞系中进行至少两次;在扩展数据中描绘的实验图在UM-Chor1细胞中进行至少三次，对于所有其他细胞系进行一次。对于多次进行的实验，使用如上所述的数字分配器仪器或Cybio钉扎仪器进行化合物添加。
    　　 对于具有因组处理的细胞的RNA测序实验：UM-CHOR1细胞用对应于pXPR_001质粒慢病毒温育，编码SG-T_1，SG-T_2或SG-EGFP在4微克毫升存在-1聚凝胺，分配在12孔板中，并在30℃下以2,000rpm旋转感染2小时。自旋感染后，向每个孔中加入2ml标准生长培养基，并将细胞在37℃下孵育过夜。第二天，将细胞用胰蛋白酶消化并在含有嘌呤霉素的选择性培养基中扩增）。选择感染细胞后，用标准生长培养基替换选择性培养基，2天后收集细胞。使用RNeasy试剂盒将细胞沉淀用于RNA提取。使用用于Illumina的NEBNextUltraDirectionalRNA文库制备试剂盒制备测序文库，并使用具有配对末端100碱基对读数的IlluminaHiSeq2500仪器对文库进行测序。对每种条件进行一次测序，每次重复两次。
    　　 对于用化合物处理的细胞进行的RNA测序实验：将UM-Chor1细胞在6-cm胶原蛋白I包被的培养皿中以每皿750,000个细胞的密度接种过夜。第二天，用含有终浓度化合物或DMSO的标准生长培养基替换培养基。在加入化合物或DMSO后4小时收集化合物和DMSO处理的细胞。使用RNeasy试剂盒将细胞沉淀用于RNA提取。使用TruSeqStrandedmRNA文库制备试剂盒制备测序文库，并使用具有单端75bp读数的IlluminaNextSeq500仪器对文库进行测序。对每种条件进行一次测序，每次重复两次。
    　　 出国看病服务机构对RNA测序分析
    　　 对于所有RNA-seq实验，使用TrimGalore处理原始读数！去除衔接子序列并与STAR对应于人类基因组使用GENCODE注释。使用R使用DESeq2包进行差异表达分析。
    　　 基因集富集分析使用GSEA2和基因组从MSigDB进行。研究人员使用'预先'算法来分析基因列表，该基因列表通过使用DESeq2的差异表达分析获得的调整P值的负十进制对数排序。为了分离上调和下调基因，研究人员人为地为下调基因的值赋予负号。
    　　 所有脊索瘤细胞系的全外显子组测序数据来自ChordomaFoundation并根据GATKBestPractices52进行处理。简而言之，从未对齐的BAM文件中读取开始，研究人员使用PicardMarkIlluminaAdapters标记测序适配器，使用BWA对人类基因组进行比对读取，并使用PicardMarkDuplicates标记重复序列。研究人员使用的工具包GATK3执行个Indel的重新排列和重新校准基地。使用GATK4工具包确定体细胞拷贝数变异。
    　　 根据仪器制造商的使用相对量的计算指令RT-qPCR的数据进行了分析??方法。对于每个样品，循环阈值值在技术重复之间取平均值。该Δ??值然后通过减去平均参考基因计算c^?从平均目标基因值??值，对于每个生物复制。研究人员采用了单侧韦尔奇吨-test比较Δ??用于治疗和参考样本值以确定显著差异。记录2倍-变化计算为ΔΔ??减去Δ值??值从Δ参照样品??值经处理的样品。所有计算均在R中完成。
    　　 将UM-Chor1细胞在384孔BioCoatCollagenI微量滴定板中以每孔1,200个细胞的密度接种过夜。第二天，使用HPD300数字分配器仪器将THZ1或DMSO加入孔中。将细胞在37℃温育，分别使用Caspase-Glo3/7和CellTiter-Glo试剂在加入化合物或DMSO后24和48小时平行测定caspase-3/7活性和细胞活力）。每种条件处理四个重复孔。将对应于化合物处理的细胞的发光值标准化为DMSO处理的细胞的发光值，以计算相对半胱天冬酶-3/7活性或相对细胞活力。实验进行两次。
    　　 将MUG-Chor1和UM-Chor1细胞在6cm胶原蛋白I包被的培养皿中以每皿750,000个细胞的密度接种过夜。第二天，用含有终浓度化合物或DMSO的标准生长培养基替换培养基。在加入化合物或DMSO后48小时收集细胞，并将细胞沉淀用于免疫印迹分析。对于UM-Chor1，实验进行了四次，化合物浓度和孵育时间不同，结论相似，MUG-Chor1一次。
    　　 MUG-Chor1，UM-Chor1，U-CH1，JHC7和CH22细胞各自在6cm胶原蛋白I包被的培养皿中以每皿750,000个细胞的密度接种过夜。第二天，用含有终浓度化合物或DMSO的标准生长培养基替换培养基。在加入化合物或DMSO后48小时收集细胞，并将细胞沉淀用于免疫印迹分析。对MUG-Chor1，UM-Chor1和U-CH1进行两次实验，化合物浓度和孵育时间变化，得出相似的结论，一次用于JHC7和CH22。
    　　 将UM-Chor1细胞在6-cm胶原蛋白I包被的培养皿中以每皿750,000个细胞的密度接种过夜。第二天，用含有终浓度化合物或DMSO的标准生长培养基替换培养基。在加入化合物或DMSO后12,24,36和48小时收集细胞，并将细胞沉淀用于免疫印迹分析。实验进行一次。
    　　 将UM-Chor1细胞在6-cm胶原蛋白I包被的培养皿中以每皿750,000个细胞的密度接种过夜。第二天，用含有终浓度化合物或DMSO的标准生长培养基替换培养基。在加入化合物或DMSO后24小时收集细胞，并将细胞沉淀用于免疫印迹分析。对THZ1进行了两次实验，化合物浓度有微小变化，结论与CCT251545相似，其他化合物一次。
    　　 用靶向T和EGFP的sgRNA转导UM-Chor1细胞，并如描述CRISPR-Cas9筛选验证的方法部分中所述用于免疫印迹。转导进行一次;免疫印迹进行两次。
    　　 将细胞沉淀重悬于含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂混合物I的裂解缓冲液中。II将裂解物在冰上温育大于2分钟，然后离心2分钟以15,700xg克。使用BCA蛋白质测定试剂盒定量上清液，标准化，还原和变性。然后使用Tris-甘氨酸凝胶分离蛋白质样品，并将分离的蛋白质转移至iBlotTransferStack硝酸纤维素膜。用一抗在4℃下探测膜过夜。针对brachyury的抗体和CDK7购自SantaCruzBiotechnology。针对cofilin的抗体，总Rb，磷酸-RbS807/S811，磷酸-RbS780，SOX9，总STAT1和磷酸-STAT1S727购自CellSignalingTechnology。针对磷酸-POLR2ASer2，磷酸-POLR2ASer5和磷酸-POLR2ASer7的抗体购自Millipore。针对总POLR2A的抗体购自BethylLaboratories。针对V5标签的抗体购自Invitrogen。将膜与IRDye二抗一起温育，并用Odyssey成像系统检测。使用ImageJ软件通过密度测定法定量免疫印迹。针对磷酸-POLR2ASer2，磷酸-POLR2ASer5和磷酸-POLR2ASer7的抗体购自Millipore。针对总POLR2A的抗体购自BethylLaboratories。
 
出国看病概况

海外医疗在国外发展较为成熟，比如在欧美等医疗技术发达国家，很多医院都设有国际病人办公室并配备多语种医学专业翻译人员，就医流程和模式都已相对成熟。在国内，海外医疗虽然还属于新兴行业，但发展势头迅猛，发展潜力巨大，市场前景广阔。
　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
出国看病适应症
靶向药物
 

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