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脊索瘤肿瘤和正常的邻近组织样本
  • 　　来自马萨诸塞州综合医院的患者来源的肿瘤和正常的邻近组织样本获自F.Hornicek的临床档案。获得机构审查委员会批准以研究这些肿瘤样品。患者给出了他们的肿瘤细胞科学研究的书面知情同意书。切除脊索瘤后，将组织快速冷冻并储存在液氮或-80℃直至后来用于ChIP-seq。如下所述进行免疫组织化学。
    　　 染色由俄亥俄州立大学的组织学核心设施进行。从福尔马林固定的石蜡包埋的患者组织块切下载玻片，并在75℃下加热15分钟，然后如下在二甲苯和梯度醇中脱蜡：二甲苯，5分钟;100％乙醇，5分钟;95％乙醇，2分钟;70％乙醇，2分钟;50％乙醇，2分钟;蒸馏水，2分钟。通过在柠檬酸pH6中蒸汽处理15分钟来进行抗原修复。将载玻片用3％过氧化氢在逆转录下封闭15分钟，然后用水洗涤5分钟，然后快速PBS洗涤。将载玻片与封闭缓冲液一起在逆转录下孵育30分钟，然后与brachyury抗体在4℃下过夜。用PBS洗涤载玻片3×5分钟，然后与第二抗体在37℃温育1小时。用PBS洗涤载玻片3×5分钟。使用3,3'-二氨基联苯胺显色，然后用PBS洗涤3×5分钟。用苏木精进行复染。组织切片用梯度醇如下脱水：50％乙醇，2分钟;70％乙醇，2分钟;95％乙醇，2分钟;100％乙醇，2分钟和二甲苯，5分钟。使用Cytoseal安装载玻片。
    　　 对于源自患者的组织的H3K27acChIP：将约100mg的快速冷冻组织切碎成1-2mm的片并在1％甲醛中孵育15分钟，然后用甘氨酸猝灭。将固定的组织块用TissueTearor转子定子均化器均化，设定为30,000rpm，持续60秒。用含有蛋白酶抑制剂的冰冷PBS洗涤匀浆。然后将均化的沉淀物重悬于细胞溶质裂解缓冲液中并继续进行方案如下所述。
    　　 对于脊索瘤细胞系的H3K27acChIP：脊索瘤细胞系在175-cm胶原蛋白I包被的平板中生长，并通过添加1/10的细胞培养体积的11％甲醛溶液进行交联10分钟，然后猝灭。将细胞在PBS中洗涤，并通过PBS中的细胞刮刀收集。将细胞以1350离心克在4℃下5分钟，用PBS洗涤，并在1350再次离心克在4℃下5分钟。将细胞沉淀快速冷冻并储存在-80℃直至进一步加工。
    　　 对于这两种细胞系和组织芯片起：样品随后在胞质裂解缓冲液旋转翻滚式端10分钟，在4℃，然后通过在1350纺丝收集克5分钟。将样品重悬于核裂解缓冲液中并在4℃下旋转10分钟并旋转。在1,350克，5分钟。将样品重悬于1ml超声缓冲液中，并将SDS加入到最终浓度为0.5％。使用Bioruptor水浴超声波仪通过超声处理剪切染色质25个循环。通过在20,000下离心10分钟澄清样品G在4°C。将50μl等份的上清液留作非IP输入对照。将剩余的剪切的染色质在超声缓冲液中以1：5稀释，并将每个样品在4℃下与100μl与10μg抗H3K27ac抗体结合的蛋白GDynabeads一起温育过夜。在4℃下用以下缓冲液反复旋转珠子进行洗涤：在超声缓冲液中两次，在加入NaCl至最终浓度为500mM的超声缓冲液中一次，在LiCl洗涤缓冲液中一次和一次在TE-NaCl缓冲液中。通过将珠重悬浮于200μl洗脱缓冲液中并在65℃加热15分钟洗脱染色质。通过在20,000离心沉淀珠粒g保持30秒，收集上清液。还向输入的染色质样品中加入洗脱缓冲液。将样品在65℃温育过夜以反转交联。然后将样品与RNA酶A在37℃温育2小时，然后与蛋白酶K在55℃温育30分钟。通过苯酚-氯仿提取进行DNA分离，并通过乙醇沉淀浓缩。用ThruplexDNAseq单索引试剂盒产生测序文库，并在具有单端75bp读数的IlluminaNextSeq500上测序。对每个样品进行一次ChIP-seq。
    　　 对于每个细胞系，将50,000个细胞在4℃下在裂解缓冲液解后，使用×2TD缓冲液和转座酶对沉淀进行转座反应。使用QiagenMinElutePCR纯化试剂盒纯化转座混合物。使用定制的Nextera引物进行文库扩增，并通过运行基于SYBR染料的qPCR反应确定总循环数，并计算对应于最大值的四分之一的循环数。使用QiagenPCR纯化试剂盒纯化扩增的文库，并在IlluminaHiSeq2000上对配对末端100bp读数进行测序。对于每种细胞系进行一次ATAC-seq，对于U-CH2进行两次生物学重复，对于MUG-进行一次重复。本研究中的所有坐标和基因注释均基于人参考基因组装配hg19，GRCh37和RefSeq基因。
    　　 为了在单个基因组基因座样本中紧密地显示来自多个细胞系或患者衍生的脊索瘤样品的ChIP-seq信号。对于组中的所有样品，使用简单的样条函数平滑ChIP-seq信号，并以rpm/bp为单位绘制为半透明形状。较暗的区域表示在更多样本中具有信号的区域。绘制不透明线，并给出组中所有样品的平均信号。
    　　 在脊索瘤细胞系中，活性基因定义为在转录起始位点侧翼的±1-kb区域的至少一个细胞系中具有富集的H3K27ac区域的那些。
    　　 H3K27ac超级增强子和单个脊索瘤样本中的典型增强子使用之前描述的ROSE2软件包进行了映射。对于每个数据集，确定缝合参数，其合并近端峰值，同时优化缝合峰的富集部分。排除基因转录起始位点侧翼的±2.5-kb中包含的峰。为了将增强子分配给T或MAX基因，使用了100kb的接近窗口。
    　　 H3K27ac超级增强剂和典型的增强子复合景观在脊索瘤细胞系或患者衍生的样本中使用之前描述的ROSE2软件包进行了映射-ROSE2_META.py。简而言之，对于给定的样品群，确定所有离散的H3K27ac富集区的并集。对于每个样品群组，确定缝合参数，其合并近端峰值，同时优化缝合峰的富集部分。将整个群组中每个样本的平均背景扣除信号取平均值并用于对增强子进行排序。为了为所有基因指定增强子，使用50kb的接近窗口。在患者来源的脊索瘤样本中，研究人员鉴定了1,490个超级增强子。复合脊索瘤细胞系和患者衍生的样品超增强子的位置，等级，近端和重叠基因。
    　　 细胞系表达数据由Chordoma基金会提供。简而言之，将读数与STAR对准器比对并用Sailfish定量以产生以tpm为单位的表达测量值。研究人员选择了与脊索瘤细胞系中的超级增强子相关的所有基因，表达和在UniProt中注释为转录因子，产生115个基因。
    　　 为了通过H3K27ac增强子谱的相似性聚类ChIP-seq样品，研究人员首先定义了存在于任何单个脊索瘤样品中的所有增强子区域的并集。在所有区域计算ChIP-seq信号，减去背景，然后中值归一化。然后使用跨样本Pearson相关性的分层聚类对样本进行聚类。
    　　 对于细胞活力实验，将UM-Chor1细胞在384孔BioCoatCollagenI微量滴定板中以1,000个细胞/孔的密度接种过夜。第二天，将细胞与对应于编码LACZ或TORF的pLX-Blast-V5表达载体慢病毒一起孵育，在4μgml-1聚凝胺存在下，在1,126旋转感染。G在30℃下保持30分钟，然后在37℃下再孵育4.5-5.5小时，然后用标准生长培养基替换培养基。感染后3天，使用HPD300数字分配仪器，用500nMTHZ1或DMSO处理细胞。在使用CellTiter-Glo试剂加入THZ1/DMSO后6天测定细胞活力。通过在感染后1天向感染的孔中加入3μgml-1杀稻瘟素，在平行实验中测定感染效率。实验进行三次。使用GraphPadPrismv.7进行统计学分析。
    　　出国看病服务机构将UM-Chor1细胞以每孔300,000个细胞的密度接种在六孔胶原蛋白I包被的板中过夜。第二天，在8μgml-1聚凝胺存在下，用对应于编码LACZ或TORF的pLX-Blast-V5表达载体的慢病毒处理细胞，并在37℃温育?在用标准生长培养基替换培养基之前19-20小时。第二天，用含有杀稻瘟素的选择性培养基替换培养基）。在选择感染细胞后，用含有终浓度化合物或DMSO的标准生长培养基替换培养基。在加入化合物或DMSO后48小时收集细胞，并将细胞沉淀用于免疫印迹分析。实验进行两次。
    　　 用于鉴定筛选的每个脊索瘤中的重要基因。通过每行中sgRNA依赖性评分对sgRNA进行排序，然后STARS以5％阈值运行以确保在筛选的所有sgRNA的前5％中对每个基因评分至少两个独立的sgRNA。如果基因通过这些标准，那么基因在每一行中都是必不可少的。将在每个脊索瘤细胞系中得分的那些基因与相同细胞系中表达的，超增强子相关基因的列表相交。使用RNA测序数据评估每个细胞系中的基因表达水平，所述RNA测序数据获自ChordomaFoundation并如RNA测序分析方法中所述进行处理。如ChIP-seq数据分析方法部分所述，对单个脊索瘤细胞系中的H3K27ac超增强子进行了定位，除了研究人员使用50-kb接近窗口为基因指定增强子。对于被认为是由基因下调SG-T_1和SG-T的4f，用sg-T转导的细胞相对于非靶向对照的相对基因表达必须具有log2倍变化<0并且调整的P值<0.01。使用BrachyuryChIP-seq分析，如相关方法部分中所述。中通过显着性阈值的峰相关联。
    　　 两个脊索瘤细胞系CRISPR-Cas9筛选数据，对于所有其它癌细胞系CRISPR-Cas9筛选数据产生作为项目跟腱。所有RNA测序数据可在GeneExpressionOmnibus获得。使用非脊索瘤细胞系产生并用于比较分析的小分子灵敏度数据可在国家癌症研究所的CTD数据门户网站上获得和CTRP。使用脊索瘤细胞系产生的新的小分子初步筛选数据的分析，除非在方法中指出，并且得到的AUC值。用于小分子初筛和低通量化合物灵敏度分析的原始读板器数据文件和随附的PipelinePilot和MATLAB脚本。
 
出国看病概况

海外医疗在国外发展较为成熟，比如在欧美等医疗技术发达国家，很多医院都设有国际病人办公室并配备多语种医学专业翻译人员，就医流程和模式都已相对成熟。在国内，海外医疗虽然还属于新兴行业，但发展势头迅猛，发展潜力巨大，市场前景广阔。
　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
出国看病适应症
靶向药物
 

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