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brachyury转录因子成瘾的小分子靶向
  • 　　脊索瘤是一种主要的骨癌，通常发生在颅底，活动脊柱和骶骨。脊索瘤往往表现为生长缓慢，但局部侵袭性，恶性肿瘤，具有的倾向，尽管手术或放射治疗复发。对于脊索瘤，没有经批准的靶向治疗，常规细胞毒性化疗或免疫疗法。缺乏全身治疗选择，以及对脊索瘤生物学的不充分理解以指导新疗法的开发，导致晚期疾病患者的预后不良7。
    　　脊索瘤假设起源于胚胎脊索残余物。两种细胞类型共享T-box家族转录因子brachyury高表达，是脊索发育的必需调节因子，其过度表达是脊索瘤的特征。除了作为一个脊索瘤生物标志物，短尾似乎是疾病发病机理的关键：种系T复制赋予易感性家族脊索瘤11，在单核苷酸多态性T与脊索瘤相关联，一些零星脊索瘤怀有体细胞拷贝数增益的T，和T沉默抑制脊索瘤模型的生长。此外，短尾在胚胎主要表达，并且是从大多数正常成人组织中不存在。这些研究结果表明，　　brachyury可能作为一种异常激活的发育转录因子，是一种致癌的，并且是一种谱系特异性的必需方式，类似于经典的“谱系生存”癌基因。
    　　然而值得注意的是，脊索瘤的全部肿瘤依赖性尚不清楚。少数基因突变反复，并且只在一个适度的频率在零星的脊索瘤和将近一半的散发病例没有已知的驱动程序突变。还没有在脊索瘤模型中进行系统的功能基因组学研究。因此，尚不清楚brachyury是否代表脊索瘤的中心肿瘤依赖性，或者是否存在尚未发现的关键依赖性，并且如果是前者，是否可以在治疗上靶向brachyury过度表达。与其他转录因子相似，brachyury在药理学上不易被抑制并且没有鉴定出brachyury的小分子抑制剂。还不知道大多数脊索瘤肿瘤中brachyury失调的基础，以及过表达的任何潜在介质是否具有治疗靶向性。T的体细胞改变发生在少数散发性脊索瘤，并不能解释近乎普遍存在的brachyury表达。更深入地了解脊索瘤中的必需基因，包括brachyury表达的潜在调节因子，对于提名候选治疗靶标是必不可少的。
    　　系统CRISPR-Cas9筛选和小分子灵敏度分析方法的最新进展使得能够鉴定多种癌症类型中的肿瘤依赖性。研究人员整合了这些互补方法，以确定脊索瘤的关键肿瘤依赖性和候选治疗靶点。
    　　为了鉴定脊索瘤细胞活力所必需的基因，研究人员在两个脊索瘤细胞系中进行基因组规模汇集的CRISPR-Cas9功能丧失筛选。研究人员引入了大于74,000个单指导RNA文库，通过慢病毒转导将18,560个基因靶向稳定表达Cas9的细胞，21天后，从存活细胞的基因组DNA中定量sgRNA。通过比较这些sgRNA丰度与筛选文库的丰度来鉴定代表候选必需基因的耗尽的sgRNA。研究人员通过他们多少降低脊索瘤细胞相对于125个非脊索瘤癌细胞系活力使用相同的因组文库中筛选排名所有sgRNAs，从而去除通常必需的基因，以识别对脊索瘤有选择性的依赖性。
    　　在分析的70,000个sgRNA中，前三个选择性致死的sgRNA均靶向T基因。研究人员证实，筛选的4个T靶向sgRNA中的3个对两种脊索瘤细胞系都是致死的，但对125个非脊索瘤癌细胞系不致死。靶向脊索瘤细胞中的T诱导了与靶向通常必需的核糖体亚基基因RPL23，RPS11和RPS19相似程度的活力降低，表明脊索瘤细胞对于brachyury表达的丧失都精确且有选择性地敏感。
    　　研究人员用三种脊索瘤细胞系中靶向T的独立序列的两种sgRNA验证筛选结果。在通过因组介导的brachyury抑制诱导脊索瘤细胞增殖所观察到的减少是与因组介导的基因沉默的先前报道的影响是一致的T在其他脊索瘤细胞系。
    在UM-Chor1细胞中SgRNA介导的T抑制导致经典脊索标记物的下调，这与brachyury在脊索发育中的已知作用一致。此外，与G2/M检查点和E2F靶相关的基因在下调的基因中富集，提示sg-T表达细胞中的细胞周期停滞。这些数据暗示T作为脊索瘤中脊索细胞身份的必需基因和调节因子。
    　　与遗传筛选平行，研究人员测试了459个小分子在四种脊索瘤细胞系中减少增殖或存活的能力。选择化合物以共同靶向细胞回路中的许多不同节点，并包括由食品和药物管理局批准的药物，临床前试剂和小分子探针。先前在约800个非脊索瘤癌细胞系测试了大部分重叠的小分子文库，并且研究人员使用这些数据来鉴定并优先考虑具有对脊索瘤选择性具有抗增殖作用的化合物。
    　　研究人员的分析鉴定了28种有效的抗增殖化合物，包括几种CDK7/12/13，CDK9或EGFR/ERBB2蛋白的抑制剂。鉴于CDK7和CDK9在调节转录具有相关作用，研究人员假设这些抑制剂类别可能具有相似的机制效应。
    　　脊索瘤细胞的敏感性的化合物靶向CDK7/12/13，CDK12/13，CDK9，和EGFR或ErbB2使用多点浓度-响应测定进行验证。包括THZ1，dinaciclib和alvocidib在内的转录CDK抑制剂在多种癌细胞系中表现出抗增殖作用。与小分子敏感性发现一致，靶向CDK7，CDK13和CDK9的sgRNA，但不是靶向CDK12的sgRNA，对脊索瘤细胞是致命的。靶向EGFR和ERBB2的SgRNA分别对2/2和1/2脊索瘤细胞系是致死的。先前已经描述了脊索瘤中EGFR抑制剂的敏感性;研究人员专注于转录CDK抑制剂，这是新的脊索瘤鉴定增殖剂。
    　　研究人员通过检测RNA聚合酶II的C末端结构域的磷酸化降低，特别是在丝氨酸2处，证实了CDK7/12/13抑制剂THZ1的靶向活性。除了具有抗增殖作用外，THZ1处理诱导脊索瘤细胞凋亡，如通过增加的胱天蛋白酶-3/7活性所测量的。研究人员没有观察到脊索瘤细胞对CDK蛋白抑制剂具有可比较的敏感性，这些CDK蛋白不参与POLR2ACTD的直接磷酸化，包括CDK4/6抑制剂和CDK8/19抑制剂。对于选定数量的测试的CDK抑制剂确认了靶标活性。总之，这些数据表明CDK7/12/13和CDK9的抑制剂是脊索瘤中有效的抗增殖剂。
    　　转录CDK抑制剂正在进行临床研究，因为它们能够在多种癌症类型中下调优先致癌转录因子。转录装置的组件，包括CDK7，可以密集地占据超增强剂-大驱动转录抑制剂所需的特别易受伤害的超增强剂驱动基因肿瘤身份经常呈现表达基因群集增强剂。为了研究类似的机制是否将T的必要性与转录CDK抑制剂的抗增殖作用联系起来，研究人员测试了是否T是脊索瘤相关的超级增强剂。
    　　研究人员使用染色质免疫沉淀测序在5个脊索瘤细胞系中绘制增强子图谱，以检测组蛋白H3赖氨酸27乙酰化，这是与活性增强子相关的染色质修饰。研究人员在所有五个模型中鉴定了与T基因座重叠和相邻的大增强子。T增强子显示brachyury结合的证据，通过brachyuryChIP-seq测量通过使用测序测定转座酶可接触的染色质的测定所暗示的可能的其他转录因子，其测量染色质可及性和转录因子占有率。相反，尽管存在其它转录因子结合位点，但在管家转录因子MAX基因座处未检测到超增强子和brachyury结合，如ATAC-seq信号所推断。
    　　所有脊索瘤细胞系都具有高T表达，特别是与非超增强子相关基因如MAX相比;相反，T在非脊索瘤癌细胞系中没有广泛表达。此外，在脊索瘤的所有超增强子相关转录因子中T表达最高，并且当与所有其他增强子相比时，T-相关超增强子是最大的。脊索瘤基因组。JHC7细胞在包含相邻T增强子的T基因座处具有大的焦点扩增，以及具有宽H3K27ac占据的1.5-Mb上游区域。
    　　在患者来源的脊索瘤肿瘤中类似地观察到T-相关的超增强剂，如通过八个肿瘤和个体肿瘤中平均增强子等级所检测的。对于测试的肿瘤子集证实了Brachyury表达。通过增强子排名，八个肿瘤中有四个具有T-邻近的超级增强子，八个中的七个具有T相邻增强子在所有增强子中排名前10％，8个中有8个在JHC7细胞中发现的1.5-Mb区域中高度乙酰化。相反，匹配的正常邻近组织在该1.5-Mb肿瘤高乙酰化区域内缺乏H3K27ac占据。
    　　跨肿瘤和细胞系的增强子模式显示出体内或离体状态的分组，类似于其他癌症类型。尽管如此，在肿瘤和细胞系中，与已知在脊索瘤中高度表达的基因相关的超级增强子：细胞外基质的组分或其相互作用物），去分化和EGFR的介质。因此，如在其它癌症，超增强剂关联与限定脊索瘤同一性的基因，和调节T通过超级增强剂是脊索瘤基因调控领域的主要特征。
    　　T的必要性及其与超级增强子的关联使研究人员测试转录性CDK抑制剂的抗增殖作用是否由优先丧失的brachyury表达介导。
    出国看病网研究人员发现THZ1处理以浓度和时间依赖性方式降低MUG-Chor1和UM-Chor1细胞中的细胞brachyury蛋白水平。相反，在用对脊索瘤细胞具有细胞毒性的化合物处理后，brachyury蛋白表达没有变化，但不是转录CDK抑制剂，包括EGFR，Src和BET溴结构域的抑制剂。在用多种脊索瘤模型处理CDK9抑制剂后，观察到brachyury表达的下调，但不是CDK4/6抑制剂palbociclib的下调。
    　　THZ1处理也显着降低了T的mRNA表达，特别是与MAX或管家基因CFL1相比。为了比较，研究人员测试了放线菌素D，一种不被认为通过CDK抑制起作用的转录抑制剂，并且类似地观察到T的mRNA下调，但不是MAX或CFL1。然而，与THZ1相比，放线菌素D在浓度下诱导更高的细胞毒性，导致显着的T-mRNA下调，表明THZ1和放线菌素D在选择性如何诱导T下调方面可能不同。
    　　研究人员使用THZ1-和放线菌素-D处理的细胞的转录组范围的基因表达谱证实了这种差异。仅THZ1处理导致T表达的优先下调，表明超增强子驱动的T转录特别易受CDK7/12/13抑制。
    　　此外，研究人员测试了THZ1的抗增殖作用是否由超增强子驱动的brachyury表达的丧失介导。为了使T与其内源调节元件解离，研究人员在外源启动子的控制下用编码T的ORF转导UM-Chor1细胞。与内源性brachyury蛋白不同，THZ1处理不会大大降低异位brachyury表达水平。异位brachyury表达足以部分地挽救由500nMTHZ1处理诱导的活力丧失。通过其内源调节元件下调brachyury直接有助于THZ1的抗增殖作用。
    　　除了T之外，在UM-Chor1和MUG-Chor1细胞中仅鉴定出四种基因是超增强子相关的和必需的：SOX9，SAE1，TPX2和ATP6V1B2。这些基因似乎受到brachyury的直接或间接转录控制：sgRNA介导的T抑制显着降低了所有四种基因的表达水平和brachyury结合基因组区域对应于其中两个。
    　　这些数据支持一种模型，其中T由超级增强剂以高水平表达，是自动调节的，并且通过直接结合其他超级增强子或间接机制，可以调节其他必需的，超级增强子相关基因。转录的CDK包括CDK7和CDK9在增强剂局部，这些数据暗示在上游和下游定位转录CDK抑制T基因控制。
    　　在体内测试THZ1功效。用人类脊索瘤细胞系CH22产生的异种移植小鼠模型。离体，CH22细胞对转录CDK抑制剂敏感，并且化合物处理诱导了brachyury表达的下调。在脉冲给药方案中用40mgkg-1THZ1BID处理小鼠。该剂量相当好地耐受，并且在经验上确定下调小鼠肿瘤的靶向接合研究中的brachyury表达虽然研究人员注意到brachyury下调的检测在实验和小鼠之间变化。
    　　THZ1治疗导致显着的肿瘤抑制作用。这些数据为THZ1治疗脊索瘤的体内功效提供了证据。
    　　总之，这些发现提名转录CDK抑制作为靶向脊索瘤中brachyury驱动的转录成瘾的治疗策略。研究人员的结果表明，T脊索发育的转录调节因子，可能在失调或持续表达时驱动脊索瘤肿瘤发生。，T类似于其他'谱系存活'致癌基因，这是由调节正常谱系发育的主基因的失调表达引起的。这些发现为脊索瘤中的“转录成瘾”提供了证据，这是一种对基因表达的特定调节因子具有精确依赖性的状态。由于转录依赖性通常不是通过肿瘤基因组测序发现的，因此这些发现强调了功能筛选方法的价值，以确定可能不会表现为肿瘤基因组突变的关键脆弱性。
    　　包括brachyury在内的转录因子难以直接针对候选药物。转录性CDK抑制提供优先下调T的治疗机会。最近，下一代转录CDK抑制剂进入临床可能为患有难治性疾病的脊索瘤患者提供急需的治疗选择。
 
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