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阿法替尼治疗脊索瘤的方法探索
  • 　　脊索瘤是沿轴向骨骼发展的原发性恶性骨肿瘤，通常在skull骨或颅底，但在活动脊柱中频率较低。脊索瘤是罕见的肿瘤，发病率低于1：1,000,000，占所有原发性骨恶性肿瘤的1％至4％。它们通常是发病较晚的肿瘤，在生命的第五个和第六个十年之间发病率最高，但是也可能发生在儿童和年轻人中。脊索瘤是生长缓慢的肿瘤，但是其特征是即使在原发肿瘤的完全手术切除后仍具有较高的复发率。远处转移发生在20％至30％的病例中，但局部复发影响大于50％的患者。在复发的情况下，手术或放疗变得具有挑战性，患者通常会死于疾病。由于这些肿瘤沿神经轴的位置，患者通常会出现身体机能障碍和明显的疼痛，需要吗啡衍生物和类固醇。目前尚无标准的药物治疗方法，脊索瘤对细胞毒性化学疗法有抵抗力。
    　　 脊索瘤起源于胚胎的脊索脊残余，其特征是“T”基因产物“brachyury”的表达，脊索瘤是中胚层规格和发育过程中必不可少的脊索特异性转录因子。成年人的脊索神经节残中短波尿的异常表达被认为在脊索瘤的发作和维持中起主要作用。脊索瘤细胞系中的腕状支气管沉默被证明会削弱细胞增殖并诱导衰老，目前正在尝试通过疫苗靶向表达腕部支气管炎的细胞。脊索瘤通常表现出酪氨酸激酶受体和下游信号分子的表达和激活，其中最广泛表达的是MET，PDGFRB和EGFR，而HER2，KIT和VEGFR也表达。
    　　 针对EGFR和PDGFR的临床批准药物的可得性促使在II期临床试验中针对选择表达相应药物靶点的脊索瘤患者评估了伊马替尼和拉帕替尼。伊马替尼虽然没有达到尺寸和持久的反应，但仍显示出一定的临床益处，而拉帕替尼未显示出真正的临床益处。然而，已有报道对其他EGFR抑制剂有轶事反应，这表明EGFR抑制剂可能对这些肿瘤具有治疗潜力。最近，基于体外试验，索拉非尼在脊索瘤上进行了II期临床试验该药物对VEGFR和PDGFR家族成员的活性。在这项研究中，没有选择或表征患者相应受体的表达。值得注意的是，与伊马替尼相比，索拉非尼实际上获得了更长的无进展生存期。由于生物学模型的缺乏，用于鉴定在脊索瘤中有活性的药物的系统性临床前研究受到限制，因为U-CH1和U-CH2细胞系代表仅有的两种可用的经验证的脊索瘤细胞系。最近，可通过患者倡导组织ChordomaFoundation获得更多真正的脊索瘤细胞系。为了鉴定对脊索瘤患者可能具有治疗兴趣的激酶抑制剂药物，研究人员组装了一个代表性的脊索瘤细胞系，评估了它们对EGFR，PDGFR和MET抑制剂的敏感性，包括批准的药物和其他代表性化合物。
    　　 U-CH1，U-CH2，JHC7和UM-Chor1细胞系获自ChordomaFoundation。MUG-Chor1和U-CH2细胞系购自ATCC。从外科手术样本中在内部建立了Chor-IN-1细胞系。将脊索瘤细胞系在37℃在含有5％CO2的湿润气氛中，用IMDM培养基在胶原蛋白包被的板中培养。培养基中添加了10％热灭活的FBS。所有细胞系均通过短串联重复序列分析进行验证，并在到达后以及复苏后6个月内检查支原体的存在。使用了以下抗体：抗brachyury，抗EGFR，抗PDGFRB，抗-MET，抗P-MET，抗-P-STAT3，抗-P-AKT，抗GAPDH，抗P-Tyr，抗P-MAPK，抗-Caspase3和NB的抗LC3B抗体。辣根过氧化物酶偶联的二抗以1：10,000的比例使用。使用来自ThermoScientific的SuperSignalWestPico化学发光底物进行检测。
    　　 通过LC-HRMS分析和H-NMR确认化合物的身份和纯度。将化合物溶解在100％10mmol溶液中，并在–20°C的受控气氛下存储。通过在DMSO中进行系列稀释来制备所有化合物工作储备液，然后以1：1,000的比例稀释到细胞培养基中，以使所有孔中的DMSO最终浓度达到0.1％。处理前24小时，将细胞以3,600个细胞的密度接种在384孔白色透明底平板中。加入化合物，并将细胞再温育144小时。细胞裂解后，通过定量ATP含量确定细胞活力。通过使用S形拟合算法比较处理数据和对照数据来计算抑制活性。处理前48小时，将指数生长的细胞接种到60mm平板中。将化合物添加到培养基中，并将板温育指定的时间。然后将细胞用冰冷的PBS洗涤两次并在RIPA缓冲液中裂解EDTA，蛋白酶抑制剂Cocktail和磷酸酶抑制剂CocktailI和II。裂解液通过以16,000xg离心10分钟进行澄清，样品以4％的比例分馏至12％SDS-PAGE，然后转移到硝酸纤维素膜上，用上述抗体在5％牛奶和0.1％Tween20中的TBS1X中进行免疫印迹。
    　　 临床前研究是根据国际动物护理和使用委员会批准的方案，通过加速研究治疗学的ChordomaFoundation药物筛选管道进行的。在以下方面测试了抗肿瘤活性：1）U-CH1：U-CH1细胞系的异种移植。2）SF8894：PDX模型。3）CF322：由一名42岁男性的脊柱复发性肿瘤产生的新脊索瘤PDX模型。4）CF365：由一名11岁男性的脊柱低分化转移性肿瘤生成的新脊索瘤PDX模型。对于所有模型，将6至8周龄的无胸腺裸鼠皮下植入宿主动物的肿瘤片段。一旦肿瘤达到约150至250mm3，将动物与肿瘤体积匹配，并随机分为对照组和治疗组。所有组均以每天20mg/kgPO给药，U-CH1和SF9984组给药28天，CF322和CF365组结束给药。初始剂量从第0天开始，每天观察动物并每周称重两次。使用数字卡尺和电子秤以电子方式收集电视和动物体重数据；使用公式TV=宽度2×长度×0.52。终点是大约1至2厘米3的平均对照电视。使用初始和最终肿瘤测量值计算并报告治疗组与对照组的肿瘤生长抑制百分比。使用双向方差分析，然后进行Dunnett多重比较检验，进行统计分析。
    　　 在1X细胞裂解缓冲液CLBEZBlock蛋白酶抑制剂混合物不含EDTA的BV-K272，EZBlock磷酸酶抑制剂混合物II，BV-K275-1EAEZ，磷酸酶抑制剂混合物III，BV-K276-1EA-Vinci-Biochem。将蛋白GSepharose4快速流动液用冰冷的PBS洗涤4次，预先加载抗EGFR抗体的PBS溶液，于室温温和摇动孵育过夜4℃。通过用蛋白质GSepharose在4°C摇动20分钟来预澄清细胞裂解液，之前用冰冷的PBS洗涤4次，用CLB缓冲液洗涤1次。将预加载的树脂抗体与细胞裂解液一起在4°C孵育3小时。将样品转移到cytospin过滤器上，用CLB缓冲液洗涤3次，然后在95°C的Laemmli-SDS缓冲液2X中洗脱。
    　　 研究人员组装了一组脊索瘤细胞系，其中包括of来源的细胞，例如广泛使用的U-CH1和U-CH2，最近建立的MUG-Chor1和JHC7，以及第一个可用的分支细胞系。此外，测试了Chor-IN-1，这是一种从from骨脊索瘤外科手术样本中衍生的新细胞系，显示符合脊索瘤细胞系的验证标准。首先通过STR指纹图谱鉴定所有细胞系。从两个来源获得的U-CH2细胞的STR图谱在一个位点上有所不同，这表明在其繁殖过程中几乎没有差异。因此，并行测试了两个克隆。
    　　显示MET和EGFR在不同细胞系中显示相似的表达水平，而HER2几乎不可检测。PDGFRB表达更加异质，范围从非常低的到很高的表达。下游信号分子在不同细胞系中被差异激活，与受体表达没有特异性相关性。
    　　 为了评估这些酪氨酸激酶受体对脊索瘤细胞生长的重要性，出国看病网的研究人员组装了一系列有效的MET，PDGFRB和EGFR抑制剂，包括批准的药物以及其他参考抑制剂。考虑到脊索瘤细胞的缓慢生长速度，在144小时的孵育后确定化合物的抗增殖活性，以使两个种群倍增。同时，在参考细胞系上对抑制剂进行了分析：胃腺癌MKN-45，NSCLCNCI-H1703PDGFRA扩增和表皮样癌A431EGFR扩增用作阳性对照，而卵巢癌A2780细胞系用作一般阴性对照，因此预期没有靶标依赖性活性。
    　　 克里唑替尼和卡博替，两个批准MET抑制剂药物，和MET-选择性抑制剂PHA-665752未对抗脊索瘤细胞系显示相当大的抗增殖活性，与IC总比那些更高测量A2780对照细胞系的细胞数量。用几种PDGFR抑制剂，包括批准的药物舒尼替尼和伊马替尼观察到类似的结果以及克莱拉尼。然后，研究人员测试了临床认可的EGFR抑制剂药物erlotinib，gefitinib，afatinib和lapatinib，它们在EGFR家族中具有不同的效力和选择性。所有化合物对U-CH1和UM-Chor1细胞系均具有活性，尽管效力不同。特别是，阿法替尼对两种细胞系均非常有效，IC分别为0.014和0.023umol/L，而其他三种药物的IC50则在0.1-0.8umol/L范围内。而且，阿法替尼是唯一对所有细胞系都具有活性的药物，尽管具有不同的效力，但JHC7除外。其他EGFR抑制剂erlotinib，lapatinib和gefitinib尽管在亚微摩尔范围内对U-CH1和UM-Chor1具有活性，但通常对其他脊索瘤细胞系未显示出显着的抗增殖活性。
    　　 调查是否这些结果与效力和抑制EGFR的阿法的共价机制相关，研究人员还测试了共价EGFR抑制剂来那替尼和dacomitinib。两者均在纳摩尔范围内抑制U-CH1和UM-Chor1，但在其他细胞系上的活性较弱，与在A2780对照细胞系中观察到的IC50相比具有更高的IC50s。有趣的是，达可替尼在U-CH1和UM-Chor1中显示的IC50值与阿法替尼相当，但在其他细胞系中通常不活跃，因此表明阿法替尼在脊索瘤区的活性不仅与其抗生化能力有关EGFR。说明，T790MEGFR突变体选择性的共价抑制剂osimertinib和rociletinib是无活性的或在所有脊索瘤细胞系差的活性，如所预期在没有EGFR突变。这些数据表明，用阿法替尼观察到的针对脊索瘤的抗增殖作用与EGFR抑制有关，但不仅与其效价或共价作用机制有关。为了获得通过阿法替尼治疗诱导的效应的动态视图，研究人员使用多孔自动显微镜进行了动力学活细胞分析。用阿法替尼或阿霉素标准液处理U-CH1细胞，并生成延时电影，其中整合了通过144小时处理获得的活细胞图像序列。随着阿法替尼或阿霉素浓度的增加，细胞汇合度随着时间的推移逐渐降低，而在未处理的细胞中则逐渐增加。在活性化合物浓度下，图表触底到背景信号，代表细胞碎片的图像分析。相反，用阿霉素处理后，用特定的荧光染料测得的caspase3和caspase7诱导是显而易见的，但使用阿法替尼治疗后无法检测到。该实验证明阿法替尼以时间和剂量依赖性的方式抑制U-CH1细胞增殖并诱导细胞死亡，并表明细胞死亡的主要机制不是细胞凋亡。
    　　 然后，研究人员研究了对所有EGFR抑制剂有反应的U-CH1细胞中用阿法替尼，厄洛替尼或拉帕替尼治疗后剂量和时间依赖性的生物标志物调节作用。在短时间和较长时间的孵育时间后，三种抑制剂以剂量依赖性方式调节AKT和MAPK途径，其剂量与抗增殖IC50s一致。相反，STAT3激活不依赖于这些细胞中的EGFR信号传导。直到48小时都未观察到Caspase3的裂解，这再次表明除了细胞凋亡外，其他机制也参与了这些抑制剂的抗增殖作用。用afatinib和erlotinib的治疗诱导了LC3B的细胞质和膜结合形式的总水平降低，暗示了自噬途径的潜在参与。
    　　 这三种化合物的作用机理的一个显着差异是在最近的时间点对短毛象和EGFR蛋白水平的影响。孵育48小时后，阿法替尼不仅诱导EGFR总水平大幅下降，而且还引起臂丛蛋白的剂量依赖性下降。在厄洛替尼治疗后观察到EGFR耗竭，但程度较小，在拉帕替尼治疗后不存在。Brachyury表达不受厄洛替尼或拉帕替尼治疗的影响。为了评估阿法诱导的EGFR和短尾下调是否是有联系的抑制更强效力或共价机制，研究人员分析dacomitinib，其显示类似IC的效果S于U型CH1和UM-CHOR1，但通常是无活性的其他细胞系。用达可替尼处理U-CH1细胞诱导了P-AKT水平的剂量依赖性下调，但与阿法替尼不同，它不影响EGFR和短至5umol/L的总水平。这些数据支持以下假设：用阿法替尼观察到的针对脊索瘤细胞系的活性可能与其消融与脊索瘤细胞生长有关的两种蛋白质的能力有关，而不仅与其EGFR抑制的效力或共价机制有关。
    　　 为了研究这种特定机制是否也在其他阿法替尼反应性脊索瘤细胞系中发生，将MUG-Chor1和Chor-IN-1用该化合物处理并进行了免疫印迹分析。在每个细胞系中，EGFR和腕膜下皮细胞的下调均以相同的剂量响应方式发生，这与测得的IC50s相关。因此，阿法替尼被证明是唯一在整个脊索瘤细胞系中显示活性的EGFR抑制剂，尽管具有不同的效力，并且是唯一诱导两种已知在脊索瘤细胞生长中起主要作用的生物标志物下调的抑制剂。为了探索EGFR和短毛象之间的潜在相关性，分析了它们对siRNA的相互影响。用特定的siRNA寡核苷酸转染U-CH1细胞可诱导相应靶蛋白的完全消融，而对其他蛋白无影响。在这两种情况下，都观察到了强烈的细胞活力受损，因此证实了短纤毛虫和EGFR在脊索瘤细胞生长中起着至关重要的作用。研究人员排除了这种下调是转录发生的，因为用0.1和1umol/L阿法替尼处理U-CH1细胞24或48小时不会影响短臂神经节mRNA，而只会略微降低EGFRmRNA。
    　　 取而代之的是，在存在MG-132或巴氟霉素的情况下，用afatinib处理U-CH1细胞可防止afatinib诱导的EGFR和短纤毛蛋白消融，因此表明这些蛋白的下调蛋白质涉及蛋白质降解途径。然后，研究人员评估了afatinib在U-CH1异种移植和SF8894，CF322和CF365PDX小鼠模型中的体内活性，该模型如“材料和方法”部分所述而生成。在所有分析的模型中，每天在指定的时间内用20mg/kg阿法替尼对小鼠进行口服治疗均诱导了有效的肿瘤生长抑制，没有明显的毒性迹象，敏感细胞系带有磷酸化的EGFR，而JHC7的基础磷酸化水平最低。有趣的是，用阿法替尼治疗可在U-CH1细胞系中诱导EGFR完全磷酸化，但并未降低JHC7中检测到的弱P-Tyr带。由于用afatinib进行的治疗还完全消除了MUG-Chor1，Chor-IN-1和U-CH2细胞系中的EGFR磷酸化，因此在JHC7中观察到的条带可能是由于识别了不同的磷酸化位点，而不是与受体激活有关。因此，脊索瘤细胞系对afatinib的敏感性似乎通常与EGFR磷酸化相关，而JHC7细胞系缺乏EGFR激活可能是所测得的较高IC50。
    　　 为了确定对afatinib敏感性不同的其他潜在决定因素，研究人员分析了AXL的表达，据报道该AXL在不同类型的肿瘤中介导抗EGFR治疗的耐药性。AXL表达与对阿法替尼的敏感性成反比，在U-CH1和UM-Chor1细胞系中表达较弱，在较不敏感的MUG-Chor1，U-CH2和Chor-IN-1细胞中表达较高线。在JHC7中未观察到AXL的表达，其中EGFR途径未激活。有趣的是，在针对全基因组的测序中，并行评估U-CH1与其他骨脊索瘤细胞系中大约500种激酶的差异表达，STK33成为唯一在U-CH1中无法检测到且在其中较高表达的激酶。其他细胞系。然后，通过RT-qPCR评估了STK33在所有细胞系中的表达，在afatinib高响应性U-CH1和UM-Chor1细胞系中均未发现表达，同时确认了其他细胞系中的相关表达。最后，进行了药效学研究，以阿法替尼治疗U-CH1，MUG-Chor1和Chor-IN-1细胞系1和2小时后，评估EGFR信号以及AXL和STK33水平。未检测到AXL和STK33mRNA或总蛋白水平的相关变化。尽管在0.1umol/L阿法替尼中所有细胞系中EGFR磷酸化均被消除，但U-CH1细胞系中P-AKT被关闭，但在MUG-Chor1和Chor-IN-1中显示出轻微的增加趋势。强调了afatinib在这些细胞系中的活性是由超出EGFR激酶抑制作用的细胞机制所贡献。
    　　 迄今为止，仅进行了少数临床试验来评估靶向治疗剂在脊索瘤中的疗效，这肯定受到迄今为止可获得的该适应症临床前模型的数量有限的限制。研究人员最近在基因组水平上深入分析了origin骨脊索瘤细胞系，其中还包括在研究人员实验室中建立并鉴定的新型细胞Chor-IN-1。为了确定可能对脊索瘤患者有立即治疗作用的新药，研究人员评估了据报道在脊索瘤中经常表达的MET，PDGFRB和EGFR酪氨酸激酶抑制剂的体外抗增殖活性。MET抑制剂没有显示出明显的活性，因此未作进一步研究。PDGFR抑制剂也没有活性，即使在PDGFRB表达强的细胞系中，例如U-CH2和UM-Chor1。考虑到伊马替尼的II期临床试验证明对脊索瘤患者有一定的临床益处，PDGFRB在肿瘤微环境中的抑制作用可能导致其作用超出体外对肿瘤细胞的单纯抗增殖活性，或者肿瘤中的PDGFRB可能被旁分泌机制激活在体外丢失。有趣的是，在临床上观察到的对伊马替尼的反应主要与肿瘤特征的改变有关，而不是与肿瘤的大小有关。
    　　 文献中的大量报道强调了脊索瘤细胞系，动物模型以及患者中偶发性的不同EGFR抑制剂的活性，提供了EGFR抑制剂在脊索瘤中潜在的临床意义的证据，但是还提出了有关最合适的代理商的问题。研究人员将研究重点放在临床批准的EGFR抑制剂上，并观察到它们均具有针对U-CH1和UM-Chor1细胞系的活性，尽管具有不同的效力。阿法替尼是这些细胞系中最有效的抑制剂，而拉帕替尼除对其余细胞系无活性外，活性最低。这可能预示了临床上拉帕替尼的活性较差。除JHC7以外，阿法替尼还是唯一一种在整个脊索瘤细胞系中具有活性的药物，尽管表达了显着水平的EGFR并不受EGFR信号驱动。阿法替尼在脊索瘤细胞系中的活性特别相关，因为该药物在生化方面具有非常高的选择性，并且其细胞活性取决于EGFR途径的激活。以U-CH1和UM-CHOR1脊索瘤细胞系阿法的活性等同于所报道的突变EGFR依赖性肺肿瘤在体外，这表明脊索瘤也可能代表这种药物潜在的指示。
    　　 这些细胞学数据也得到了令人印象深刻的体内功效的证实，其中一种脊索瘤异种移植物和三种不同的PDX模型均具有肿瘤生长抑制作用。发表了针对性的化合物筛选，描述了脊索瘤细胞系中EGFR抑制剂的活性，U-CH1和UM-Chor1细胞系对EGFR抑制剂敏感，发现afatinib在UM-Chor1上有活性，但在U-CH1细胞系中没有。考虑到研究人员在体外，下游信号通路的调节下反复观察到阿法替尼在U-CH1上的强大活性，因此他们在U-CH1中观察到的活性不足可能与不同的筛选条件或化合物处理有关。与可逆抑制剂埃洛替尼，吉非替尼和拉帕替尼不同，阿法替尼包含一个能够在EGFR，HER2和HER4催化域内将迈克尔加成至保守半胱氨酸的亲电基团。持久抑制受体的磷酸化。然而，阿法替尼在脊索瘤细胞系中的活性似乎不仅与其更高的效力和共价机制有关，因为具有相同机制的那拉替尼和达可替尼仅在U-CH1和UM-Chor1细胞系中具有活性。
    　　 该活性下调EGFR和Brachyury蛋白的总水平的独特能力似乎是该活性的有力贡献，而其他抑制剂没有这种功能。最近显示出afatinib在从用afatinib治疗的NCI-N87异种移植物收获的肿瘤中诱导HER2和EGFR总水平的下调。Brachyury是散发性脊索瘤的独特标志，T基因位点的重复是家族性脊索瘤的典型特征，而T基因的DNA多态性与一般人群的脊索瘤易感性有关。因此，广泛显示在脊索瘤细胞系中腕膜上的沉默降低了体外和体内肿瘤的生长。Brachyury将代表脊索瘤中药物开发的明显目标，但是迄今为止，用小分子直接抑制转录因子一直是极具挑战性的。除了抑制EGFR信号转导外，还可以诱导腕膜坏死的降解的小分子的鉴定代表了一种新的方法，该方法通过激酶抑制剂间接靶向这一重要的转录因子。
    　　 总体而言，在不同细胞系和体内模型中测试EGFR抑制剂表明，脊索瘤的一个子集由EGFR信号通路驱动，并且对EGFR抑制非常敏感。在临床前，这种敏感性与EGFR磷酸化水平相关，因此评估其在临床研究中是否成立很重要。Mug-Chor1，U-CH2和Chor-IN-1脊索瘤细胞系显示出AXL受体的强表达，因为它代表了肺癌的耐药机制。如果在脊索瘤中也发生这种情况，已经在临床中与AXL抑制剂联合治疗可能对这些类型的患者有益。在对阿法替尼最敏感的细胞系中不存在的STK33，也代表阿法替尼敏感性的候选生物标志物。这些数据为阿法替尼在脊索瘤患者治疗中的正式评估提供了强有力的依据。因此，一项针对欧洲晚期脊索瘤中阿法替尼的欧洲II期研究即将开始招募患者。
 
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