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PARP抑制剂和替莫唑胺的组合
  • 　　脊索瘤是一种罕见的骨衍生肿瘤，占所有原发性恶性骨肿瘤的1-4％，与预后不良有关。它起源于脊索残余并沿轴向骨架发生。脊索瘤具有良性特征，如生长缓慢，但也具有侵袭性局部侵袭和远处转移等侵袭性特征。因此，临床治疗是一种难以治愈的疾病，特别是因为肿瘤经常出现在关键的神经血管结构附近，如颅底和脊髓。
    　　由于不同的发病机制和疾病表现，脊索瘤的当前治疗选择是有限的。与次全切除和放射/化疗相比，完全根治性切除与最佳局部控制相关。然而，由于复杂的解剖位置或肿瘤扩散的程度，通常难以实现完全切除。当无法进行完整的手术切除时，放射治疗是一种常见的替代方法。光子，质子和更重的带电粒子疗法碳可延缓疾病进展。然而，尽管其他治疗方法取得了进展，但常规化学治疗对脊索瘤治疗的效果令人沮丧，这极大地限制了这种骨癌的治疗。考虑到常规化学治疗剂仅对脊索瘤细胞发挥适度的细胞毒性作用，化学增敏剂的鉴定已成为改善治疗的迫切需要。
    　　DNA修复的抑制剂是一类抑制内在修复机制的小分子化合物。在正常细胞如体细胞或干细胞中，DNA修复机制通过去除核碱基加合物和修复单链或双链DNA断裂来保护基因组与天然存在的基因毒物的完整性。然而，在转化的癌细胞中，经常利用DNA修复途径来减轻由辐射或化学疗法诱导的损伤。例如，聚ADP核糖聚合酶1（PARP）在碱基切除修复途径（BER）中起关键作用，可有效去除癌细胞中受损的核碱基。的证据许多线表明PARP1是用于向治疗癌细胞抗性重要，并且因此，确定响应率和疾病结果。常规化疗结合PARP抑制剂已转化和临床研究已日益研究了几种类型的人恶性肿瘤。在出国看病网的研究中，使用源自患者的脊索瘤细胞，研究人员揭示了PARPDNA修复途径在脊索瘤细胞治疗抗性中的核心作用。化学疗法诱导的DNA损伤被PARP/BER途径有效清除，防止DNA断裂和细胞死亡。结合FDA批准的PARP抑制剂奥拉帕尼，常规烷化剂替莫唑胺的治疗效果显着增强，DNA损伤，DNA片段化和细胞凋亡的显着增加证明了这一点。这种组合方案还有效地抑制了脊索瘤异种移植物的生长，伴随着细胞毒性的增加，这表明脊索瘤的临床治疗具有新的治疗方法。
    　　患者来源的脊索瘤细胞系，U-CH1，UM-CHOR1，和CH22，惠赠由脊索瘤基金会设置。人神经胶质瘤细胞系U251MG于2015年从Sigma购买。人神经胶质瘤细胞系U87MG于2015年从ATCC购买。细胞在补充有10％胎牛血清，青霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中生长，和链霉素。
    　　如前所述进行免疫荧光染色。将细胞在4％PFA中固定15分钟并用0.3％TritonX-100渗透。用一抗标记细胞，然后用荧光缀合的二抗标记细胞。在Zeiss780共聚焦显微镜中观察细胞。本研究中使用的一抗包括yH2A.X（CST，1：200）和BrdU（BDBiosciences，1：200）。
    　　根据制造商的方案，通过膜联蛋白V/PI流式细胞仪试剂盒分析细胞凋亡。简言之，收获细胞并与膜联蛋白V-FITC和PI的混合物在冰上孵育20分钟。通过FACSCantoII（BD）流式细胞仪分析细胞。
    　　根据制造商的方案使用CCK-8（Dojindo）测试细胞活力。将10微升CCK-8加入细胞培养基中并孵育2-3小时。通过Epoch酶标仪（BioTek）在OD450nm下测量CCK-8吸光度。
    　　在脊索瘤细胞系U-CH1和UM-Chor1中测量替莫唑胺（TMZ）或单独的奥拉帕尼及其组合的剂量-反应曲线。TMZ和奥拉帕尼以100：1的比例组合。处理细胞48小时，通过CCK-8测定法测量细胞活力。使用COMPUSYN软件计算组合指数（CI）以确定协同效应。
    　　将CH22和U-CH1细胞一式三份接种在96孔板中。在本研究中使用了177种化学探针（MedChemExpress），其靶向DNA修复相关途径中的关键元件。有关化合物及其目标的完整列表。用0.5uM浓度的每种探针（单一疗法）或包括单独探针和TMZ（100uM）的组合疗法处理细胞。如上所述，通过CCK-8测定，在初始处理后72小时研究细胞活力。通过生存力（单一疗法）/活力（组合疗法）确定化疗的增强。使用GraphPadPrism软件绘制数据。
    　　使用补充有蛋白酶抑制剂混合物（ThermoFisher）的RIPA裂解缓冲液从培养的细胞中提取蛋白质。将蛋白质样品在NuPAGE4-12％微型凝胶（ThermoFisher）上分离并转移至PVDF膜（Millipore）。用一抗探测膜，并使用HRP缀合的二抗和化学发光方法显现靶蛋白的表达。本研究中使用的一抗包括pADPR（Abcam，ab14459,1：2000），PARP1（Abcam，ab32138,1：2000），yH2A.X（Proteintech，10859-1-AP，1：1000）和β-肌动蛋白（Sigma，A5441,1：2000）。
    　　如前所述进行DNA片段化测试。使用DNeasyBloodandTissueKit（QIAGEN）根据制造商的手册从细胞中分离基因组DNA。在4-20％NovexTBE凝胶（ThermoFisher）上分辨500纳克DNA。用SYBRSafeDNA染料（ThermoFisher）染色凝胶，并使用Bio-RadChemiDoc成像系统显现。
    　　彗星试验如前所述进行。简而言之，收集细胞并重悬于熔融琼脂糖中。在碱性电泳缓冲液中以0.6V/cm分辨悬浮液30分钟。然后用SYBRSafe溶液标记基因组DNA，并在ZeissLSM710共聚焦显微镜下观察。使用彗星试验软件和GraphPadPrism测量尾矩。
    　　收获一百万个细胞并在-20℃下使用75％乙醇固定过夜。用RNaseA处理细胞，用碘化丙锭（ThermoFisher）探测DNA含量。通过FACSCantoII（BD）流式细胞仪分析细胞周期进展。
    　　为了评估细胞增殖，将BrdU（Sigma）以10uM的浓度直接添加到生长培养基中2-3小时。将细胞用4％PFA在室温下固定15分钟，并用0.3％TritonX-100透化。用2-NHCl和0.1-M硼酸钠处理后，用BrdU抗体（BDBiosciences）探测细胞。然后在ZeissLSM710共聚焦显微镜下观察细胞。
    　　将8周龄雌性NSG小鼠（JAXLab）注射到右侧，将800万U-CH1细胞重悬于100-uLPBS中。一旦肿瘤达到200mm3以上，将小鼠随机分成四组，并用（1）DMSO，（2）Ola，（3）TMZ或（4）Ola+TMZ处理。奥拉帕尼剂量为20mg/kg，腹膜内注射，总共24天。TMZ剂量为25mg/kg，po，2×5天循环。使用游标卡尺测量异种移植物尺寸。在研究结束时，处死小鼠，收获异种移植物用于称重和组织学分析。
    　　从福尔马林固定的石蜡包埋的组织样品制备五微米组织切片。将切片脱石蜡并进行热诱导的抗原修复。然后将切片与一抗在4℃温育过夜，接着与HRP偶联的二抗一起温育。使用VectastainABC试剂盒和DAB试剂盒（VectorLaboratories）使靶蛋白可视化。本研究中使用的一抗包括Ki67（Abcam，1：200），PCNA（SantaCruz，1：200），pADPR（Abcam，1：200），PARP1（Abcam，1：200）和yH2A.X（Proteintech，1：200）。
    使用DeadEnd比色TUNEL系统（Promega）按照制造商的方案进行TUNEL测定。使用DAB检测载玻片并使用苏木精复染。
    　　使用Student'st检验进行两组之间的统计。对于涉及两个以上组的分析，使用单向ANOVA测试处理数据。结果表示为平均值±SEM。甲p值<0.05被认为是统计学显著。使用GraphPadPrism软件（v7.01）进行所有分析。
    　　为了研究脊索瘤对治疗的抗性的分子基础，研究人员使用了三种源自患者的脊索瘤细胞系，即CH22，U-CH1和UM-Chor1。作为初步测试，研究人员评估了细胞对替莫唑胺（TMZ）的易感性，替莫唑胺是一种DNA烷化剂，通常用于治疗各种类型的恶性肿瘤。研究人员发现高剂量的TMZ（100uM）导致脊索瘤细胞DNA损伤最小。通过膜联蛋白V/PI凋亡分析证实TMZ治疗缺乏应答。TMZ导致胶质瘤衍生细胞如U251和U87发生显着的细胞凋亡，而在任何脊索瘤来源的细胞系中均未观察到明显的细胞死亡。研究人员用U251和U87细胞系鉴定了大量凋亡细胞，而使用相同疗法的脊索瘤细胞凋亡率小于10％。此外，细胞活力测定证明致死剂量（100或200uM）不会导致脊索瘤来源细胞的活力丧失。
    　　内在DNA修复途径在维持基因组完整性方面发挥着关键作用，而癌症细胞在面对放射性或化疗等基因毒性挑战时会利用这些途径。几个证据表明PARP/BER途径可以有效去除DNA核碱基加合物，防止DNA烷基化剂如TMZ，环磷酰胺和卡莫司汀介导的DNA损伤和细胞毒性。在本研究中，研究人员试图了解DNA修复途径是否是脊索瘤细胞显着的化学抗性的原因。首先，研究人员进行了化学筛选试验，涉及177种化学探针，靶向12种DNA修复相关途径。绘制数据以突出显示在CH22或U-CH1脊索瘤细胞中增强TMZ诱导的细胞毒性的候选化合物（倍数变化>2;p?<0.05）。在这些化合物中，PARP抑制剂如veliparib，rucaparib，olaparib和AZD-2461显着增强了TMZ介导的细胞毒性。为了验证这一发现，研究人员用TMZ处理研究了脊索瘤细胞中PARPDNA修复途径的功能。研究人员发现聚（ADP-核糖）聚合物（pADPR），其表明PARPDNA修复途径的激活，在CH22和U-CH1细胞中强烈表达。使用小干扰RNA抑制这些细胞系中的PARP1表达不仅消除了PARP1/pADPR表达，而且还增加了TMZ诱导的DNA损伤（通过yH2A.X信号的密度计分析计算为TMZ+siPARP1与TMZ;对于CH22，+41.4％;对于U-CH1，+85.9％）。值得注意的是，PARP1的异位表达可以挽救pADPR的减少和DNA损伤的增加一个）。为了进一步验证，研究人员使用彗星试验分析了脊索瘤细胞中的DNA片段化。研究人员发现TMZ不会在所有脊索瘤细胞中诱导DNA片段化。然而，用siRNA抑制PARP1表达导致这些细胞中DNA损伤的显着增加，如彗尾的出现和尾部时刻的增加所证明的。PARPDNA修复途径的重要作用不仅解释了脊索瘤细胞中对化学疗法的显着高抗性，而且还表明PARP抑制可能代表了这种类型癌症的新型致敏方法。
    　　PARP抑制剂是一组小分子抑制剂，由烟酰胺的结构模拟物发展而来。研究人员的初步研究结果表明，FDA测试的PARP抑制剂rucaparib和olaparib在两种测试的脊索瘤细胞系中与TMZ结合时表现出优异的致敏作用。因此，研究人员进一步评估了奥拉帕尼在脊索瘤细胞中的化学增敏作用。首先，研究人员分析了细胞周期的变化，并发现TMZ和olaparib的组合在所有三种脊索瘤细胞系中引起显着的G2/M阻滞，表明累积的DNA损伤可导致细胞周期停滞。此外，彗星试验显示，TMZ/olaparib导致脊索瘤细胞中片段化DNA的显着增加。与TMZ单一疗法相比，尾矩增加了74.8倍（CH22），32.1倍（U-CH1）和39.7倍（UM-Chor1）。yH2A.X染色也证实了DNA损伤的增加，其显示TMZ/奥拉帕尼处理的细胞中DNA损伤斑点的广泛积累。相反，TMZ或olaparib单一处理不会导致明显的DNA损伤斑点。因此，研究人员证实该组合可以消除pADPR/PARP表达，其伴随着所有脊索瘤细胞中yH2A.X表达的升高。最后，研究人员发现通过联合治疗抑制脊索瘤细胞扩增，如BrdU掺入所证明的。
    　　除了对DNA损伤积累和细胞周期停滞的影响外，研究人员还发现奥拉帕尼使脊索瘤细胞对化疗药物敏感，导致脊索瘤细胞的细胞毒性和细胞凋亡。当细胞接受延长的TMZ/奥拉帕尼治疗时，相差显微镜显示粘附细胞显着减少。因此，通过进行剂量-反应测定，当该药物与低剂量奥拉帕尼组合时，研究人员观察到显着增强的TMZ细胞毒性。对于U-CH1细胞，TMZIC50从851.6降至189.8uM，对于UM-Chor1细胞，IC50与2-uM奥拉帕尼合用时，从690.5降至198.6uM。此外，当在治疗中引入奥拉帕尼时，组合指数的计算显示出有效的协同效应（对于U-CH1，Fa=0.5，CI=0.21;对于UM-Chor1，Fa=0.5，CI=0.4。研究人员还证实，活细胞的损失是通过TMZ诱导的细胞凋亡，因为膜联蛋白V/PI分析显示凋亡细胞群体显着增加;具体而言，大于80％的脊索瘤细胞通过联合治疗进行细胞凋亡。
    　　为了确定PARP抑制剂是否可以改善化疗药物对脊索瘤的疗效，研究人员开发了如前所述的异种移植模型。将U-CH1细胞皮下注射到NSG小鼠中。当肿瘤质量达到200mm3时，将动物随机分配到四个治疗组中并接受治疗。研究人员发现TMZ/olaparib联合治疗显着改变了肿瘤的生长，肿瘤大小和体重显着减少就证明了这一点。此外，研究人员对来自每个治疗组的异种移植物进行了组织学分析。研究人员发现TMZ和olaparib单一疗法导致增殖标志物如Ki67和PCNA的表达略有下降。然而，根据先前观察到的细胞周期停滞，组合方案导致增殖标志物显着减少。此外，研究人员证明了olaparib治疗组中pADPR表达被广泛抑制。此外，结合这种方法与TMZ治疗，研究人员观察到细胞毒性标记物如yH2A.X和TUNEL的广泛增加。因此，通过这项体内研究，研究人员得出结论，TMZ/奥拉帕尼治疗通过增强的DNA损伤，细胞周期停滞和细胞毒性成功地减少了脊索瘤异种移植物的扩增。
    　　在本研究中，研究人员发现患者来源的肿瘤细胞概括了脊索瘤的疾病表型，强调了对治疗的抵抗和减少的DNA损伤积累。从机制上讲，PARP/BER途径在化疗衍生的DNA加合物的解毒作用中起关键作用，阻止细胞周期停滞和细胞死亡。将药理学PARP抑制剂与化学治疗剂组合显着增强脊索瘤细胞中的DNA损伤，其不仅抑制肿瘤细胞增殖并促进凋亡细胞死亡，而且还抑制体内脊索瘤异种移植物生长。因此，研究人员的研究结果突出了一种新的脊索瘤患者治疗方法，特别是当其他治疗方式已经用尽时。
    　　脊索瘤是骨衍生的肿瘤，对化学疗法具有高度抗性。根治性切除是治疗的最佳选择;然而，当癌症存在于复杂的解剖结构中和或表现出侵入性转移性特征时，该选择不适用。因此，提高化疗的疗效是改善疾病结果的关键。在本研究中，研究人员采用了三种源自患者的脊索瘤细胞系，这些细胞系被发现能够始终如一地概括出临床上对基因毒性治疗的抵抗力。从机理上讲，这种抗性可能部分是由于它们特有的缓慢生长，这使得有足够的时间激活内在的DNA修复机制来解毒DNA损伤。此外，研究人员注意到PARP/BER途径在脊索瘤细胞中具有高活性，可防止DNA损伤的累积并改善其相关后果。这些发现使研究人员探索了将PARP抑制剂与常规化学疗法相结合以克服化疗耐药性和改善脊索瘤治疗的可能性。
    为了鉴定可能的致敏剂，研究人员采用了基于已知治疗剂的非偏向化学库筛选，其靶向不同的DNA修复机制。例如，ATM/ATR途径被双链DNA断裂激活，导致H2A.X磷酸化和细胞周期停滞。RAD51是一种高度保守的蛋白质，有助于修复DNA双链断裂。RAD51表达已发现几种类型的人类恶性肿瘤待与化疗。在本研究中，研究人员使用TMZ作为遗传毒性剂并评估了与DNA修复酶抑制剂的协同效应。替莫唑胺是一种口服化疗药物，通过DNA烷基化或甲基化引入DNA损伤。研究人员最近的研究结果表明，TMZ和PARP抑制剂的组合在IDH1突变的神经胶质瘤和先进神经内分泌瘤取得优越的细胞毒性。类似地，最近的一些出版物还表明，TMZ可以是除胶质瘤其他侵袭性癌症有用。在筛选的化合物中，PARP抑制剂包含一组异常值，导致对TMZ处理的优异敏化。这些化合物已被证明是有效的具有内在的DNA修复缺陷恶性肿瘤，如BRCA1/2突变的卵巢癌或乳腺癌。PARP抑制剂作为化学增敏剂的应用尚未在临床中广泛应用，可能是由于与联合治疗相关的复杂性，例如确定最佳剂量和临床前模型。以前发现将PARP抑制剂与常规化学疗法相结合可以大大提高后者的疗效，从而能够以相对较低的剂量发挥肿瘤抑制作用。在本研究中，研究人员使用小干扰RNA或FDA批准的PARP抑制剂olaparib抑制PARP活性。在两者中，研究人员观察到更严重的DNA损伤和脊索瘤细胞的断裂。这与许多先前的研究一致，表明PARP与TMZ协同作用以实现改善的治疗效果。重要的是，研究人员的研究表明，使用TMZ/olaparib，累积的DNA损伤导致细胞毒性和细胞凋亡。
    　　为了指导未来的临床研究，研究人员使用U-CH1细胞开发了异种移植模型。与脊索瘤的临床表现一致，U-CH1异种移植物显示出对常规疗法的高抗性，如通过最小程度改变的肿瘤生长和DNA损伤的缓慢积累所证明的。将olaparib与化疗药物联合使用可成功改变疾病预后，肿瘤肿块扩大减少。此外，组织学分析证实联合治疗可提高治疗效果。增殖标志物如Ki67和PCNA的抑制与观察到的异种移植物生长抑制一致。相反，细胞毒性标记物如yH2A.X和TUNEL的增加证实了与TMZ/奥拉帕尼诱导的肿瘤抑制相关的增强的细胞毒性。重要的是，联合方案抑制了实验动物的脊索瘤扩张。这表明副作用的风险可能低于单药治疗的风险，单药治疗需要高剂量。因此，本研究提供了关于涉及PARP抑制剂和基因毒性疗法的新治疗方法的概念验证证据，其可以代表脊索瘤的未来化学治疗选择。
    　　本研究的局限性在于，在临床前动物模型中使用高剂量的TMZ（25mg/kg，po×5,2个循环）以实现细胞毒性和改善疾病结果。一个可能的原因是在本研究中，脊索瘤细胞系通常是化学抗性的。此外，研究人员在异种移植物完全建立时引入了治疗剂（200mm3）;因此，与肿瘤形成之前的治疗相比，TMZ/奥拉帕尼组合可能表现出更低的效力。鼓励未来的研究评估药物剂量的TMZ和PARP抑制剂是否可以在脊索瘤患者中获得临床益处。此外，探索更有效的基因毒物用于联合方案可以为脊索瘤化疗提供更好的解决方案。
 
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