出国看病
 
复发性脊索瘤中MTNR1B的下调
  • 　　在20个复发性脊索瘤和相应的原发性肿瘤组织中进行OCT4（一种脊索瘤CSC相关标记物）的苏木精和伊红（HE）和IHC分析，以确定CSC在脊索瘤复发中的作用。肿瘤细胞在脊索瘤复发均较初级脊索瘤，这被认为是一个CSC样属性的更多去分化。OCT4的表达显著复发脊索瘤上调。一个原发肿瘤和相应的复发肿瘤的mRNA阵列和基因集富集分析（GSEA）也显示肿瘤复发与CSC相关特征之间呈正相关一个。此外，有趣的是，研究人员发现G蛋白偶联受体（GPCR）信号传导和昼夜节律相关基因表达的表达都与脊索瘤复发相关，促使研究人员询问褪黑激素信号是否以及如何发生考虑到褪黑素受体是参与生物钟调节的重要GPCR，参与脊索瘤复发调节。
    　　 研究人员接下来检测了褪黑激素特异性膜受体MTNR1A和MTNR1B的表达。所述MTNR1AmRNA和蛋白水平显示在脊索瘤复发组织无明显改变。然而，在大多数脊索瘤患者中观察到与相应的原发性肿瘤相比，复发性肿瘤中MTNR1B的显着降低。一致地，降低MTNR1B蛋白水平和未改变的MTNR1A蛋白表达通过IHC。研究人员随后分析了褪黑激素受体表达与100名脊索瘤患者队列临床分期的相关性。为了支持研究人员的观察，研究人员发现，尽管在MTNR1A。此外，研究人员验证了MTNR1B在脊索瘤中的临床意义，正如预期的那样，Kaplan-Meier生存分析显示，携带低MTNR1B表达脊索瘤的患者具有更短的无复发生存期（RFS）时间以及更短的总生存期（OS）时间（中位无复发生存时间=25个月，中位总生存时间=79个月）比表达较高水平的MTNR1B（中位无复发生存时间=92个月，中位总生存时间>120个月）。在RFS时间或患者的高和低之间MTNR1AOS时间没有显著差异看出。这些发现表明MTNR1B的肿瘤抑制作用，而不是MTNR1A在脊索瘤中的作用。研究人员接下来通过qRT-PCR在20个复发肿瘤中检测到MTNR1BDNA水平，以研究MTNR1B下调的机制。损失MTNR1B在大多数复发肿瘤中检测到的DNA与相应的原发肿瘤，这是通过荧光原位杂交进一步确信。作为MTNR1BmRNA表达积极DNA水平相关，研究人员归因于MTNR1B的mRNA下调复发性脊索瘤，以损失MTNR1B。类似地，低MTNR1BDNA水平还表明较短RFS时间和OS时间。
    　　 值得注意的是，髓核和脊索瘤都被认为起源于脊索。为支持MTNR1B的肿瘤抑制的作用，研究人员发现，MTNR1B蛋白和mRNA水平在脊索瘤细胞系下调相比于人初级NP细胞。同时，在脊索瘤细胞系中没有观察到MTNR1A表达的类似现象。由于已报道CSC与肿瘤复发相关，研究人员询问MTNR1B是否通过参与CSC特性的调节来抑制脊索瘤进展。表达较低MTNR1B水平的脊索瘤细胞通常比具有较高MTNR1B水平的脊索瘤细胞表现出较少的干性，如球形成测定所证明的。在脊索瘤球体中检测比对应粘附nonsphere细胞。此外，通过流式细胞术分选在CD15（脊索瘤CSC相关标志物）阳性细胞脊索瘤MTNR1B表达较显著降低在CD15阴性脊索瘤细胞，这强烈表明MTNR1B在维护起到了抑制作用干燥。8接下来，研究人员构建了稳定的脊索瘤细胞系，其具有MTNR1B的异位表达或MTNR1B被敲除（MTNR1B-/-）。褪黑激素或MTNR1B特异性激动剂IIK7在具有MTNR1B过表达的UM-chor1和MUG-chor1细胞中显着抑制球形成能力和不依赖锚定的细胞生长。在相应的载体细胞中未观察到这种抑制。褪黑激素受体，luzindole和MTNR1B特定抑制剂的非特异性抑制剂，4P-PDOT，既反转引起的褪黑激素抑制。同时，当MTNR1B在UM-chor1和MUG-chor1细胞中过表达时，褪黑激素下调CSC标志物的表达和CD15阳性细胞的比例。耐药性是一种CSC相关特性，使顺铂在临床上不能抑制脊索瘤肿瘤的生长。然而，MTNR1B激活显着增加脊索瘤细胞对顺铂的易感性。这些结果表明MTNR1B介导褪黑激素诱导的脊索瘤干活性和活力的抑制。此外，在U-CH1和MUG-CC1中，具有相对高MTNR1B表达的脊索瘤细胞，褪黑激素和IIK7可以抑制干细胞特征和活力，如通过对顺铂的抗性降低，下调CSC标志物和减少CD15阳性细胞所证明的。群体，而MTNR1B敲除或MTNR1B拮抗剂逆转了这种抑制。在初级球形成测定和软琼脂集落形成测定中观察到类似的结果。在脊索瘤组织中检测到从100例MTNR1B，OCT4，SOX2和表达，并且两个OCT4和SOX2表达被发现与MTNR1B表达用褪黑激素或载体处理的U-CH1细胞用mRNA阵列和GSEA分析，肿瘤细胞在褪黑激素信号激活后显示出降低的CSC特性。一致地，肉瘤的大群组的GSEA和神经胶质瘤（中胚层起源的另一个常见的恶性肿瘤）（另一种中枢神经系统肿瘤）患者从TCGA数据集还表明，低MTNR1B表达与干性相关基因签名。此外，MTNR1A不参与调节褪黑激素介导的CSC特性，如MTNR1A的消耗不能消除由褪黑激素刺激诱导的CSC相关标志物表达的抑制这一事实所示。
    　　 为了确定MTNR1B是否能够抑制体内脊索瘤的恶性特性，研究人员通过皮下接种脊索瘤细胞检查了MTNR1B激活对免疫缺陷小鼠中人脊索瘤细胞的肿瘤发生能力的影响。褪黑激素治疗并未改变体内MUG-chor1细胞的肿瘤发生能力，其表达低MTNR1B，而异位表达MTNR1B的MUG-chor1细胞以及褪黑激素处理几乎不能生长成新的肿瘤。同时，注射MUG-chor1细胞并通过其过表达和褪黑激素刺激激活MTNR1B的小鼠与使用具有较低MTNR1B活性的肿瘤细胞异种移植的小鼠相比具有更长的无肿瘤存活时间。具有MTNR1B活化的皮下肿瘤通常小于没有MTNR1B活化的皮下肿瘤。同样，高表达MTNR1B的细胞MUG-CC1在用褪黑激素刺激后具有较弱的致瘤性和较长的无肿瘤存活时间，而4P-PDOT消除了褪黑激素的作用，进一步支持了MTNR1B激活在抑制脊索瘤肿瘤发生中的重要性。
    　　 为了探索MTNR1B介导的脊索瘤干性抑制的机制，在U-CH1细胞中使用CignalFinder10PathwayReporterArrays来鉴定响应褪黑激素和MTNR1B特异性拮抗剂的信号传导途径。褪黑激素刺激显着抑制Wnt/B-连环蛋白信号传导，并且该抑制被4P-PDOT逆转。GSEA还表明，B-连环蛋白信号传导的活化。研究人员进一步验证了褪黑激素介导的B-连环蛋白信号传导抑制。B，C在高MTNR1B表达细胞中，褪黑激素显着抑制TOP/FOP活性和B-catenin途径下游基因表达，而MTNR1B耗尽则逆转了这种情况。同时，在具有低MTNR1B表达的细胞中，过表达MTNR1B以及褪黑激素或IIK7处理导致B-连环蛋白信号传导活性显着降低，而4P-PDOT可逆转该抑制，进一步支持MTNR1B在褪黑激素介导的B-连环蛋白信号传导抑制中的关键作用。研究人员接下来询问MTNR1B激活是否通过影响B-连环蛋白核定位来调节B-连环蛋白信号传导。通过执行核提取物和Western印迹（WB）分析，研究人员观察到的褪黑激素有效地抑制B-catenin的公司进入细胞核，但4P-PDOT可以消除这些现象。然而，沉默MTNR1A表达并未消除褪黑激素诱导的TOP/FOP活性或B-连环蛋白核转位的抑制。鉴于B-连环蛋白和CREB结合蛋白（CBP）之间的相互作用导致B-连环蛋白乙酰化并激活干性相关基因的转录，并且研究人员上述数据显示MTNR1B激活导致脊索瘤CSC特性的抑制，研究人员想知道MTNR1B激活是否可能通过影响CBP/B-连环蛋白复合物来调节B-连环蛋白转录。褪黑激素诱导的MTNR1B激活减弱CBP/B连环蛋白相互作用和4P-PDOT完全逆转此。
    　　 为了确定MTNR1B是否在临床上负调节B-连环蛋白信号传导，研究人员在脊索瘤标本中进行了qRT-PCR测定和卡方检验。具有低表达MTNR1B肿瘤通常表达高水平的B-catenin信号下游基因。从TCGA数据库肉瘤和神经胶质瘤的患者的大组群的GSEA还表明，低MTNR1B表达B-连环蛋白信号传导的活化相关。IHC测定在小鼠皮下肿瘤标本进行，并且结果也显示MTNR1B的激活和B-catenin信号。
    　　 研究人员接下来探讨了MTNR1B激活诱导的B-连环蛋白信号传导抑制是否介导对脊索瘤CSC特性的抑制。在脊索瘤肿瘤球检测更高核B连环蛋白的表达相比，亲代细胞系。B连环蛋白信号传导活性和CSC性质之间的正相关性也被确定通过GSEA在肉瘤患者Kaplan-Meier分析表明，脊索瘤患者轴承具有过度B-catenin信号肿瘤通常具有较短的无复发存活时间。此外，复发性脊索瘤通常表现出较高的B-连环蛋白信号传导活性以及CSC标志物与相应的原发性肿瘤相比，如IHC所示。研究人员还发现，ICG-001，以破坏CBP/B连环蛋白结合的化合物，在废除CSC性质MTNR1B的抑制介导的增加。
    　　 这些结果共同表明MTNR1B激活通过抑制B-连环蛋白信号传导活性来抑制脊索瘤恶性。
    　　 出国看病的研究人员进一步探索了MTNR1B介导的B-连环蛋白信号传导抑制的详细机制。MTNR1B活化对B-连环蛋白蛋白质的产生没有影响，表明在翻译后修饰的调节中起作用。B-连环蛋白的磷酸化和乙酰化修饰对其稳定性和转录活性至关重要。褪黑激素和IIK7处理均导致B-cateninS33和S37磷酸化增加，Y86，Y333和Y654磷酸化以及K49乙酰化降低，而4P-PDOT消除了这些作用，进一步表明MTNR1B激活调节B-catenin翻译后的修改。没有观察到B-连环蛋白Y142和S552磷酸化的改变。鉴于SRC直接磷酸化B-catenin的Y86/Y333/Y654，促进B-catenin的的转录活性，研究人员问MTNR1B激活是否调节B-catenin的依赖SRC的方式。有趣的是，PP2抑制SRC激酶活性挽救了MTNR1B抑制介导的B-连环蛋白Y86，Y333和Y654磷酸化;B-连环蛋白核转位;和TOP/FOP活动。据报道，p-Y654导致E-钙粘蛋白/B-连环蛋白复合物的解离，并且p-Y86抑制AXIN2对B-连环蛋白的识别。支承地，MTNR1B抑制确实诱导E-钙粘蛋白/B连环蛋白复合物解离，这可以通过SRC激酶活性的抑制来取消。类似地，PP2颠倒AXIN2/B连环蛋白相互作用的抑制MTNR1B诱导抑制。同时，为了支持p-Y333促进B-连环蛋白转录活性的观点，研究人员发现MTNR1B抑制增加了B-连环蛋白与CBP和TCF4的结合，而SRC抑制完全消除了这种效应。这些观察结果表明MTNR1B激活通过抑制SRC活性来抑制B-连环蛋白信号传导。
    　　 为了确定MTNR1B诱导的SRC抑制的机制，研究人员首先进行免疫沉淀（IP）和质谱（MS）以鉴定响应褪黑激素的MTNR1B结合蛋白。发现Gai2在刺激褪黑激素时与MTNR1B相互作用。G蛋白是GPCR的主要下游转导物，包括MTNR1A和MTNR1B。其中已报道被MTNR1A结合在293T细胞中的伙伴的G蛋白，Gai2主要与MTNR1B在脊索瘤细胞相互作用而很少Gai1，Gai3，或Gq蛋白通过MTNR1B。然而，MTNR1A可以在脊索瘤细胞中募集Gai1，Gai2，Gai3和Gq。要么Gai2耗尽或由百日咳毒素（PTX）可以逆转B-catenin信号的褪黑激素诱导阻遏，表明B-catenin信号的褪黑激素诱导的抑制活性抑制依赖于Gai2功能。鉴于MTNR1B对B-连环蛋白磷酸化和乙酰化的调节，研究人员询问Gai2是否介导褪黑激素诱导的相应激酶活性的改变。Gai2可以响应褪黑激素与SRC相互作用，MTNR1B抑制可以逆转它，而GSK3B或CBP与Gai2对褪黑激素的反应没有相互作用。这样的相互作用的特异性通过使用SRC-纯化的蛋白修饰的肽下拉测定法，随后通过免疫印迹测定法。研究人员进一步确定了Gai2诱导的SRC抑制的机制。负调节SRC激酶活性的F，p-Y530在响应褪黑激素治疗时显着上调，而MTNR1B或Gai2的抑制消除了这种增强。在SRCp-Y419中观察到相反的作用，其正调节SRC激酶活性和B-连环蛋白Y86，Y333和Y654的磷酸化。此外，Gai2Q205L（活化突变体）和Gai2G204A（显性失活突变体）进一步用于验证Gai2在调节SRC激酶活性中的作用。Gai2连续激活导致SRCp-Y530增加，SRCp-Y419减少和TOP/FOP活性降低，而灭活Gai2的异位表达对SRC激酶活性或B-连环蛋白信号传导没有特别影响。MTNR1B激活介导的Gai2激活和激活突变的Gai2导致CSK和SRC的募集，而MTNR1B或Gai2的抑制可以逆转这种情况。因此，研究人员推测活化的Gai2募集CSK是SRC抑制的原因，因为据报道CSK介导SRCY530磷酸化并抑制SRC激酶活性。此外，研究人员验证了Gai2介导的SRCY530磷酸化在B-连环蛋白信号调节中的重要性，因为活化的Gai2可以逆转野生型SRC诱导的TOP/FOP活性的增强，但不能逆转SRCY530F突变体诱导的活性。为了支持上述的结果，研究人员观察到增加的SRCP-Y530和在从MUG-CC1细胞与激活MTNR1B。可以看到在MTNR1B激活或MTNR1B丢失的情况下提出的信号级联模型。综合研究人员的所有数据，研究人员假设MTNR1B损失导致脊索瘤细胞增加，具有CSC样特性，这促进了脊索瘤的恶性表型，并且这些脊索瘤CSCs在治疗后存活并最终介导肿瘤复发。
    　　 研究人员进一步验证了MTNR1B的临床意义。如上所述，研究人员发现MTNR1B激活可通过抑制B-连环蛋白信号传导来增加脊索瘤细胞对化疗的敏感性。研究人员想知道褪黑激素激活MTNR1B是否会增加化疗药物在体内杀死脊索瘤细胞的能力。用褪黑激素和顺铂的组合处理的MUG-CC1-荧光素酶细胞形成的皮下肿瘤被显着抑制并且仍然比用单独的褪黑激素或顺铂处理的那些小得多。然而，在表达低MTNR1B的MUG-chor1-荧光素酶细胞中，褪黑激素和顺铂的组合具有与单独顺铂相似的作用。有趣的是，顺铂与ICG-001或达沙替尼（一种靶向SRC激酶活性的酪氨酸酶抑制剂）的组合对脊索瘤肿瘤发生具有最大的抑制作用。这些体内现象进一步支持了褪黑素/MTNR1B/Gai2/SRC/B-catenin收敛在增加脊索瘤对化疗的易感性中的重要作用。因此，研究人员假设MTNR1B不仅可以用作脊索瘤患者和治疗靶标的预后预测因子，而且可以是化学疗法与褪黑激素或小分子靶向药物的未来临床组合应用的生物标记指示物。
 
出国看病概况

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　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
出国看病适应症
靶向药物
 

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