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胶质母细胞瘤的间充质亚型
  • 　　胶质母细胞瘤被称为脑肿瘤的最常见和恶性形式，在形态和遗传学上均表现出异质性。目前GBM的标准治疗方法是广泛的外科手术切除，然后进行辅助放疗和化疗。然而，大多数GBM中会在短时间内重现，并成为对治疗耐受由于肿瘤的异质。成人GBM样品已经使用基于全局转录概况和DNA甲基化分析GBM归类为几个不同的亚型：原神经，古典或增殖和MES。研究人员发现，标准的治疗方案诱导转换在从原神经到的Mes肿瘤表达。为了改善临床结果，迫切需要进行旨在鉴定控制MesGBM进程的分子决定因素和可以预防进程的新型治疗靶标的研究。转化生长因子-B信号通路已与多种生物学环境相关，包括增殖，上皮向间充质转化和凋亡。先前的研究已经提供证据，表明活化的TGFB信号通路驱动肿瘤生长。例如与TGFB签名相关的配体和受体存在于异常高水平在MES肿瘤微环境和胶质瘤干细胞。SMAD是TGFB家族成员的关键细胞内核效应子。TGFB家族受体的配体诱导的激活具有固有的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的触发受体调节的Smads的磷酸化，而Smad2和Smad3由TGFB磷酸化，并且转位入细胞核。研究表明，TGFB和p-SMAD3在GBM组织中过表达，但在正常脑组织中未检测到进一步表明TGFB有助于GBM的发展。
    　　 矮子相关的转录因子1，也称为AML1，调节造血干细胞向成熟血细胞的分化。涉及RUNX1基因的染色体易位与几种类型的白血病，包括急性髓性白血病的M2亚型相关。在中枢神经系统肿瘤中RUNX1已与GBM的Mes状态相关联，RUNX1保持肿瘤的起始能力和肿瘤细胞侵入正常组织的能力。对特定上下文的监管网络的研究表明，RUNX1控制Mes签名的表达，并与GBM的不良预后有关。生化分析证实，RUNX1通过microRNA介导的相互作用调节已确立的肿瘤起始和Mes亚型驱动力。此外RUNX1表达与小胶质细胞的增殖和活化相关联，并且它激活背根神经节细胞亚群的神经元分化。RUNX1，RUNX2和RUNX3是Runt家族的成员，拥有亚核靶向信号和SMAD相互作用域。但是，RUNX1在Mes进展中的功能作用尚未完全表征。在这项研究中，首先表明RUNX1在MesGBM中充当主调节器。作为转录调节因子，RUNX1通过以TGFB途径依赖性方式显着影响癌基因和抑癌基因的表达来促进MesGBM的恶性进展。
    　　 众所周知，大多数肿瘤中都存在基因突变和异质性。为了调查RUNX1是否在肿瘤组织中发生突变，检查TCGA癌的基因组变化，并在所研究的神经胶质瘤中未发现RUNX1突变。然后，选择手术切除的肿瘤标本，将其切成六部分：上，下，左，右，前和后，以研究神经胶质瘤的异质性。与内部肿瘤相比，外部肿瘤具有更多具有正常特征的神经胶质细胞，因此标本的每个部分都包含肿瘤的内部和外部。为了进一步考虑GBM的异质性，选择两名患者的肿瘤组织进行组织学分析和转录组测序，其中包括来自患者TBD0207的前，后，左和顶部肿瘤样本以及来自患者TBD0220的前，左和上肿瘤样本。与TBD0207B相比，TBD0220L表现出更高的肿瘤细胞向正常组织的浸润和浸润性蛋白毫米P9的更高表达。HE和免疫组织化学染色。形态学结果表明，TBD0220L表现出更明显的Mes型侵袭性特征。接下来，通过RNA-seq测试了样品的分子类型，发现TBD0220L表达了更高水平的Mes分子标记，而TBD0207B表达了更高水平的proneural分子标记。培养TBD0220L肿瘤组织以获得稳定传代的GBM细胞系，然后对四个细胞系进行测序。结果显示，TBD0220L和N9细胞系表现出Mes细胞类型特征，U251细胞表现出前神经元亚型的特征，而N33与经典亚型最相似。基因组富集分析用于基于测序分析组织和细胞的分子表型，表明TBD0220L，TBD0220C和N9表现出VerhaakMes表型，而TBD0207B和U251表现出VerhaakProneural亚型，与RNA测序的结果。选择Mes和Proneural亚型的标记基因进行标准化，然后发现，在样品和细胞系中，标记基因的表达比通过TCGA分类的样品更高或更接近的表达。同时，Verhaak分型分子标记基因的相关性分析，发现TBD0220L，TBD0220C和N9彼此之间显示出显着的正相关，而与U251，N33和TBD0207B之间具有显着的负相关。
    　　 接下来，免疫组织化学染色显示RUNX1的表达从正常脑组织逐渐增加至TBD0207B和TBD0220L，并且RUNX1主要在细胞核中表达。此外，N9和TBD0220C细胞系表达的RUNX1水平高于N33和U251细胞系。因此，RUNX1表达与MesGBM高度相关。proneural，神经，经典和Mes亚型由基于鲁棒的基因表达的GBM分子分类来描述。因此，从CGGA和TCGA队列的患者中获得了613个GBM样本。在Mes亚型中，RUNX1mRNA的表达水平明显高于其他亚型。将MesGBM患者与其他患者分开的RUNX1的接收器操作特征曲线在CGGA和TCGA数据库中显示出高灵敏度。此外，当根据RUNX1mRNA表达水平从低到高对每个标本进行排名时，GSEA揭示RUNX1表达与代表VerhaakMes亚型的特征呈正相关。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，RUNX1水平升高的患者生存不良。RUNX1高表达与恶性程度增加呈正相关。此外，分析RUNX1家族成员RUNX2和RUNX3，它们也是恶性肿瘤的标志物，但发现它们与Mes亚型无关，并且在区分该亚型时不那么敏感。
    　　 发现TGFB信号传导途径在Mes肿瘤发展中是必不可少的。为了研究GBM中TGFB信号通路的分子功能，进行免疫印迹分析TBD0220C，N33，N9和U251细胞系中SMAD2和SMAD3的磷酸化状态。发现Mes细胞系表现出高度的TGFB途径激活。通过使用字符串蛋白质-蛋白质网络，出国看病网服务机构发现了可能与RUNX1相关的5种蛋白质，然后进行免疫共沉淀分析证实了体内的结合关系。为了进一步验证TGFB途径与RUNX1之间的关系，进行IP实验，通过建立不同的时间点来探索蛋白质结合能力的变化，以通过TGFB蛋白或LY2109761来搅动或抑制TGFB途径。U251和N9细胞系中TGFB途径的表达。通过用特异性抗体沉淀相应的蛋白质，出国看病网服务机构发现TGFB途径的激活可以促进RUNX1对p-SMAD3/SMAD3和SUV39H1蛋白的募集，而抑制TGFB途径可以削弱相互作用。通过共聚焦显微镜的IF还显示，活化的TGFB途径将这三种蛋白诱导到细胞核中的其他亚细胞位置。另外，从全细胞的角度来看，TGFB途径的激活促进了RUNX1和SUV39H1的核易位。Co-IP实验和免疫荧光分析表明p-SMAD3和SUV39H1蛋白也相互结合。
    　　 为了进一步探索RUNX1的靶基因，将从TBD0220L获得的患者源肿瘤异种移植GBM组织移植到裸鼠的大脑中。然后，用DMSO或LY2109761治疗这些小鼠15天，并取出肿瘤进行RNA测序。在16749个差异表达基因中，对照组和LY2109761处理组之间有1407个显着差异表达，包括574个上调基因和833个下调基因为1）。在TCGA和CGGA数据集中鉴定RUNX1相关基因。RUNX1和p-SMAD3是促进肿瘤进展和EMT关键基因。但是，与SUV39H1相关的RUNX1通过增加H3K9me3结合来抑制转录。为了鉴定以RUNX1/p-SMAD3为靶标的基因，搜索与RUNX1正相关且被LY2109761下调的基因中的重叠。相反，以RUNX1/SUV39H1为靶标的基因被定义为与RUNX1负相关并被LY2109761上调的基因。使用聚类模式显示用DMSO和LY2109761处理的小鼠之间差异表达的前42个编码基因，以及与RUNX1表达显着相关的前200个基因。说明在这两组中差异表达的基因的独特转录谱，重叠的基因。出国看病网服务机构对这些基因进行相关分析，发现某些基因彼此呈正相关，而所有这些基因与MXI1呈负相关在Mes患者样本中。此外，在TCGA和CGGA数据集中，Mes亚型中BCL3，COL3A1，MGP和POSTN的mRNA表达水平明显高于其他亚型，而MXI1的表达水平为Mes亚型的水平较低。获得TCGA和CGGA数据的Kaplan–Meier生存曲线，发现高水平的BCL3，COL3A1，MGP和POSTN导致更差的预后，而更高水平的MXI1与更好的预后相关。使用GO富集分析进行功能注释，以研究生物学作用，并分析与RUNX1正相关的前200个基因。与基因相关的最显着富集的过程是细胞粘附，细胞外基质组织和细胞外基质-受体相互作用。
    　　 接下来，研究RUNX1与这些靶基因之间的调控机制。设计RUNX1过表达和敲低慢病毒构建体，并通过实时定量PCR和Westernblot分析进行了鉴定。然后，通过qPCR和蛋白质印迹测定法检测BCL3，COL3A1，MGP和POSTN的mRNA和蛋白质表达水平。RUNX1的耗竭会降低N9细胞中这些基因的表达，而当RUNX1在U251细胞中过表达时，情况正好相反。通过PROMO和TransFac程序分析，出国看病网服务机构发现RUNX1是其启动子的潜在转录因子。出国看病网服务机构分配AP-该值基于原始序列排名之间的对应关系，并找到了RUNX1结合序列和转录起点上游的假定结合位点密码子转录因子绑定站点。然后，进行ChIP-PCR分析，以研究RUNX1与HEK293T细胞中靶基因启动子之间的关系。发现具有RUNX1结合位点但这些基因的RUNX1阴性基因组区域的启动子片段被抗RUNX1抗体有效富集。还采用荧光素酶报告基因检测法来验证靶向序列的正确性。克隆野生型或突变体结合序列并将其插入萤光素酶报道载体-PGL4.1。结果表明在U251细胞中，RUNX1的过表达显着增强野生型报告基因的荧光素酶活性，但突变报告基因却没有，而shRUNX1处理导致带有野生型报告基因的N9细胞的荧光素酶活性降低，但不适用于突变报告基因。由于这些靶基因受RUNX1和TGFB途径调控，因此用TGFB蛋白处理RUNX1减低的N9细胞，并用LY2109761处理RUNX1过表达的U251细胞。发现通过TGFB蛋白处理可以挽救这些基因的减少变化，反之亦然。为了进一步研究该机制，通过siRNA敲低了SMAD3，发现p-SMAD3，BCL3，MGP和POSTN的表达降低了。通过UCSC中的ENCODETF数据集搜索p-SMAD3的推定结合位点，发现BCL3和MGP的启动子具有结合基序。ChIP-PCR分析证实，抗p-SMAD3抗体可有效富集BCL3和MGP的靶序列。
    　　 此外，N9细胞中TGFB途径的抑制降低了这两个基因启动子区域的RUNX1和p-SMAD3的富集，而TGFB途径的激活增加了U251细胞系中DNA片段的富集。为了检测p-SMAD3和RUNX1的蛋白质结合位点是否是DNA结合区，出国看病网服务机构突变它们的DNA结合域。IP实验证实它们仍然彼此结合，表明这两种蛋白质的结合区域是各自的非DNA结合域。还证明它们的结合不影响DNA的转录调控。以上这些结果表明，BCL3和MGP受RUNX1和p-SMAD3以TGFB途径依赖性方式调节。RUNX1的表达与MXI1负相关。SUV39H1是一种组蛋白甲基转移酶，与RUNX1结合使用。QPCR和westernblot分析表明，降低RUNX1和SUV39H1可以增加MXI1的表达，而添加的TGFB蛋白可以逆转这种作用。在具有过表达RUNX1和SUV39H1或LY2109761的U251细胞中获得了相反的结果。H3K9me3与转录沉默有关。RUNX1和SUV39H1的耗竭降低H3K9的三甲基化程度和TGFB蛋白处理可以挽救H3K9me3的水平。利用H3K9me3抑制剂处理细胞，发现H3K9me3的下调和MXI1的上调。因此为了确定H3K9me3在MXI1启动子上的功能性作用，进行ChIP分析和qPCR分析，以检测特异性结合。分析GSE103408远端启动子中的MXI1启动子区域。结果表明，H3K9me3在MXI1的启动子区域富集。在N9细胞中，RUNX1的下调降低H3K9me3与MXI1启动子的结合，而TGFB蛋白逆转了这种抑制作用。此外当用LV-RUNX1和LY2109761处理U251细胞时，观察到相同的现象。这些结果表明RUNX1/SUV39H1通过TGFB途径与H3K9me3相互作用，导致MXI1沉默。自然TGFB途径直接影响靶基因的表达。
    　　 为了阐明RUNX1的体外功能，分别将shRUNX1或LV-RUNX1转染到N9或U251GBM细胞中以评估其变化，并验证它们的作用是否可以被TGFB蛋白或LY2109761逆转。在伤口愈合和Transwell分析中研究了对运动性的影响。结果表明RUNX1以TGFB途径依赖性方式增加了迁移和侵袭。为了进一步探索RUNX1的功能，进行CCK8测定和细胞粘附测定，结果表明RUNX1的过表达和TGFB途径的激活增强了GBM细胞的增殖和粘附。免疫荧光结果表明，敲低RUNX1会导致F-肌动蛋白在N9细胞中丢失。出国看病网服务机构使用小鼠PDX模型来验证出国看病网服务机构先前的体内发现。评估RUNX1和TGFB/RUNX1轴对肿瘤生长的影响，并通过生物发光分析检测了肿瘤的生长。与对照治疗的肿瘤相比，shRUNX1治疗的肿瘤体积明显较小。LV-RUNX1处理的小鼠表现出相反的作用。TGFB活化增强肿瘤的增殖能力，而TGFB失活则抑制了肿瘤的增殖能力。通过裸鼠的生存分析，发现TGFB和RUNX1都是不良的预后因素。RUNX1和p-SMAD3的IHC分析证实病毒转染是有效的，并且TGFB途径受到调节。使用IHC比较5组中靶基因的表达水平。shRUNX1慢病毒可降低BCL3和MGP的表达水平，TGFB蛋白可挽救BCL3和MGP的表达，而LV-RUNX1慢病毒可降低MXI1的表达水平，而LY2109761则可逆转这种效应。为了预测肿瘤的侵袭性，出国看病网服务机构检测相应肿瘤切片中毫米P9的表达。shRUNX1慢病毒治疗削弱了MesGBM的侵袭能力，TGFB蛋白治疗挽救了它的侵袭能力。LY2109761也直接削弱了MesGBM的侵袭能力。
    　　 GBM是最恶性的神经胶质瘤类型。诊断后，尽管使用了积极的外科手术，放射线和化学疗法，但平均寿命为14个月。在四种分子亚型中，Mes表型与最高程度的攻击性和治疗耐药性相关，因此，其生存率最差。更糟糕的是，研究人员发现耐多药疗法的神经胶质瘤细胞具有Mes特性。未在分类中包括神经亚型，因为该亚型是由于原始样品被非肿瘤细胞污染而引起的。但是TCGA和CGGA仍包括此类型。这种分析没有影响出国看病网服务机构的实验过程或结果的可靠性。在血液和免疫系统中，巨核细胞的成熟和包括T细胞和B细胞在内的细胞分化需要AML-1。假设在MesGBM中，特别是在癌症干细胞中，RUNX1的过度表达可能导致肿瘤细胞过度分化，从而增加其攻击和扩散能力。通过分析TCGA和CGGA中的数据，发现RUNX1在Mes类型中比在其他子类型中表达更高。数据表明RUNX1可用作MesGBM的分子标记。尽管RUNX2和RUNX3也是神经胶质瘤的恶性预测因子，但它们在区分Mes类型方面的特异性较差。结果使出国看病网服务机构可以将RUNX1定义为MesGBM驱动程序。此外，用于预防癌症的分子工具可以基于天然或合成试剂的使用，这些试剂会中断主要驱动因素或关键的错位或这些驱动因子起作用或发生错位的环境31。因此，认为RUNX1可以用作分子疗法的候选靶标。
    　　 TGFB信号传导的诱导也是GBM的Mes亚型的潜在特征。蛋白质印迹表明，Mes细胞系具有高度的TGFB途径活化作用。此外，RUNX1可以单独工作或作为与其它蛋白，以促进或块形成复合物的RNA的募集聚合酶特异性基因。当在String蛋白网络中结合这两个发现时，证实RUNX1与p-SMAD3/SUV39H1的相互作用及其整合程度受TGFB调节。P-SMAD3也可以直接与BCL3和MGP的启动子或编码区结合以激活其转录。TGFB信号通过RUNX1/SUV39H1介导的H3K9me3修饰降低MXI1的表达。
    　　 在其靶蛋白中，BCL3作为转录共激活因子，通过与NF-κB同型二聚体的结合而激活。NF-κB途径激活被整合到Mes信号网络中，与主转录因子有关，并促进GBM中的Mes分化。MGP在GBM中充当促进迁移的Mes组件。作为入侵刺激器和E厘米组分，MGPunderlies与间充质基因表达谱GBM中的预后不良。MXI1负调控c-Myc家族成员，而c-Myc激活转录并刺激细胞增殖。对下游靶标的搜索和验证显示，RUNX1在MesGBM的恶性进展中起主要作用，通过MGP影响细胞外基质的形成，并增强肿瘤细胞侵入正常组织的能力。BCL3蛋白的表达通过NF-κB途径改变了肿瘤细胞的转录组和表观遗传学特征，并通过诱导细胞因子的分泌改变肿瘤的微环境。最后，抑制MXI1通过降低与c-Myc的拮抗作用来加速细胞周期转变。总之研究表明RUNX1在MesGBM中高度表达，因此是潜在的治疗靶标。基因测试方法对于确定肿瘤组织是否高表达RUNX1和相应的下游基因可能是可行的，这与实验验证结果一致：在阳性情况下靶向RUNX1可能是合适的治疗选择。现在正在寻求在不久的将来对RUNX1抑制剂进行临床前研究。Galunisertib是一种TGFB受体1激酶抑制剂，目前正在II期随机试验中进行测试，该试验涉及复发性GBM的患者。由TGF-B途径抑制剂和RUNX1抑制剂组成的联合治疗也可能代表有希望的前景。
 
出国看病概况

海外医疗在国外发展较为成熟，比如在欧美等医疗技术发达国家，很多医院都设有国际病人办公室并配备多语种医学专业翻译人员，就医流程和模式都已相对成熟。在国内，海外医疗虽然还属于新兴行业，但发展势头迅猛，发展潜力巨大，市场前景广阔。
　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
出国看病适应症
靶向药物
 

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