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高抗肿瘤树突状细胞疫苗的功效
  • 　　抗原呈递细胞，例如树突状细胞，在激活针对病原体的适应性免疫应答中起关键作用。DC可以通过专门的途径有效刺激T细胞，并针对特定抗原激活T细胞。该机制导致有效的免疫反应，可用于治疗传统抗药性肿瘤，例如成胶质细胞瘤。DC疫苗是一种新颖的和通用的治疗方法，并且该策略已被FDA批准用于前列腺癌的治疗。由于DC疫苗的多功能性，目前正在研究将它们用于耐药性恶性肿瘤）中。I/II期临床试验在GBM患者表现出可行性以及创建和选择病例递送DC疫苗以及强大的抗肿瘤免疫应答的安全。DC疫苗的功效已显示与分娩后DC转移至淋巴结的效率密切相关。
    　　 研究小组证明，通过与破伤风类毒素同时接种而使DC迁移增加的GBM患者具有显着更大的抗肿瘤免疫反应并改善了生存率。因此，改善免疫细胞迁移的方法具有使细胞免疫治疗策略更有效的潜力。在寻找在体内追踪DC的代谢物时，开始使用肌氨酸进行实验，以标记DC以使用MRI追踪体内细胞。选择肌氨酸是因为它是天然存在的且无毒，在脑和淋巴结组织中低表达，并且可以商购。在实验过程中，观察到肌氨酸处理过的DC似乎改善了迁移。因此开始探索在直流疫苗接种过程中使用肌氨酸作为佐剂及其对抗肿瘤功效的影响。这些研究的目的是在治疗颅内肿瘤模型的皮内DC疫苗的背景下，表征肌氨酸对DC功能和迁移的影响。
    　　 肌氨酸98％购自Sigma-Aldrich。将肌氨酸以20毫米的浓度溶于T细胞或DC培养基中，并通过0.22um低蛋白结合性Durapore膜制备无菌溶液。用来自Sigma-Aldrich的肌氨酸测定试剂盒评估细胞内肌氨酸浓度，该试剂盒通过在570nm处的比色观察来检测肌氨酸的浓度。从不同组的培养基中收集DC，并与试剂盒中提供的肌氨酸测定缓冲液，肌氨酸探针和肌氨酸酶混合物混合。制备肌氨酸标准样品。遵循制造商的说明，将样品在黑暗环境中的平板中于37°C孵育60分钟。从C57BL小鼠的长骨和胸骨中收获骨髓，小鼠购自杰克逊实验室。在获得佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会的批准后，启动了所有动物项目和规程。在包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白介素4的DC完全培养基中培养源自骨髓的细胞。将细胞在六个孔板中培养6天。在第7天，将细胞重新铺板在60毫米皿中，并在第8天用OVA-mRNA电穿孔DC。在第9天，将DC收集在磷酸盐缓冲液中进行给药。DC疫苗通过腹股沟内皮内注射递送。
    　　 五名健康捐献者的全血是从生命南血库购买的。通过将血液单核细胞与IL-4，GM-CSF，TNF-a，IL-1B和IL-6一起温育来产生人DC。先前已经描述了该方法。pp65RNA是由BillBritt博士捐赠的全长cDNA产生并转染的。从PMEL或OT-IT转基因小鼠中收获脾脏。将它们切成薄片并通过细胞过滤器。用裂解液除去红细胞。丢弃上清液，并将脾细胞沉淀以3×107细胞/50ulPBS重悬，用于静脉内输注。将来自不同组的DC转移到包括上下腔室的CorningCostarTranswell板中。上腔室中有100ul培养基中的细胞，没有细胞因子和血清。下腔室包含500ul具有血清，CCL19，CCL21和CXCL3的培养基。5小时后将上腔室移出，并在血细胞计数器上计数迁移到下腔室中的细胞。在体外迁移实验中，在用小鼠抗CXCR2进行迁移测定之前，通过处理细胞一小时抑制了CXCR2的活性。对于体内应用，根据制造商的说明将SB225002溶解在溶媒中。SB225002在50微克在每只动物200ul的前一小时每个DC疫苗注射注入到小鼠腹腔。在人类DC体外迁移实验中，在迁移研究之前，将细胞以SB225002以10uM的浓度处理1小时。
    　　 对于颅内肿瘤模型，将GL261-Gp100肿瘤细胞悬液制备为2×105细胞，分别为PBS和甲基纤维素的1：1混合物，每个大脑的总体积为2.5ul。将肿瘤细胞立体定向植入颅内空间。注射针位于右2毫米，矢状-bregma交叉点上方1-3毫米。一旦将针头插入3-4毫米的大脑，在1分钟内注射2.5ul准备好的细胞混合物。用骨头覆盖注射部位。肿瘤植入后一天，皮内注射第一个GP100-RNA脉冲DC疫苗，48小时后3×107静脉注射PMEL脾细胞。然后，治疗组每5天皮内接种第二和第三批GP100-RNA脉冲DC疫苗。跟踪动物进行生存分析，并在达到终点时对其实施安乐死。对于侧面模型，B16F10-OVA细胞在Dulbeccos改良的Eagles培养基中生长，并将细胞以每100mlPBS1×106细胞的浓度皮下接种到C57BL小鼠的侧面。在第一次注射DC疫苗之前将荷瘤小鼠随机分组。肿瘤植入后第8天，静脉注射3×107OT-1脾细胞，并向皮内注射第一种OVA-RNA脉冲DC疫苗。肿瘤植入后第10天，每2天在侧翼部位测量肿瘤大小。在第12天和第16天，小鼠接受了OVA-RNA脉冲DC疫苗的第二和第三疫苗。通过以下公式以立方毫米计算肿瘤体积。当肿瘤生长超过任何尺寸两厘米或在肿瘤侧发生溃疡时，对动物实施安乐死。线性模型被用来分析每只动物的肿瘤体积和时间的相关性。
    　　 在腹股沟区域进行皮内注射之前，立即用PKH26对DC进行染色。接种DC疫苗后48小时，收集脾脏或腹股沟淋巴结，并立即将其包埋在最佳切割温度化合物中，然后在装有液氮的室内冷冻。通过HM505E低温恒温器将样品切成6微米厚，并转移到载玻片上进行免疫荧光显微镜分析。在室温下用PBS洗涤的载玻片，通过将切片与2％兔血清一起孵育来封闭非特异性位点，用于封闭组织切片中的非特异性位点。将荧光团缀合的抗体添加到切片中，并在4°C下孵育过夜。为了评估体内迁移，将来自表达绿色荧光蛋白的转基因小鼠的骨髓DC注入皮内野生型C57BL小鼠。收集排泄的腹股沟淋巴结，进行消化，、并准备单细胞悬液以计数表达GFP的细胞，并对每个样品中的绝对细胞计数进行定量。
    　　 为了进行免疫反应分析，在接种疫苗后7天后从接种的小鼠中收获脾脏。裂解RBC，然后将脾细胞转移到含有10％FCS，1％L-谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中。将2×106细胞转移到圆底96孔板中的每个孔中。将细胞以500g离心5分钟。将细胞重悬于染色缓冲液中，并在黑暗环境中于室温下用不同的结合抗体染色15分钟。用可染黄色的活/死细胞染色细胞，然后用BDBioscience提供的抗CD3，抗CD4，抗CD8，抗CD25和OT-1四聚体，然后在室温下用2％多聚甲醛固定5分钟。为了评估细胞表型，使用上述方法制备了肌氨酸处理的DC细胞和未处理的DC细胞。然后，用来自BDBioscience的抗CD11c，抗MHCII类，抗CD80和抗CD86在单独的孔中对鼠DC细胞进行染色。用来自BDBioscience的抗CD11c，抗CD86和抗HLA-DR2对人单核细胞衍生的DC进行染色。BDLSR流式细胞仪和FlowJo软件用于所有流式细胞仪分析。
    　　 通过RNeasyMiniKit从鼠髓样DC中提取RNA。对提取的RNA进行反转录后，将cDNA用于基因表达分析。使用PrimePCRSelections96孔阵列板评估小鼠细胞因子，趋化因子和趋化因子受体的基因组表达。PrimePCR选择使用Bio-Rad逆转录PCR机分析96孔阵列板。牵涉到nCounter小鼠骨髓免疫细胞谱分析小组，通过NanoString技术分析基因表达。使用RNeasy试剂盒从肌氨酸处理过的鼠髓样DC提取的DC和对照DC提取总RNA。使用nSolver软件进行数据分析，并通过暗示阳性，阴性对照探针和管家基因对数据进行标准化。为了评估细胞内的氧化应激水平，使用上述方法制备肌氨酸处理的和未处理的小鼠BM-DC。在第7天收集DC，不进行任何电穿孔，并用温PBS洗涤。将细胞重构为1.5×105细胞/孔。然后将厘米-H2DCFDA染料添加到10uM的细胞中，并根据制造商的协议将其在37°C孵育60分钟。然后将细胞用温暖的PBS洗涤3次，并返回到预热的生长培养基中，并在37°C孵育10分钟。在荧光板读数器上在激发：495/发射：527nm下测量细胞板。对于阴性对照，检查未染色的细胞以扣除自身荧光。对于阳性对照，将细胞用100uM的叔丁基氢过氧化物处理。基于Z评分评估荧光强度。/阴性对照样品中表达的标准偏差）。
    　　 如上所述产生肌氨酸处理的和未处理的鼠BM-DC。将细胞与2千克每毫升FITC-OVA在37°C下孵育90分钟。然后将细胞用PBS洗涤3次，并用PE-抗CD11c染色。FITC-OVA摄取被评估为CD11c+人群中的平均荧光强度。通过将细胞在2千克每毫升OVA-FITC中于0°C孵育90分钟来定量FITC的非特异性信号。从OT-1小鼠分离CD8+T细胞。将CD8+T细胞以1×105/200ul/孔重构到96孔板中，并用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯标记。如上所述产生和制备鼠BM-DC，并用OVA-mRNA电穿孔。标记的CD8+T细胞与肌氨酸处理过的和未处理过的BM-DC在2.5×104共培养细胞/200ul/孔。细胞在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中培养。将非电穿孔的BM-DC与CD8+T细胞共培养作为阴性对照。三天后，通过分析CD3+/CD8+群体中的CFSE稀释液，通过流式细胞术对细胞和T细胞的增殖进行定量。GraphPadPrism7软件用于所有统计分析。使用单因素方差分析对多组研究进行统计学分析，并使用曼惠特尼或t检验对两组进行比较。两种方法使用ANOVA进行肿瘤体积和体重分析。使用Log-rank检验分析中位生存期。未配对的t检验方法用于流式细胞仪数据。当p值<0.05时，数据被认为具有统计学意义。显着性水平经由星号表示包括p>0.05未显著，p<0.05，p≤0.01和p<0.001。
    　　 为了确定肌氨酸在改善DC迁移中的作用，首先旨在优化肌氨酸的细胞内浓度并研究其对细胞表型的影响。将DC细胞以各种浓度的肌氨酸培养或用肌氨酸电穿孔。收集细胞并使用色谱分析法测量肌氨酸。当细胞在20毫米的肌氨酸中培养时，细胞内的肌氨酸浓度增加至1.17pg/细胞。随着肌氨酸或电穿孔浓度的增加，该值没有增加。此外当细胞在24小时内从含有肌氨酸的培养基中移出细胞后，细胞内肌氨酸恢复到控制水平。因此，肌氨酸只能在DC内短暂增加，不需要用肌氨酸电穿孔。使用流式细胞仪评估肌氨酸对细胞表型的影响。所有组在含有肌氨酸的DC培养基中培养48小时。肌氨酸处理没有导致细胞死亡或CD11c的变化，MHC-II，CD80和CD86的表达与对照相比的DC。肌氨酸对DC迁移的影响使用跨孔迁移测定法进行测试，该方法使用趋化因子评估体外DC迁移。腔室的一侧装有CCL19/21，DC装有样品以评估其趋化因子的迁移。用肌氨酸在20毫米下处理DC24小时，并用OVA-RNA电穿孔以进行DC成熟。与对照组相比，单独使用CCL19/21或单独使用肌氨酸的DC迁移增加。当DCs用肌氨酸处理和趋化因子被添加到其它腔室中，DC迁移甚至更有效地比任何肌氨酸装载单独或趋化因子单独。
    　　 接下来，将骨髓来源的DC用于测试体内迁移。C57BL小鼠通过腹股沟内皮内注射接受DC疫苗。疫苗接种后48小时，收集引流淋巴结和脾脏进行流式细胞术和免疫荧光显微镜检查。经流式细胞仪检测，经肌氨酸处理的DC迁移至引流淋巴结的能力显着增加。这是使用免疫荧光。皮下注射后48小时，脾脏中也可见到这些DC。DC的其他功能也在肌氨酸治疗中进行测试。通过将细胞与FITC-OVA共培养，在肌氨酸处理过的DC中测量抗原吸收。肌氨酸导致抗原吸收减少。但是，使用T细胞增殖测定法测量的抗原呈递不受肌氨酸处理的影响。DC迁移至淋巴结的增加先前已显示可增加适应性免疫反应。为了测试肌氨酸处理的DC是否增加T细胞增殖，对未肿瘤的小鼠进行OT-1T细胞输注，然后用未经处理的OVA-RNA脉冲DC或肌氨酸处理的OVA-RNA脉冲DC接种DC。与对照DC疫苗接种的动物相比，用肌氨酸处理的DC疫苗接种增加CD8T细胞的百分比。另外，观察到抗原特异性OT-1T细胞百分比增加。Treg的百分比为控制和肌氨酸处理DC组。
    　　 B16F10-OVA黑色素瘤侧翼模型用于测试肌氨酸DC对肿瘤生长的影响。肿瘤植入后，动物在肿瘤注射后10天接受抗原特异性OT-1脾细胞和DC疫苗的注射，注射或不注射肌氨酸。与接受非肌氨酸治疗的DC疫苗的动物相比，经肌氨酸治疗的DC治疗的动物随着时间的推移肿瘤生长显着减慢。肿瘤植入后的第二十六天，对照组的平均肿瘤体积为1491毫米3，经DC处理的小鼠的平均肿瘤体积为905毫米3，经肌氨酸处理的DC处理的小鼠的平均肿瘤体积为338.8毫米3。用肌氨酸治疗的DC治疗未产生毒性。肌氨酸治疗的B16F10-OVA肿瘤细胞也与肿瘤生长或侵袭的增加无关。通过分离从小鼠肌氨酸处理过的DC中提取的RNA来分析基因组表达，以进一步了解肌氨酸诱导的细胞迁移的机制。使用RT-PCR分析细胞因子和趋化因子受体基因的表达。出国看病网服务机构测试了趋化因子受体，发现了几个明显的上调。下调受体包括FASL，厘米TM2a，CXCR4在肌氨酸处理的DC中。为了进一步分析肌氨酸增加DC迁移的机制，在肌氨酸培养后，从骨髓来源的DC中分离出RNA。进行Nanostring分析。肌氨酸处理的DC具有CXCR2和CXCL3的显着上调。进一步的代谢分析表明，环氧合酶1和Pik3cg也被上调。基于这些发现，加上其他关键途径缺乏上调，推测肌氨酸作用的机制是通过减少甘氨酸导致细胞内氧化应激和导致Cox1升高，导致CXC趋化因子信号上调。
    　　 发现CXCR2在基因组分析中被上调最多，变化超过10倍。因此，使用CXCR2中和抗体，使用跨孔迁移测定法评估DC的迁移。当将CXCR2中和抗体添加到培养基中时，肌氨酸处理过的DC中迁移的增加被消除。接下来，评估CXCR2阻断对抗肿瘤功效的影响。植入了B16F10-OVA黑色素瘤肿瘤。动物接受带有或不带有肌氨酸的抗原特异性OT-1脾细胞和DC疫苗的输注。在每次注射DC疫苗前一小时，一些动物还接受CXCR2中和抗体。与接受非肌氨酸治疗的DC和接受CXCR2中和抗体治疗的肌氨酸治疗的DC相比，肌氨酸治疗的DC治疗的动物随着时间的推移肿瘤生长显着减慢。平均肿瘤体积肿瘤植入34天后为2926毫米3为对照，1756毫米3为DC处理的小鼠，930.7毫米3为处理DC肌氨酸处理的小鼠中，1778毫米3对于肌氨酸治疗的DC加上抗CXCR2治疗的小鼠，3111毫米3对于抗CXCR2治疗的小鼠。为了进一步评估CXCR2在相关颅内肿瘤模型中的作用，通过颅内注射将GL261-GP100肿瘤细胞植入小鼠体内。动物接受抗原特异性的PMEL脾细胞和DC疫苗。一组在每次注射DC疫苗前一小时接受CXCR2中和抗体。与接受非肌氨酸治疗的DC和经CXCR2中和抗体治疗的肌氨酸治疗的DC相比，接受肌氨酸处理的DC治疗的动物的存活时间显着延长。平均存活时间为24.5用于控制，DC处理的小鼠中作为处理过的DC肌氨酸处理的小鼠中，为肌氨酸处理的DC加抗CXCR2处理的小鼠。
    　　 然后在人DC中测试了肌氨酸诱导的迁移的发现。以不同浓度的肌氨酸培养人PBMC衍生的DC。收集人DC，并使用色谱分析法测量肌氨酸的细胞内浓度。当细胞在20毫米的肌氨酸中培养时，细胞内的肌氨酸浓度增加至0.4pg/细胞。此外，当细胞在24小时内从含有肌氨酸的培养基中移出细胞后，细胞内肌氨酸恢复到控制水平。像鼠细胞一样，肌氨酸水平只能在DC内短暂增加。像鼠类DC一样，肌钙蛋白治疗也不会导致人DC中的HLA-DR2，CD11c和CD86表达与对照DC发生变化。此外，肌氨酸处理过的人DC表现出跨孔迁移显着增加，这通过添加CXCR2中和抗体而被废除了。
    　　 DC疫苗是用于治疗抗药性肿瘤如GBM的通用且潜在有效的疗法。相I和DC疫苗GBM的II研究已经证明，以诱导在患者有力的适应性免疫应答的能力。目前正在进行一项针对新诊断的GBM的厘米Vpp65RNADC疫苗的II期临床试验，在该病中部分患者表现出对治疗的强大免疫学和放射学反应。数据表明，DC疫苗的功效可以通过有效的DC迁移来预测。因此，肌氨酸诱导的迁移具有极大地影响DC疫苗向患者有效治疗平台的转化的潜力。将肌氨酸添加到DC中后，DC疫苗对于颅内肿瘤模型具有生存优势。现有鼠研究中只示出一个存活益处时的DC给出之前肿瘤植入或作为IP注射给予。在研究中，使用肌氨酸获得的增加的DC迁移将原本无效的平台转化为具有生存获益的疗法。研究是首次利用肌氨酸增加免疫细胞的迁移来增强免疫疗法。用于增加DC迁移的肌氨酸剂量本身不会引起肿瘤侵袭或生长。此外数据表明，肌氨酸处理过的DC保留了呈递抗原和诱导T细胞增殖的能力。
    　　 肌氨酸增强迁移的机制取决于CXCR2的上调。尽管CXCR2是人类免疫细胞中迁移的已知调节剂，但DC中CXCR2上调的发现是一个新颖的发现。人类树突状细胞表达包括CXCR1和CXCR2在内的IL-8受体，IL-8可以通过其受体吸引树突状细胞。未成熟DC中的CXCR2表达水平通常高于成熟DC。此外，DC可分泌IL-8和CCL5，MIP-1a，和MCP-3趋化因子对于其CXCR2是受体，指向用于DC迁移CXCR2的可能自分泌函数。已经表明阻断CXCR2使肌氨酸诱导的DC迁移无效。已知肌氨酸与甘氨酸竞争细胞膜上的1型甘氨酸转运蛋白受体，因此减少了细胞内甘氨酸。这减小导致氧化应激。这种压力很可能导致花生四烯酸和Cox1的增加。Cox1上调的CXC趋化因子家族从而增加细胞迁移。总体而言，肌氨酸是一种无毒化合物，可增加DC迁移，从而在用肌氨酸治疗的DC疫苗治疗的肿瘤模型中改善预后。肌氨酸对人DC具有相似的作用。因此，该策略可以轻松地转化为用于基于DC的免疫疗法治疗癌症的临床方案。需要进行转化研究，以进一步评估肌氨酸治疗的DC疫苗策略在治疗脑肿瘤中的功效。肌氨酸通过CXC趋化因子途径增加鼠类和人DC的迁移。DC迁移的这种增加还导致颅内和腹侧鼠肿瘤模型中更强大的抗肿瘤免疫反应和更好的肿瘤控制以及更长的生存期。肌氨酸对鼠类和人类DC无毒。为了确定该治疗平台的实用性，有必要在人类受试者中进行进一步研究。
 
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