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替莫唑胺诱导的自噬并促进胶质母细胞瘤细胞凋亡
  • 　　胶质母细胞瘤是成人中最常见和致命的原发性成人脑肿瘤，诊断后中位生存时间约为15个月。诸如肿瘤异质性，侵袭性和血脑屏障之类的众多因素使得在不损害健康脑组织的情况下治疗该疾病极具挑战性。目前，正在进行研究以鉴定将新的疗法或新方法运送到肿瘤部位的方法，但自2005年实施Stupp方案以来，进展甚微，这仅对总体存活率提供了中等收益。因此，重点已放在确定增强替莫唑胺，口服烷基化剂或放射疗法来延长患者生存期的功效的机制上。GBM边缘的细胞具有高度侵袭性和迁移性，从而阻止了在标准治疗之前对肿瘤进行彻底的手术切除。然后，其余的细胞被RT和伴随的TMZ方案靶向。RT和TMZ都是高效的DNA破坏剂，但是最近的研究表明，其余的迁移细胞对这些疗法表现出一定程度的抵抗力。最终，在该治疗方案中存活的细胞形成复发性肿瘤。目前，尚无有效的治疗方法可用于复发性GBM延长总体生存期，患者通常在约8个月后死于该疾病。值得注意的是，TMZ诱导的DNA甲基化会诱导DNA损伤反应，最近被认为与细胞应激途径的诱导有关，例如巨自噬。自噬是一个重大的分解代谢过程，是负责降解细胞货物过大或丰富的蛋白酶体。靶向降解的货物被隔离形成自噬体结构。这些包含货物的双膜自噬体然后与溶酶体融合，形成自溶体，并在降解处发生。内部成分降解并完成自噬通量后，自溶酶分解，所得细胞成分释放到细胞质中，通过合成代谢过程进行再循环。
    　　 已经显示来自多种肿瘤类型的癌细胞具有高度的基础自噬，其被用作细胞存活机制。当细胞缺乏营养时，膜中受体酪氨酸激酶所致的生长因子诱导的信号传导就被切断了。PI3K/AKT/mTOR轴是一条中央信号通路，由于生长因子刺激而被激活，而I类PI3K的激活则作为自噬的负调节剂。当PI3K/AKT/mTOR轴不活跃时，释放自噬形成的抑制作用，自噬体生物发生通过以ULK1复合体开始的信号级联反应开始。由于养分有限，自噬被启动，从而为肿瘤细胞提供了生长优势。然而有报道说表明，III类PI3KVPS34形成与BECN1和PIK3R4的蛋白质复合物，以产生磷脂酰肌醇3-磷酸盐，这是所必需的起始和自体吞噬的进展。通常PI3K/mTOR的双重抑制剂被认为是自噬激活剂，因为同时抑制了I类PI3K和mTOR。有证据表明，其中的某些双重抑制剂如dactolisib和PI-103可以抑制癌细胞中的自噬通量通过抑制III类PI3K。此外，自噬也是一种应激反应途径，化学疗法对细胞的损伤也已激活了这一过程。先前的研究已经确定，PI3K/AKT/mTOR轴在GBM中过度活跃，并与增强的增殖，化学抗性和抑制的凋亡相关。PI3K抑制剂已显示出针对GBM的有希望的临床前潜力，然而，尚无一种可以进入临床。此外，鉴定可使神经胶质瘤细胞对TMZ作用敏感的化合物将在临床上引起广泛关注。在这里提供TMZ诱导自噬通量的证据，并确定PX-866是自噬体形成的早期阻滞剂。鉴于这些发现，出国看病网研究人员主张结合使用PX-866来阻断TMZ诱导的自噬并增加GBM细胞死亡。
    　　 人T98G胶质瘤细胞购自美国典型培养物保藏中心，并保存在补充有10％胎牛血清的Dulbecco改良基本培养基中。U373vIII细胞维持在补充有10％无四环素的FBS的DMEM中，并且之前已有描述。所有细胞均在37°C，5％二氧化碳下生长。亲本GBMPDX系源自原发性或复发性肿瘤切除术，并且先前已有描述。可以在MayoClinicBrainPDX国家资源门户网站上找到这些父母GBMPDX模型的全面描述。通过用递增剂量的TMZ治疗皮下父母GBM异种移植物来产生TMZ抗性系。将所得的TMZ抗性系是完全抵抗一个挑战为120mg/kg/天×5天如先前所述。对于涉及蛋白质印迹分析的实验，将细胞接种在6孔板中，并使其粘附过夜。然后在指定的时间点用指定的药物和相应的载体作为对照处理细胞。裂解时，将细胞用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的冰冷PBS洗涤一次。然后用含有1mM苯基甲基磺酰氟的1x放射免疫沉淀测定缓冲液裂解细胞。超声处理裂解液，并以牛血清白蛋白为标准，使用BCA分析试剂盒测定总蛋白浓度。每孔上样蛋白质量相等，并使用SDS-PAGE解析。使用Biorad快速转移系统将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，然后用Odyssey封闭液封闭1小时。OdysseyCLx近红外蛋白质印迹检测系统用于检测蛋白质条带。使用ImageStudioLite5.2版软件进行光密度测定分析。
    　　 从CellSignalingTechnology购买的以下一级抗体包括：PARP，MGMT，磷酸化AKT，AKT和GAPDH。抗LC3的抗体购自Sigma，抗p62的抗体购自Abnova[，克隆2C11]，抗α-Tubulin的抗体购自Millipore。将一抗在含0.2％Tween20的Odyssey封闭缓冲液中稀释，并在4°C轻轻摇动下孵育过夜。也将IRDye800CW二抗在含有0.2％Tween20的Odyssey封闭缓冲液中稀释，并在室温下轻轻摇动孵育1小时。纳入该分析的患者仅限于具有MGMT临床状态可用性的临时TCGA微阵列数据集。通过过滤患者临床信息表中的“样本类型”列选择主要GBM。在GBM微阵列数据集中，鉴定出190个未甲基化的MGMT和156个MGMT甲基化的样品。基因表达数据以归一化的z分数表示，其反映了远离参考群体中平均表达的标准差的数量。然后进行基因组变异分析以确定PI3K-AKT信号传导途径的基因组富集得分。从分子标记数据库下载了PI3K-AKT基因集，并对其进行了修改以包括其他经典靶标。应用对数转换，并遵循GSVA中基因表达数据的默认参数设置。使用学生t检验检验MGMT未甲基化和甲基化组之间通路活性差异的统计显着性。使用R3.5.0软件生成所有数字并进行统计测试。P值＜0.05被认为是显着的。
    　　 为了确定在涉及TMZ的处理后细胞的凋亡状态，使用裂解的PARP作为标志物。在完成处理时间之后，如上所述从培养基中收集漂浮细胞并收集贴壁细胞。合并每种处理的裂解液，并准备进行西方分析。通过SDS-PAGE解析总细胞裂解物，并用识别总PARP和裂解PARP的PARP抗体探测膜。确定TMZ处理后单独或与其他处理组合使用的细胞存活率，使用了集落形成测定法。简而言之，用所示的处理将T98G或U373vIII细胞处理24小时。用胰蛋白酶消化剩余的细胞，并以每孔1500个细胞的密度一式三份地铺板到6孔板中。在用6％戊二醛溶液固定之前，允许菌落生长。然后将固定的细胞用0.5％的结晶紫溶液染色，并用去离子水洗涤3次。仅计数由大于等于50个细胞组成的菌落。使用学生的t检验和P确定统计显着性小于0.05的值被认为具有统计学意义。
    　　 先前的研究表明，TMZ处理对各种GBM细胞系的自噬都有影响。出国看病网研究人员的研究使用T98G细胞系来确认TMZ对自噬的影响。用TMZ处理48小时诱导了LC3II蛋白表达的剂量依赖性增加，表明自噬被激活。为了验证TMZ诱导的自噬通量，测量了p62的蛋白质水平，p62是注定要被自噬降解的货物的受体，并且在自噬诱导时自身会降解。经TMZ处理后，p62蛋白水平也相应降低。为了进一步确认对自噬的作用是诱导而不是抑制了基础自噬，如先前报道的那样进行了LC3通量测定。将T98G细胞用媒介物或TMZ处理48小时，有或没有晚期自噬抑制剂Bafilomycin。用TMZ和的Baf处理的细胞显示相较于单独的Baf治疗的LC3II表达LC3II的高表达，确认由TMZ生产自噬体的超过48小时中。而且，当单独用TMZ处理时，p62水平降低，但是当用Baf或Baf加TMZ处理时，p62水平累积，这证实p62没有由于抑制自噬完成而被降解。寻求通过利用来自接受TMZ媒介物或剂量递增方案的小鼠的皮下GBM-PDX肿瘤样品来评估TMZ对体内自噬的作用。裂解物是从动物身上收获的肿瘤中产生的，并进行了西方分析。相对自噬体数量通过TMZ抗性基团亲TMZ敏感之间LC3II的表达和用于初次GBM-PDX肿瘤样品。在多个GBM-PDX模型中，TMZ处理组显示出比亲本组更高的LC3-II表达，这可能表明自噬体数目增加。光密度分析表明6出来的9TMZ治疗的肿瘤中显示的稳态1.5倍或LC3II表达更高的增加。
    　　 O6-甲基鸟嘌呤-甲基转移酶是GBM患者的重要预后指标。因为MGMT高表达的患者显示对TMZ耐药，所以出国看病网研究人员检查了GBM临床样品中MGMT表达与其他促成生存途径之间是否存在相关性。GBM-PDX肿瘤裂解物的蛋白质印迹显示肿瘤样品之间MGMT的差异表达，这与所有原发性GBM-PDX肿瘤样品中PI3K-AKT轴的激活相关，但与复发性GBM-PDX不相关。基于所述GBM5样品，相对于AKT活化和MGMT表达与它显示低的pAKT和低MGMT表达中。接下来通过探索具有基因组和临床资料的大规模患者样品的TCGAGBM队列进一步表征这种相关性。将具有可用MGMT启动子甲基化状态和基因表达数据的患者样本用于查询PI3K-AKT途径的活性。与MGMT甲基化病例相比，未甲基化MGMT的原发性GBM患者的PI3K-AKT活性在统计学上显着更高。鉴于在原发性GBM中经常报道过PI3K通路的过度激活，因此决定探究pan-PI3K抑制剂PX-866的信号传导后果，因为它以前在临床上用于复发性GBM。用增加剂量的PX-866剂量依赖性地抑制AKT的磷酸化，但也增加了二者LC3I和LC3II的表达，这表明一个晚期自噬阻断剂。此外，p62蛋白随着PX-866的处理而增加。然后，出国看病网研究人员使用3-MA确定PX-866与Baf之间是否存在功能相似性。与单独使用PX-866相比，与PX-866共同处理3-MA能够抑制LC3I和II的积累，而与Baf相比，将3-MA与Baf共同处理显示LC3蛋白水平没有改变单独，表明PX-866不是晚期抑制剂等的Baf中。为了进一步探索该机制，使用早期和晚期时间点进行了LC3通量测定。在4小时的时间点，单独使用PX-866以及与Baf结合使用都可以引起LC3I的积累和LC3II的减少。与单独使用Baf相比，在24h时，与Baf结合使用的PX-866降低了LC3II水平。数据提供PX-866是自噬体形成的早期抑制剂的证据，从而阻止了LC3I向LC3II的转化。
    　　 TMZ诱导的自噬可以潜在地促进GBM细胞的存活，但也可能代表治疗上的脆弱性。公认的是，溶血同向性化合物抑制自噬可增强常规化学疗法的功效。考虑到PX-866抑制自噬，着手确定向TMZ中添加PX-866是否可以增强T98G细胞的凋亡。与单独的TMZ相比，在TMZ中添加剂量增加的PX-866持续48h对PARP的切割没有影响，PARP是凋亡的传统标志物，但确实显示了对LC3I和LC3II的诱导和p62蛋白质水平，表明自噬受阻。在U373vIII细胞中证实了这一观察结果，由于存在组成性活性的EGFRvIII受体，其具有较高的PI3K途径激活作用。先用TMZ处理24小时，然后再添加PX-86624小时，即可在T98G和U373vIII细胞中以剂量依赖的方式诱导PARP的裂解，同时持续诱导LC3I和LC3II蛋白水平。因此与单独的TMZ相比，T98G和U373vIII细胞在与TMZ和PX-866共同处理后均表现出形成菌落的能力下降。与TMZ和PX-866相比，在TMZ中添加Baf对菌落形成有更明显的影响，这可能表明溶血同质性抑制剂由于与抑制启动相比具有抑制自噬晚期的作用，因此可能更有效。在本报告中，提供了针对GBM使用新治疗策略的机械证据。与单独的TMZ相比，TMZ已显示出诱导自噬通量，并且PX-866对TMZ介导的自噬的抑制增加了细胞凋亡，并显着降低了GBM细胞形成菌落的能力。
    　　 自2005年以来，TMZ一直是GBM的主要化疗药物，可通过DNA烷基化有效对抗高度增殖的细胞。已显示TMZ可激活自噬途径，但几乎没有证据表明它是如何发生的。DNA损伤反应的感应最近已与自噬和其它细胞程序的激活相关的，以减轻压力，促进存活。应激反应程序，如折叠蛋白反应，可以在自噬的诱导中发挥作用，可能通过的自噬的关键基因的转录激活。自噬抑制剂氯喹已显示出作为化学增敏剂的临床前希望，可以增强TMZ的作用。与单独的标准治疗相比，在放射线和TMZ中添加CQ被证明对新诊断的GBM具有临床疗效，但是这种组合的疗效受到与CQ相关的剂量限制性毒性的限制。在研究中提供PX-866阻断T98G细胞中自噬成熟的证据，并将其鉴定为自噬抑制剂。PX-866是一种不可逆的pan-PI3K抑制剂，能够穿透BBB，并且先前已证明在小鼠GBM侧腹异种移植模型中可将肿瘤的生长降至最低。已经报道PX-866在GBM细胞中不诱导凋亡，但是在体外显着降低VEGF的表达和GBM细胞的侵袭。
    　　 多个基因组改变在GBM中赋予PI3K-AKT-mTOR信号过度活跃。EGFR的扩增，EGFRvIII的表达，PTEN的缺失以及PIK3CA中的突变代表了GBM中大部分驱动程序突变，这些突变在AKT-mTOR信号轴上收敛。尽管有大量的信号转导效应因子可用于潜在的治疗干预，但没有靶向该途径的化合物进入临床治疗GBM。对于复发性GBM患者，使用PX-866进行了II期临床试验。作为单一疗法，PX-866在整体生存率方面没有优势。其他分子，例如PI3K和mTOR双重抑制剂BEZ235，已显示出针对GBM的有希望的临床前证据，但是BEZ235的BBB穿透性差，并且是强自噬诱导剂，可能使细胞实现自噬依赖性存活。有证据支持这一事实，即自噬诱导可促进GBM细胞存活，并且可能是适应性化学抗性的关键机制。靶向PI3K/AKT/mTOR轴的大多数药物均抑制1类PI3K，由于其对mTOR的抑制作用，可促进自噬。使用PX-866的发现显示出对自噬的阻断作用，可能是通过抑制III类PI3K来实现的，这有助于控制自噬体的生物发生。了解某些GBM细胞系或PDX模型中存在的不同类型PI3K酶的表达和活性可能有助于最终确定某些抑制剂对自噬的总体作用。因此，这可能会导致识别GBM中的治疗漏洞，并提供一种可翻译的方法来创建合理的药物组合来治疗GBM。
    　　 新诊断为GBM的患者，无论其MGMT的表达状态如何，都将在手术切除肿瘤后始终接受放射治疗和TMZ的标准护理。在MGMT高表达的情况下，这些患者对TMZ的反应较差，但如果开始了解对TMZ具有固有抗性的肿瘤的其他特征，这也可能为易于重新利用的药物提供新的治疗组合。PI3K途径激活与MGMT启动子甲基化状态之间的相关性可能是使用PI3K抑制剂治疗具有固有TMZ耐药性的患者的早期见识。从而，出国看病网研究人员已经确定，先用TMZ治疗，再加入pan-PI3K抑制剂PX-866，可促进神经胶质瘤细胞死亡。证据表明TMZ诱导的自噬是延迟反应，因此提供了机会以PX-866顺序靶向该细胞存活机制。了解MGMT状态与GBM中关键生存途径的相对激活之间的相关性，可以为将来治疗新诊断的GBM的更个性化的方法提供与治疗相关的识别方法。
 
出国看病概况

海外医疗在国外发展较为成熟，比如在欧美等医疗技术发达国家，很多医院都设有国际病人办公室并配备多语种医学专业翻译人员，就医流程和模式都已相对成熟。在国内，海外医疗虽然还属于新兴行业，但发展势头迅猛，发展潜力巨大，市场前景广阔。
　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
出国看病适应症
靶向药物
 

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