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肿瘤对糖酵解的高需求诊断
  • 　　2-脱氧-2-氟-D-葡萄糖正电子发射断层扫描已经被广泛地应用于各种癌症的由于肿瘤对糖酵解的高需求诊断。FDG作为葡萄糖类似物，通过葡萄糖转运蛋白转运到细胞中，然后可以被己糖激酶磷酸化。FDG-6-磷酸酯以终末代谢产物的形式积累在细胞内，而没有从细胞中排出，但并未沿糖酵解途径继续下去。但是，[18F]FDG-6P可以被葡萄糖-6-磷酸酶去磷酸化为FDG，然后可以从细胞中流出。因此，癌细胞中FDG的摄取和流出与葡萄糖代谢相关蛋白的表达和活性有关。高FDG的积累已经在许多人类肿瘤中过表达的葡萄糖transporter1和己糖激酶II。一项研究表明，肝细胞癌中低FDG积累与高G6Pase表达有关。FDG也蓄积在炎性细胞。实际上，FDG在炎症性病变中的积聚混淆了癌症的诊断。双时间点的FDG成像方法以区分炎症和癌症，按照差异FDG保持。为了解决这一差异，比较了癌症和炎症之间葡萄糖相关基因的表达。因此未就此问题达成共识。在研究中评估了鼠癌和炎症小鼠模型中FDG的积累和流出模式。为了阐明FDG积累的机制，分析了葡萄糖代谢相关基因和蛋白质的表达。
    　　 从典型培养物保藏中心获得人乳腺癌细胞系，人肝癌细胞系和鼠巨噬细胞系。将MDA-MB231和RAW264.7细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基中培养，并将HepG2细胞在Eagle的基本必需培养基中培养。培养基中含有热灭活的10％胎牛血清和1×抗生素-抗霉菌溶液或青霉素链霉素，温度为5％CO，温度为37°C。2．加湿气氛。对于RAW264.7细胞的激活，2×10用100ng/ml脂多糖刺激六孔板中的RAW264.7细胞24小时或不同时间。将2×10细胞接种在六孔板中，并与无葡萄糖RPMI培养基预孵育4小时。将细胞与185kBq的FDG在Hank的平衡盐溶液缓冲液中于37°C孵育10、30、60、120、240和360分钟。细胞在冰冷的HBSS缓冲液中洗涤两次，然后溶解在1％十二烷基硫酸钠缓冲液中。使用Y-计数器测量裂解物的放射性。实验一式三份进行。使用BCA蛋白测定试剂盒，通过蛋白浓度将所有样品标准化。将2×10细胞接种在六孔板中，并与无葡萄糖RPMI培养基预孵育4小时。将细胞在1mlHBSS缓冲液中漂洗，并与HBSS缓冲液中的185kBqFDG一起在37°C孵育1小时。将细胞在冷HBSS中洗涤两次，并在新鲜培养基中孵育不同的时间，收获培养基。最后，将细胞在冷的HBSS缓冲液中洗涤两次，然后溶于1ml的1％SDS缓冲液中。使用Y计数器测量上清液和细胞裂解物的放射性。实验一式三份进行。数据显示细胞中剩余的放射性，计算为每个上清液和细胞裂解物在最终时间点的放射性。T计算FDG流出量1/2，直到从1小时累积的FDG减少到一半所需的时间。
    　　 在含有蛋白酶抑制剂混合物的放射免疫沉淀测定缓冲液中裂解细胞。使用BCA蛋白测定试剂盒测量蛋白浓度。使用NuPAGEBis-Tris凝胶分离蛋白质样品，然后将其转移至PVDF膜。PVDF膜在5％脱脂牛奶在室温下放置1小时。将膜与抗GLUT1，葡萄糖转运蛋白3，HKII的一抗在4°C孵育过夜或B-肌动蛋白。将膜与抗兔或辣根过氧化物酶偶联的第二抗体一起孵育。使用ECL试剂观察免疫反应性条带，并使用LAS-3000系统进行检测。将靶蛋白标准化为B-肌动蛋白。计算了与未活化的RAW264相比，在活化的RAW264.7细胞中HKII或G6Pase表达水平的相对比率。标准化后的7个细胞针对B-肌动蛋白的表达水平。计算MDA-MB-231细胞中HKII和G6Pase表达水平与活化RAW264.7细胞中HKII和G6Pase表达水平的相对比。
    　　 将肿瘤和炎症组织包埋在石蜡中，并切成4um厚的切片。二甲苯处理后，将组织切片重新水化。使用微波在10mM柠檬酸钠缓冲液中加热切片8分钟，并用山羊血清封闭。将切片与针对F4的巨噬细胞特异性抗体在4℃下孵育过夜。洗涤后，将组织切片与生物素化的抗鼠抗第二抗体孵育1小时，然后再次与EliteABC试剂盒试剂一起孵育。将切片与3,3'-二氨基联苯胺过氧化物酶底物溶液，然后再进行Mayer苏木精复染色。作为阴性对照，将切片与同型对照大鼠IgG代替一抗一起孵育。Permount安装后，研究人员在光学显微镜下检查了组织切片。
    　　 根据医院机构动物护理和使用委员会使用BALB裸鼠。将50ulMatrigel中的500万MDA-MB-231细胞或1000万HepG2细胞皮下植入左前大腿。当肿瘤直径达到6.1-11.4mm时，将小鼠用于实验。在一个不同的组小鼠，炎症的50ul的松节油的通过肌内右前大腿诱导注射前3天PET成像和50ulPBS的作为对照，在左前大腿注射。在FDGPET成像之前，将小鼠禁食至少6h，以使血清葡萄糖的竞争抑制作用最小化。静脉注射11.0–16.6MBqFDG后，使用动物PET/CT扫描在2小时内获取动态PET图像。用于发射PET扫描的是32帧动态协议。使用AMIDE软件查看FDGPET图像。使用PMOD软件将PET图像的目标体积分析为最大VOI信号的20％。获得平均标准摄取值和标准偏差，并计算肿瘤与肌肉之比或炎症与肌肉之比。数据显示为平均值±标准偏差。使用学生t检验和带有SPSS23版软件的Mann-WhitneyU检验对各组的统计比较进行分析。小于0.05、0.01或0.001的p值被认为具有统计学意义。
    　　 FDG在各种癌细胞，神经胶质瘤和甲状腺癌细胞中的积累随时间而增加，但是120分钟后，肝癌细胞的水平达到恒定水平。为了证明的FDG积累模式和葡萄糖代谢相关的作用机制，选择了两个癌细胞系与两种不同的图案FDG的积累。直到360分钟，MDA-MB-231细胞的FDG积累持续增加，但120分钟后HepG2细胞的积累达到恒定水平。T1/2比在HepG2细胞中FDG流出在MDA-MB-231细胞把1.8倍更长的。GLUT1，HKII和G6Pase在HepG2细胞中的mRNA表达分别比MDA-MB-231细胞高13.4倍，2.3倍和385.8倍。HepG2细胞中G6Pase蛋白的表达远高于MDA-MB-231细胞中的表达。这些结果表明，MDA-MB-231细胞中较高的FDG积聚是由于HKII的高表达而G6Pase的表达非常低，而HepG2细胞中快速FDG的流出是由于尽管GLUT1和HKII高表达，但G6Pase仍在表达。
    　　 为了研究炎症状况，LPS激活了RAW264.7细胞，并观察了它们的形态变化。促炎性细胞因子如TNF-α，IL-1B和IL-6在被激活的RAW264.7细胞显著增加。研究人员证实，用LPS处理可激活RAW264.7细胞。在被激活的RAW264.7细胞FDG的积累显着高于灭活RAW264.7细胞更高。激活的RAW264.7细胞中的FDG积累增加直到240分钟，然后在以后的时间点减少。T1/2中激活的RAW264.7细胞比灭活的RAW264.7细胞FDG流出把1.4倍更长的中。激活RAW264.7细胞后，GLUT1，HKII和G6Pase的mRNA表达增加，尽管G6Pase基因表达较低，并且没有统计学上的显着差异。葡萄糖转运蛋白的主要异构体GLUT1和GLUT3的表达；HKII蛋白;RAW264.7细胞活化后，GMP和G6Pase蛋白增加。与灭活的RAW264.7细胞相比，HKII蛋白表达增加的比率高于激活后24小时的G6Pase。这些结果表明FDG积累增加，反映了葡萄糖转运蛋白和HKII表达的增加，并加速了FDG外排，反映了RAW264.7细胞活化后G6Pase表达的增加。
    　　 为了证明MDA-MB-231癌细胞和激活的RAW264.7细胞中FDG积累的相似模式，研究人员比较了两种细胞系中FDG的积累。T1/2的中激活的RAW264.7细胞FDG流出在MDA-MB-231细胞把2.3倍更长的。HKII和葡萄糖-6-磷酸酶在MDA-MB-231细胞中的蛋白质的表达水平比在激活的RAW264.7细胞更高。MDA-MB-231细胞中高FDG积累而慢FDG外排，尽管G6Pase的表达高于活化的RAW264.7细胞，但HKII的强表达。FDG在MDA-MB-231荷瘤小鼠中的积累随时间增加。在20–30、50–60、80–90和110–120分钟时，SUV平均±SD分别为1.4±0.2、2.2±1.0、2.4±1.2和2.5±1.3。但是，在HepG2荷瘤小鼠中，SUV平均值为±SD，在20-30分钟时达到恒定水平，然后下降至110-120分钟。与PBS注射的对照病灶相比，FDG在炎性病灶中的积累随时间增加。在20–30、50–60、80–90和110–120分钟时，炎性病变的SUV平均值±SD分别为2.3±0.5、2.6±0.6、2.7±0.7和2.8±0.7。组织病理学分析证实，F4/80阳性的巨噬细胞在炎症病灶。在PBS处理的对照肌肉中未观察到组织学变化。这些结果表明，FDG在鼠类炎症性病变和MDA-MB-231肿瘤中的积累随着时间的流逝而增加，在HepG2肿瘤中达到恒定水平然后下降。
    　　 评估了FDG积累在小鼠癌症和炎症模型中的模式，并测量了葡萄糖代谢相关基因和蛋白质的表达，以阐明FDG积累的机制。FDG积累在鼠癌和炎症小鼠模型中随着时间的推移而增加，反映了GLUT1和HKII表达的上调。此外，FDG外排加速，反映了巨噬细胞激活后G6Pase表达上调和HKII蛋白表达低于MDA-MB-231癌细胞。研究人员认为应该表征FDG在各种癌细胞中积累的不同模式。首先检查了各种癌细胞系中的FDG积累模式，然后选择了两种癌细胞系来显示两种不同的FDG积累模式。FDG在MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231荷瘤小鼠中的蓄积不断增加。GLUT1和HKII在MDA-MB-231细胞中强烈表达。在癌细胞FDG的积累与GLUT1表达和己糖激酶相关。低中分化肝细胞中FDG的积累反映了低GLUT1和高G6Pase表达，而低分化肝细胞中的高FDG积累可能反映了GLUT1升高和G6Pase表达降低。FDG在结直肠癌肝转移中的蓄积高于HCC。他们的数据表明，肝癌中GLUT1和HK水平较低，G6Pase水平较高，高于肝转移，这是FDG积累的限速因素。FDG在肝转移中的流出可能比在HCC中相对慢，因为HCC中的G6Pase水平较高。速率限制因子与肝转移相比，HCC中FDG的积聚对应于FDG吸收较慢和FDG流出较快。FDG在HepG2细胞中的蓄积在一个早期时间点达到饱和，而FDG在荷HepG2荷瘤小鼠中的蓄积在一个早期时间点达到恒定水平，然后下降。发现这些结果反映G6Pase蛋白的强表达，尽管GLUT1和HKII高表达。进一步的研究需要证明这一点；但是，如果研究人员在注射FDG后的20–30分钟内对其成像，则与肝癌中GLUT1和HK过表达的HepG2细胞类似或更高的FDG可能会更高。
    　　 在这项研究中，FDG的积累在激活的巨噬细胞和鼠类炎症模型的炎性病变中随时间增加。检测到巨噬细胞激活后GLUT1和HKII表达增加。FDG在LPS和IFN-Y激活的THP-1人源M1巨噬细胞中摄取增加，而GLUT1和HKII的mRNA表达增加。在松节油诱导的小鼠模型的生物分布数据中，炎症至肌肉中FDG的累积积累随时间增加，直到4h。但是，即使在相同的松节油诱发的炎症模型中，实验之间的FDG积累方式也不同。松节油诱发的鼠类炎症性病变中FDG的摄取稳定增加。另一方面，FDG在松节油诱导的炎症组织中的积累逐渐增加，直至注射后60分钟，然后下降。FDG积累的不同结果可能是由于影响的各种体内因素，例如血液供应，病变结构或细胞活化而发生的。FDG积累。环境因素会影响葡萄糖积累参数。在低氧肿瘤和发炎的组织中，pH较低。肿瘤pH与FDG摄取之间存在显着相关性，因为高FDG摄取对应较低的细胞外pH值。已经报道相关GLUT1及HK水平FDG摄取低氧肿瘤增加。糖毒性通过作用于HIF-1α与HepG2细胞中G6Pase启动子上的cAMP反应元件结合蛋白的相互作用而诱导G6Pase催化单元的表达。在缺氧肿瘤或发炎的组织中，在瘤内低pH条件下，受G6Pase调控的FDG外排可能会受到影响。此外，发现巨噬细胞激活后FDG流出加快。证实巨噬细胞激活后，G6Pase的蛋白质表达增加。研究人员观察到在激活的巨噬细胞的延迟时间点FDG积累略有减少。磷酸化增加在活化的巨噬细胞中由G6Pase上调引起的FDG-6-磷酸盐加速了FDG的流出，并可能在延迟的时间点上导致FDG积累的轻微减少。
    　　 前几项研究报道FDG在癌症和炎症模型中的蓄积，尚未对它们的潜在机制进行比较的研究。在研究人员的结果中，MDA-MB-231细胞中的FDG积累明显高于活化的RAW264.7细胞。这是有道理的，因为MDA-MB-231细胞中HKII的表达高于激活的RAW264.7细胞中的HKII表达。活化的巨噬细胞中的FDG外排比MDA-MB-231中的要快。与研究人员的预期相反，MDA-MB-231细胞中的G6Pase表达高于激活的RAW264.7细胞。但发现MDA-MB-231细胞中的HKII蛋白被强烈表达。因此，HKII的角色可能更为主导。双时间点成像，以区分炎症病变恶性病变增强诊断的准确性FDGPET。在大鼠模型中，在90分钟图像上发炎病变的SUVs与45分钟图像相比降低了，而在90分钟图像上肿瘤的SUVs明显高于45分钟图像。将双重时间点成像作为临床研究方案，以区分头颈部癌患者的恶性病变与炎症性病变。FDG-avid良性肺部病变显示出高保留指数，与原发性肺癌RIs没有显着差异。双重时间点PET成像研究的各个方面存在显着差异，这可能导致文献中报道的结果相互矛盾。结果不一致的原因可能是由于根据癌症类型，癌症异质性，癌症进展状态以及由各种炎症细胞组成的炎症状态而有所不同。另一个原因冲突的结果是在研究之间用于图像采集选择的初始和延迟的时间点变化。
    　　 在这项研究中，出国看病网研究人员评估了葡萄糖蓄积参数包括GLUT，HKII和G6Pase的表达水平，并与FDG蓄积的模式进行了比较。在MDA-MB-231肿瘤和炎症性病变中FDG积累的模式随时间变化没有差异。FDG积累在MDA-MB-231癌症和炎症小鼠模型中随时间增加。但是，FDG外排在活化的巨噬细胞中被加速。同时，研究人员发现活化的巨噬细胞中的G6Pase表达上调，而HKII蛋白的表达低于MDA-MB-231癌细胞。这些知识将有助于理解病理生理和发展癌变和炎症反应双方的治疗学。
 
出国看病概况

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