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胶质母细胞瘤是最致命的原发性脑肿瘤
  • 　　胶质母细胞瘤是中枢神经系统中最常见，最致命的原发性脑肿瘤。针对胶质母细胞瘤当前的治疗策略是手术切除，放射疗法和化学疗法。这些针对神经胶质瘤的疗法不是特异性的，并且具有多种副作用，并且还没有完全成功。因此，尽管在设计胶质母细胞瘤疗法方面进行了广泛的研究，但仍迫切需要新的策略来改善患者的预后。在过去的几十年中对肿瘤和免疫细胞相互作用的更好的理解重新激发了人们对改进目前针对神经胶质瘤的疗法的兴趣。由胶质细胞癌细胞引起的免疫抑制被认为是导致神经胶质瘤患者预后不良和存活率降低的主要因素之一。证据表明，神经胶质癌细胞释放因子如TGF-B，IL-10和前列腺素E2，其抑制抗肿瘤免疫。巨噬细胞是大多数肿瘤的微环境中发现的最丰富的先天免疫细胞。取决于微环境，巨噬细胞可以获得从促炎性到抗炎性的不同亚型。此外，巨噬细胞可细分为M1，M2a，M2b和M2c功能表型。M1极化需要IFN-γ和LPS刺激，M2a极化需要IL-4和IL-13刺激，而M2c极化需要TGF-B和IL-10。M1巨噬细胞的标记是CCL3，CCL5和CD86，而M2c巨噬细胞的标记是CD163和IL-10R。肿瘤相关巨噬细胞被认为获得了肿瘤前M2样巨噬细胞表型。抑制的免疫细胞不仅不能消退肿瘤，而且还可以与神经胶质癌细胞密切相互作用并支持肿瘤的进展。此外，研究表明神经胶质瘤可诱导全身性免疫抑制。因此，重要的是确定与局部和全身免疫抑制有关的机制和分子，这可以为诊断和针对神经胶质瘤的新疗法提供基础。
    　　 为了解决这个假设，研究了不同等级的神经胶质瘤的基因表达谱和免疫细胞浸润，并将其变化与邻近的正常组织进行了比较。出国看病服务机构注意到胶质瘤微环境中TAM的渗透增加。此外，将TAMs表型鉴定为失活的巨噬细胞，这由M2c表型特异性基因的上调证明。此外，随着神经胶质瘤等级的增加，观察到抗致瘤性巨噬细胞的减少。神经胶质瘤诱导的抑制不仅限于肿瘤微环境，而且还表现在外周血中。重要的是，确定了CD163和CCL3基因表达的差异比率可以用作脑肿瘤患者诊断和预后的标志物。血液和脑肿瘤标本取自知情同意的患者，并由病理学家和外科医生进行检查和发布。病理学家根据中枢神经系统肿瘤的WHO组织学分级对肿瘤的类型和等级进行了分类。对于微阵列和免疫组织化学，将邻近的正常组织作为对照。手术过程中切除了这部分大脑以进入肿瘤，并且在MRI上显示正常。此外，通过组织病理学证实了正常的脑组织。来自尸体的脑组织被用作qRT-PCR的对照。健康个体，神经胶质瘤患者和尸体的特征。
    　　 全血收集在肝素管中，并通过ficoll-透明膜密度梯度离心分离外周血单个核细胞。总共1×107分离的PBMC储存在RNAlater中80℃用于进一步分析-在溶液中。使用RNeasy试剂盒，按照先前所述的制造商规程，从PBMC，新鲜肿瘤和正常组织中分离RNA。将RNA样品与扩增级DNase孵育，以去除DNA污染。简而言之，使用用于qRT-PCR的Maxima第一链cDNA合成试剂盒将RNA反转录为cDNA。使用qRT-PCR分析定量基因表达。如前所述，通过ΔCT方法计算了基因的mRNA表达单位。CD163/CCL3的比率计算为：。微阵列实验由iLifeDiscoveries，Pvt完成。根据制造商的规程，使用RNeasy试剂盒从新鲜的肿瘤和正常组织中提取总RNA。RNA纯度和完整性通过BioAnalyser2100分析。使用基因芯片进行基因表达分析(R)Human2.0ST阵列Affymetrix。按照制造商的说明进行AffymetrixGeneChipsTM的靶标制备。芯片的杂交，洗涤，染色和扫描根据标准方案进行。使用GeneSpring和TranscriptomeAnalysisConsole软件分析数据。地理登录号：GSE117423。
    　　 从神经胶质瘤患者和健康个体中分离出的PBMC重新悬浮在FACS缓冲液中。按照与先前所述相同的步骤对细胞进行细胞外标记染色。简而言之，将细胞与Fc结合抑制剂在4°C孵育25分钟。随后，将细胞与人源CD11b，CD14，CD163，CD206，CD4，PD-1或同型匹配的对照Abs特异性结合的荧光染料偶联的Abs一起以推荐的稀释度温育。用1×多聚甲醛固定细胞。使用FACSAria完成采集，并使用BDDIVA软件进行分析。将厚度为4μm的组织切片在二甲苯中脱蜡，然后通过分级的酒精重新水化。使用DakoPT链接进行抗原修复。抗人CD68，CD206和CD163Abs购自英国剑桥的Abcam，抗人Ki-67Ab。根据EnVisionG2DoublestainSystem，兔/小鼠试剂盒，对单个标记CD206和Ki67进行免疫组织化学染色或对CD68和CD163进行双重染色。制造商的说明。使用永久红色染料进行显色。使用DAB进行棕色的显影。然后将切片用苏木精复染并固定在水性固定介质中。使用奥林巴斯显微镜选择每个组织切片六个代表性的高倍视野。对于CD68+/CD163+双阳性细胞定量，通过盲法手工评分分析免疫组织化学。计算来自6个视野/肿瘤切片的双阳性细胞的平均数目。对于CD206棕色定量，使用了Fiji软件。
    　　 可免费访问的服务器OncoLnc工具用于分析所选的M1巨噬细胞标记，M2巨噬细胞标记和促肿瘤细胞因子的生存相关性。OncoLnc工具使用低表达和高表达LGG患者队列为研究的基因生成Kaplan-Meier图。用于评估RNA序列。低级神经胶质瘤和高级神经胶质瘤中CCL3，CD163，IL-10和TGF-B1的表达水平，TCGA数据集：cBioportal被用来评估来自TCGA的LGG和胶质母细胞瘤的数据集，以探索RNA序列的对数倍变化。患者人群中的表达水平。所有统计计算均使用GraphPadPrism5进行。为进行组间比较，使用Studentt检验或Mann-Whitney检验进行统计分析。对于微阵列，“中度t检验”用于评估两组之间差异表达基因的统计学显着变化。p值小于0.05被认为是显着的。
    　　 通过苏木精和曙红染色来表征不同等级的神经胶质瘤。此外，这是作为增殖标志物的Ki-67免疫染色所证实的。高度神经胶质瘤表现出细胞过多，核多态性，有丝分裂和坏死等特征。同样，低度神经胶质瘤的特征是中等细胞性，轻度核多态性和无坏死。众所周知，癌细胞通过抑制免疫系统而逃避免疫反应。在人脑胶质瘤，巨噬细胞是肿瘤浸润免疫细胞的主要成分。因此，通过微阵列研究了神经胶质瘤和邻近正常组织样本中的全局基因表达谱，以识别在低级神经胶质瘤与邻近正常组织，高等级神经胶质瘤与邻近正常组织中过表达或表达不足的基因，以及高级别神经胶质瘤与低级别神经胶质瘤；分析与M1，M2a和M2c等巨噬细胞亚型相关的基因。与邻近的正常组织相比，在低级和高级神经胶质瘤中观察到了M1，M2a和M2c的差异基因表达。有趣的是，神经胶质瘤中的巨噬细胞显示出与失活的巨噬细胞即M2c表型有关的CD163，IL10RA和CCL18基因的较高表达。相反，CCL3和与正常组织相比，与M1巨噬细胞相关的CCL5基因在神经胶质瘤中的表达较低。数据表明抑制人类神经胶质瘤中的抗肿瘤免疫力。神经胶质瘤和正常组织之间的基因表达水平存在差异，代表了神经胶质瘤内部的异质性和研究对象之间的遗传变异。为了进一步从微阵列数据中验证观察结果，评估了RNA序列。使用TCGA公共数据集的LGG和HGG患者中CCL3，CD163，IL-10和TGF-B的表达水平与LGG患者相比，HGG患者中CD163，IL-10和TGF-B的表达更高。相反，相比于LGG例。
    　　 针对神经胶质瘤细胞的大多数治疗策略都失败了。靶向神经胶质瘤微环境的细胞，如噬细胞，显著退化肿瘤并增加存活。因此，研究人胶质瘤微环境中TAM的表型势在必行。通过免疫组织化学检查神经胶质瘤中TAM的CD68标志物的表达。出国看病服务机构观察到CD68的表达增加，表明与正常脑组织切片相比，胶质瘤中TAM的存在增加。通过分析与M1/M2表型有关并通过微阵列RNA序列鉴定的各种基因的表达，证实了神经胶质瘤和邻近正常组织中M1和M2巨噬细胞的极化。表达，免疫组化和qRT-PCR，CD163和CD206是M2巨噬细胞的经典标记。无论是CD206和CD163的表达上调神经胶质瘤，相比于肿瘤相邻的正常组织。此外与低级神经胶质瘤相比，观察到高级神经胶质瘤中M2巨噬细胞的数量显着增加。RNA序列分析表明CCL3的表达降低，这是在高级别胶质瘤M1巨噬细胞标记物古典，相比于低级别胶质瘤。通过qRT-PCR证实CD163和CCL3的表达。微阵列数据还显示，M2c相关基因CD163，CCL18和IL10RA升高。与低度神经胶质瘤相比，高度神经胶质瘤中IL-10和TGF-B的表达明显更高。TGF-B和IL-10都是神经胶质瘤微环境中M2c分化的细胞因子。比较了从尸检，低度神经胶质瘤和高度神经胶质瘤获得的正常脑组织中CD163和CCL3的表达。与高等级神经胶质瘤相比，在低等级神经胶质瘤中，CCL3水平显着更高。最后，计算CD163/CCL3比率，该比率代表M2c和M1TAM之间的平衡。高级别神经胶质瘤中CD163/CCL3的比率明显高于低级别神经胶质瘤。本质上，这些数据提供了有关较高的CD163/CCL3比及其与神经胶质瘤进展相关的指示。为了进一步证实结果，出国看病服务机构使用了在TCGA资源门户网站上公开获得的神经胶质瘤患者的生存数据。评估了CCL3，CD163和两种促癌基因标志物：IL-10，TGF-B1与高表达和低表达人群的死亡率之间的相关性。Kaplan–Meier生存图表明，CD163表达较低和CCL3表达较高的患者，其LGG患者的生存率更高。此外，与表达较低水平的IL-10和TGF-B1的队列相比，表达较高的IL-10和TGF-B1的队列显示生存率显着下降。
    　　 研究表明，人脑胶质瘤的血脑屏障受到干扰。因此，好奇地知道脑胶质瘤引起的免疫抑制是否会影响全身免疫。在接受任何治疗之前分析了从新诊断的神经胶质瘤患者中收集的外周血细胞的免疫表型。来自健康供体的免疫表型用作对照。通过流式细胞术调查了神经胶质瘤患者和健康个体中M2巨噬细胞的存在。数据表明神经胶质瘤中存在全身性免疫抑制，这是CD11b+/CD163+频率的显着上调所支持的与健康受试者相比，神经胶质瘤患者的PBMC中的巨噬细胞。CD163是M2巨噬细胞的标志物。此外，流式细胞仪检测结果通过mRNA水平的基因表达得到证实。显著增强CD163在胶质瘤患者注意到相对于健康志愿者中。在同一患者中注意到CD11b+/CD206+巨噬细胞的频率增加。众所周知，CD163的表达在很大程度上局限于单核细胞，而CD14的表达与骨髓来源的抑制细胞有关，已知这些抑制细胞可诱导人的免疫抑制。因此进一步评估在胶质瘤患者的外周血单核细胞上，CD163的表达明显高于正常对照组。众所周知，抑制性巨噬细胞会使CD4T细胞趋于衰竭。具有较低的效应细胞因子分泌和PD-1的高表达和TIM-3。因此接下来评估了PD-1在外周T细胞上的表达。与健康对照相比，在神经胶质瘤患者的PBMC中观察到PD-1+/CD4+T细胞池升高。流式细胞术同种型对照如图S4所示。这些结果表明神经胶质瘤患者不仅抑制了脑部的局部免疫，而且抑制了全身性免疫。
    　　 针对胶质癌细胞最治疗策略失败，原因是遗传异质性。相反，肿瘤微环境中的非癌细胞在遗传上是稳定的，可以用作治疗靶标。TAM是肿瘤微环境的主要成分。认为必须研究和表征TAM的表型。为了量化巨噬细胞，使用了CD68标记。重要的是要在这里提到重要的是，CD68是在胶质瘤肿瘤微环境的小胶质细胞和巨噬细胞表达了。因此，在本研究中，巨噬细胞和小胶质细胞被一起考虑。在初始阶段神经胶质瘤微环境中注意到巨噬细胞募集的增加。这些巨噬细胞获得了失活的巨噬细胞的表型，这由神经胶质瘤中CD2163，IL10RA，CXCL13M2c表型特异的基因上调所证明。作为M2c巨噬细胞的分化因子，TGF-B和IL-10的表达增加支持了胶质瘤微环境中的抑制性巨噬细胞。这些表明抑制人类神经胶质瘤中的抗肿瘤免疫力。此外，证明神经胶质瘤级别的增加导致M1巨噬细胞表型降低。这是第一次已经确定，较高的CD163/CCL3比与神经胶质瘤的进展有关，可以将其视为神经胶质瘤的诊断标记。有研究表明神经胶质瘤中的M0巨噬细胞表型。这种差异可能是由于对TAM表型选择的标记不同。胶质瘤患者显示出全身免疫抑制的迹象，这可能是常规免疫疗法失败的原因。更好地了解导致全身性免疫缺陷的机制对于设计新疗法至关重要。这将改善患者的预后。与健康对照组相比，确定神经胶质瘤患者外周血中M2巨噬细胞和髓样来源的抑制细胞的抑制人群水平升高。
    　　 为了更好地了解全身抑制的程度，还研究了T细胞。随着癌症的进展，已知T细胞会衰竭。程序性细胞死亡蛋白1是T细胞衰竭的重要标志物。针对PD-1免疫检查点抑制器被示出为在癌症治疗大大成功。因此监测了从胶质瘤患者的PBMC获得的T细胞上PD-1的表达。与健康对照相比，观察到神经胶质瘤患者的CD4T细胞耗尽频率升高，这由PD-1表达的上调所证明。数据表明，人脑胶质瘤患者不仅存在局部免疫抑制，而且还存在全身免疫抑制，这可能会对肿瘤的进展产生重大影响，需要进一步研究。这也可能增加患者对其他感染的易感性。这些发现有一些潜在的临床意义。首先，神经胶质瘤等级可与CD163/CCL3比率相关。其次，出国看病服务机构已将人胶质瘤中的TAMs表型鉴定为M2c样。所以;这种细胞类型可能是消退肿瘤的未来治疗靶标之一。第三，Kaplan–Meier生存图表明，LGG患者的M2c标记表达较低，而M1标记表达较高，则生存率更高。第四，神经胶质瘤患者外周血中M2巨噬细胞，髓样抑制细胞和CD4T细胞耗尽的水平升高，可能与其他诊断技术有关。另外，可以探索针对升高的细胞群体的特异性靶向作为克服神经胶质瘤患者免疫抑制的疗法。从本质上讲，这些结果表明CD163和CCL3的基因表达可以用作监测肿瘤患者预后的重要指标。
 
出国看病概况

海外医疗在国外发展较为成熟，比如在欧美等医疗技术发达国家，很多医院都设有国际病人办公室并配备多语种医学专业翻译人员，就医流程和模式都已相对成熟。在国内，海外医疗虽然还属于新兴行业，但发展势头迅猛，发展潜力巨大，市场前景广阔。
　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
出国看病适应症
靶向药物
 

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