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神经胶质瘤中的致癌基因
  • 　　作为最常见的致死性中枢神经系统肿瘤之一，神经胶质瘤根据组织病理学和分子途径被世界卫生组织分类为四个等级。不幸的是，恶性神经胶质瘤与不良的预后相关，构成了大多数神经胶质瘤。目前，恶性神经胶质瘤的标准治疗策略是最大程度的安全手术切除，然后进行放线或替莫唑胺辅助化疗。尽管最近有临床进展，但诊断为恶性神经胶质瘤的患者的中位生存时间为1-2年。因此，对驱动肿瘤发生和发展的分子机制的深入了解可能为更有效的治疗恶性神经胶质瘤的疗法提供候选。由SQSTM1编码的p62是最著名的自噬衔接，在正常生理和癌症中都起着至关重要的作用。越来越多的证据表明，异常的p62表达与侵袭性临床病理特征和胰腺癌，口腔鳞状细胞癌，转移性乳腺癌和肝细胞癌病例预后不良相关联的。P62积累由炎症或自噬诱导损伤，促进通过抑制细胞凋亡性和反应性氧物质的产生和增强细胞增殖，存活，肿瘤发生和转移起始和的癌症进展。此外，高含量的p62的促进下咽癌放疗和化疗抗性和卵巢癌。中枢神经系统中p62畸变的研究主要集中在神经退行性疾病，如帕金森氏病和阿尔茨海默氏病，而p62在神经胶质瘤进展中的作用尚不明确。
    　　 微小RNA是内源的单链非编码RNA，大约19-25个核苷酸，大约30％的蛋白质编码基因可能受miRNA调控。MiRNA可以直接与mRNA3'-UTR中的互补序列结合，导致翻译抑制或mRNA降解。MiR-124-3p是一种富含脑的miRNA，在神经胶质瘤中表达最少或不存在，并作为肿瘤抑制因子发挥作用，这表明miR-124-3p可能是神经胶质瘤的新型诊断生物标志物和治疗靶标。此外，miR-124-3p可以通过抑制增殖，侵袭和茎样性状，并通过靶向不同的基因来增强化学敏感性，从而抑制神经胶质瘤的进展。在出国看病服务机构以前的工作中，通过靶向PIM1鉴定了miR-124-3p在星形细胞瘤发病机制中的抗肿瘤作用。出国看病服务机构的研究揭示了p62在神经胶质瘤中的表达模式和功能，并进一步阐明了miR-124-3p和p62之间的调控机制，表明p62作为神经胶质瘤治疗靶标的潜在价值。
    　　 总共从医院神经外科采集了26个组织样本。每位患者均签署了知情同意书，并且这项研究得到了伦理委员会的批准。从交通事故造成的颅脑创伤患者中获取十份正常组织样本。该患者队列由9名男性和7名女性组成。在这些患者中，有10名年龄超过50岁，而6名年龄较小。组织学诊断由三位独立的病理学家根据WHO的分类进行确认。立即将组织速冻并保存在液氮中以进行进一步分析。HEK293T人神经胶质细胞HEB和包括U87，LN229和U251在内的三种神经胶质瘤细胞系获自典型培养物保藏中心。将细胞在含有10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中于37°C和5％CO2培养。合成miR-124-3p模拟物，模拟阴性对照，miR-124-3p抑制剂和抑制剂阴性对照从GenePharma购买。合成的p62siRNA和阴性对照siRNA购自GenePharma。这些寡核苷酸的序列显示在附加文。含有p62的全长开放阅读框的载体和阴性对照载体购自Genewiz。所有瞬时转染均根据制造商的说明，使用Lipofectamine2000TransfectionReagent进行。
    　　 进行了免疫组织化学分析，以研究26个组织中p62蛋白的表达。将组织包埋在石蜡中，然后切成6um厚的切片。这些部分在二甲苯中脱蜡，然后在乙醇系列中再水化。将在柠檬酸盐缓冲液中的压力蒸煮5分钟用于抗原回收。接下来在0.3％H2O2中封闭内源性过氧化物酶10分钟与p62一抗一起在4°C孵育过夜。用HRP标记的山羊抗小鼠IgG进行30分钟检测，然后将DAB色原与DAB辣根过氧化物酶色原试剂盒一起孵育。将切片在苏木精中复染10s，然后在乙醇系列中脱水。使用DNA提取试剂盒从冷冻组织中提取基因组DNA，然后在Nanodrop1000分光光度计上进行质量评估。通过PCR扩增了包含IDH1的密码子R132和IDH2的R172的基因组区域，并且引物的序列显示在附加文。Sanger测序反应由Genewiz，Inc.进行。
    　　 将四个少突胶质细胞瘤组织包埋在石蜡中，然后切成6um厚的切片，根据制造商的说明，使用1p36/1q25和19q13/19p13双色探针试剂盒检测到1p/19q编码缺失。根据制造商的说明，使用TRIzol试剂从冷冻组织中提取总RNA。TaqManmiRNA探针用于定量ABI7500系统上miR-124-3p的水平，如先前报道。使用定量实时PCR定量检测p62，CC趋化因子配体2，转化生长因子B1，集落刺激因子3和白介素6的mRNA水平。与SYBRGreenPCRMasterMix按照制造商的说明进行操作。U6和B-肌动蛋白是miRNA和mRNA的内源性对照。探针购自美国应用生物系统公司，引物购自Genewiz。从冷冻组织中提取总蛋白，并按照先前的描述进行蛋白质印迹。使用了以下抗体：p62，B-肌动蛋白，LaminB1，核因子κBp651：1000，8242），HRP标记的山羊抗小鼠IgG和HRP标记的山羊抗兔IgG。用LC3B抗体检测LC3I和II的产量。
    　　 所有一抗均购自CellSignalingTechnology，所有二抗均购自Beyotime。蛋白条带通过Bio-RadChemiDocTouch上的ECLAdvancedWesternBlot检测试剂盒可视化，并通过ImageLab进行定量。通过扩增p62mRNA3'-UTR中的miR-124-3p结合位点并将其插入pMIR-REPORT质粒来构建p62荧光素酶报告载体的野生型3'-UTR。构建突变载体以测试结合特异性。接下来在测试前24小时，将20ug报告载体和10ug对照海肾荧光素酶质粒pRL-SV40共转染到HEK293T细胞中。采用双荧光素酶进行萤光素酶测定根据制造商的规格记者检测系统。如先前报道进行伤口愈合测定。在不同的时间点，用IX71显微镜对板拍照，并通过ImageJ测量距离。将转染的细胞以每孔3000个细胞接种在96孔板中。根据制造商的说明书，在0、24、48和72小时使用细胞计数试剂盒8测定细胞增殖。使用BioTekElx800测量了450nm波长处的吸光度。TMZ的相对毒性通过细胞增殖试验进行评估；接种后24小时，然后将细胞用400uMTMZ或等效溶剂处理48小时。与TMZ孵育后，使用CCK-8测定法研究TMZ的相对毒性。
    　　 如先前报道，侵袭实验板用于评估体外细胞迁移。然后使用IX71显微镜在六个随机选择的区域中对腔室拍照。计算每张图片中迁移的细胞数量。根据制造商的说明，使用活性氧分析试剂盒对细胞的ROS进行了分析，并在GuavaEasyCyte6HT-2L流式细胞仪上进行了检测。将细胞在400mMTMZ或等效溶剂中孵育48小时。与TMZ孵育后，用膜联蛋白V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡，以根据制造商的说明书研究TMZ对番石榴EasyCyte6HT-2L流式细胞仪的细胞凋亡的影响。使用SeahorseXF-96细胞外通量分析仪测量细胞外酸化率，并按照前述方法进行实验。Wave会自动计算ECAR。每个数据点代表八个孔的平均值。所有实验均独立进行至少3次，并使用GraphPadPrism软件对均值和标准误差或标准差进行Student't检验以进行成对比较，或进行ANOVA进行多变量分析。
    　　 为了研究神经胶质瘤恶性肿瘤与p62表达的关系，通过IHC，westernblot和qRT-PCR分析了p62的表达。首先们使用qRT-PCR来鉴定10例正常组织和16例神经胶质瘤组织中p62mRNA的表达。9个神经胶质瘤组织是IDH突变体，而7个是IDH野生型。神经胶质瘤患者的详细临床和分子特征。胶质瘤中p62的相对mRNA水平明显上调。随后，出国看病服务机构证实在神经胶质瘤样本中检测到了积累的p62蛋白，并且p62的表达从WHOII级到IV级逐渐升高。最后，出国看病服务机构研究了P62的相对蛋白水平在人神经胶质细胞HEB和三个神经胶质瘤细胞系，包括U87，LN229和U251，发现P62中过表达在神经胶质瘤细胞系，用HEB所示。此外发现p62的表达与IDH突变状态无关，表明p62的作用可能不取决于IDH状态。出国看病服务机构决定选择U87和U251胶质瘤细胞系进行进一步研究。数据表明，p62与神经胶质瘤的发展密切相关，可能是神经胶质瘤中的一种癌基因。
    　　 对于异常的p62表达在神经胶质瘤细胞中的功能的调查，P62中过表达通过瞬时转染U87和U251细胞用p62的过表达质粒中。细胞增殖测定的结果表明，p62的过表达显着促进了U87和U251胶质瘤细胞的细胞生长。由于p62是自噬的重要衔接子，因此出国看病服务机构用自噬抑制剂氯喹处理转染的细胞，以评估p62对自噬通量的影响。与10uMCQ孵育24小时后，提取总蛋白用于蛋白质印迹分析。经CQ处理的p62载体组中的LC3II/LC3I比在U87细胞中略低于经CQ处理的阴性对照载体组，表明p62过表达可抑制U87中的自噬通量。接下来，进行伤口愈合测定以研究细胞迁移和侵袭能力。结果表明p62的积累显着提高了U87和U251细胞的伤口闭合速度。然后，采用了侵袭实验分析法来评估p62过表达在细胞迁移中的作用。p62的过表达显着增强了U87和U251细胞的迁移能力）。然后，测量了ECAR，以评估p62过表达对细胞能量的影响。的P62-矢量组中观察到有相当的推广，如由一个ECAR增加显著与该NC-矢量组。此外，通过CCK-8和细胞凋亡试验研究了p62积累对TMZ抗性的影响。与nc载体组相比，p62载体组的TMZ相对毒性显着降低。根据CCK-8分析结果，p62过表达可以保护U87和U251细胞免受TMZ诱导的凋亡。然后，通过测量转染细胞中的活性氧来评估p62过表达对氧化应激的影响，结果表明p62积累引起活性氧水平的轻微降低。还研究了p62过表达在NF-κB信号通路中的作用。与nc载体组相比，p62过表达组的核NF-κB水平略有增加。检查了几个NF-κB下游靶基因，包括CCL2，IL-6，TGFB1和CSF3。这些基因在p62过表达后被激活。综上所述数据表明，积累的p62可以调节细胞增殖，自噬，伤口愈合，细胞迁移，糖酵解，TMZ抗性，氧化应激并激活NF-κB信号通路，提示其癌基因在神经胶质瘤中的作用。
    　　 鉴于p62的过度表达可以促进神经胶质瘤，用siRNA生成了p62敲低细胞，以研究p62的下调是否可以抑制神经胶质瘤细胞。Western印迹结果表明，siRNA可以有效地敲低p62蛋白的表达，尤其是p62siRNA2。CCK-8的结果表明，p62的敲低显著抑制细胞生长中。接下来，测试了p62敲低对自噬通量的影响。CQ治疗的p62KD组和CQ治疗的nc-siRNA组之间的LC3II/LC3I比值没有显着差异，表明p62敲低对神经胶质瘤细胞的自噬通量没有影响。接着，迁移和侵袭能力是由伤口愈合和侵袭实验小室测定法评估，结果表明，伤口闭合速度和迁移的能力在P62KD组分别显著降低。糖酵解也测定，并有在糖酵解大幅度块由于P62敲低。接下来，评估p62KD细胞中的TMZ抗性。p62KD细胞对TMZ处理更敏感。最后，在p62KD细胞中测试了活性氧种类，结果表明p62敲低可提高活性氧种类的水平。最后，如预期的那样，p62抑制可抑制核NF-κB表达及其下游靶基因。总之，p62的丧失与p62的积累相反，从而在神经胶质瘤中发挥抗肿瘤作用。
    　　 使用TargetScan来搜索靶向p62的潜在miRNA。的miR-124-3p的种子序列匹配的3'-UTRP62，并且所述杂交的最低自由能为13.3千卡/摩尔。miR-124-3p的表达在神经胶质瘤组织中显着下调，从WHOII级到IV级逐渐降低。此外，随着相对miR-124-3p水平的降低，p62mRNA和蛋白质的相对水平也增加，这表明miR-124-3p可能通过转录后机制和mRNA稳定性来调节p62的表达。为了进一步研究miR-124-3p对p62表达的影响，将miR-124-3p模拟物和抑制剂转染到U87和U251细胞中。转染后的miR-124-3p的表达增加显著与前-miR-124-3p和转染后适度降低与抗miR-124-3p所示。为了验证miR-124-3p是否在mRNA和蛋白质水平上都影响p62的表达，提取了U87和U251细胞的总RNA和蛋白质含量，并用pre-Pro转染后分别用qRT-PCR和Westernblot检测miR-124-3p和抗miR-124-3p。MiR-124-3p的过表达显着降低了相对p62mRNA的水平约65％，而miR-124-3p的抑制作用则使相对p62mRNA的水平升高了约15％。miR-124-3p过表达诱导的p62蛋白水平降低约45％。由于p62是自噬的重要衔接子，并且可以与自噬一起降解，因此使用CQ消除了miR-124-3p对自噬通量的潜在影响。即使在CQ治疗组中，相对的p62蛋白水平也随着miR-124-3p剂量的增加而降低，这表明miR-124-3p的过表达可以直接抑制p62的表达。
    　　 应用萤光素酶测定法研究miR-124-3p对p62表达水平的影响是否通过预测的miR-124-3p与p62mRNA3'-UTR之间的结合来介导。结果表明，与前ncRNA相比，pre-miR-124-3p可以抑制荧光素酶活性，而抗miR-124-3p可以增强荧光素酶活性。但是，突变的萤火虫荧光素酶报告基因质粒对pre-miR-124-3p或pre-ncRNA组的荧光素酶活性没有影响。结果表明，miR-124-3p直接靶向p62mRNA3'-UTR，从而导致在mRNA和蛋白水平下p62表达的下调。由于在U87和U251中p62和miR-124-3p的功能相似，因此仅在U87胶质瘤细胞系中研究了miR-124-3p对p62功能的影响。首先，使用蛋白质印迹试验来检测p62和miR-124-3p过表达对p62蛋白水平的整合作用。miR-124-3p过表达可能会部分逆转p62的积累。然后进行了CCK-8分析，细胞迁移分析和TMZ抗性分析，以检查miR-124-3p的引入是否可以逆转p62的功能。的miR-124-3p的异位表达部分扭转促进增殖中，迁移和TMZ电阻由p62过表达诱导，表明miR-124-3p通过直接与p62mRNA3'-UTR结合而抑制p62表达，从而发挥抗肿瘤作用。揭示了神经胶质瘤细胞中p62的功能，并进一步检查了p62和miR-124-3p之间的相互作用，以阐明p62在神经胶质瘤中的潜在机制。
    　　 在本文中，p62被鉴定为与IDH状态无关的人类神经胶质瘤组织中的mRNA和蛋白水平均异常上调。然后，集中研究了p62的功能，并证明p62的积累可通过调节自噬，增殖，迁移，活性氧，TMZ抗性，糖酵解和NF-κB信号通路来促进神经胶质瘤。根据p62的过表达，p62敲低在U87和U251胶质瘤细胞中发挥抗肿瘤作用。随后，确定miR-124-3p直接靶向p62的mRNA3'-UTR，从而导致在mRNA和蛋白质水平上p62表达的下调。此外，miR-124-3p过表达可部分逆转p62功能。发现表明p62作为神经胶质瘤的新型治疗靶标的潜在价值。p62是一种多域蛋白，因此可通过与不同分子相互作用而发挥多种功能。首先，p62通过N末端寡聚域与促分裂原活化的蛋白激酶激酶激酶3结合，导致mTORC1激活和c-Myc表达，从而促进前列腺癌基质成纤维细胞和HCC中癌细胞的增殖。此外，p62通过LC3相互作用区域与吞噬细胞膜上的LC3结合，并将泛素化的货物递送至自噬体以进一步降解。GATA4是一种肿瘤抑制因子，可被p62依赖性选择性自噬降解，并被确认在GBM中被下调。GATA4的重新表达通过丢失特征不佳的DNA修复酶APNG而不是O-6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶来介导GBM细胞对TMZ处理的敏感性。P62结合TNFR相关因子6与TRAF6结合结构域来激活NF-κB信号传导，导致炎性基因和癌症转移的表达。通过Keap1相互作用区域，p62与Kelch样ECH相关蛋白1结合，从而导致核因子E2相关因子2的激活。几个抗氧化基因，其随后从氧化损伤维持ROS的低一级保护癌细胞。在许多类型的肿瘤中都检测到组成型p62和Nrf2过表达，它们可以促进癌细胞存活，促进细胞增殖并保护肿瘤细胞免受化学疗法，放射疗法和氧化应激的影响。
    　　 在神经胶质瘤样品中观察到Nrf2和p62的过度表达，并被确定与神经胶质瘤患者的临床病理参数和预后密切相关。最后，显示出p62的敲除细胞通过的mTORC1/c-Myc的途径和F1F0-ATP合酶功能障碍降低乳酸分泌和葡萄糖摄取。另一方面，高p62表达通过上调mTORC1和NF-κB活性以及抑制vonHippel-LindauE3泛素连接酶活性来诱导高己糖激酶2和缺氧诱导因子α表达，从而导致癌症中糖酵解的增强。在研究中出国看病服务机构发现p62通过调节神经胶质瘤细胞中的自噬，增殖，迁移，活性氧，TMZ耐药性，糖酵解和NF-κB信号通路来促进肿瘤。但是在出国看病服务机构的实验中，p62过表达质粒的对照是空载体，可能会导致细胞生长快于其他对照，因为DNA长度也会影响细胞的生长。这可能是检测方法差异不那么深的原因。p62的表达可以由具有不同机制的各种分子调节。通过LC3相互作用区域域，自噬可以将p62结合到自噬体膜上的LC3上，并通过非选择性自噬不断降解p62，在调节p62水平中发挥关键作用。自噬通常被认为可增强对传统疗法的反应并抑制神经胶质瘤中的肿瘤进展。Akt抑制剂1L-6-羟甲基手性肌醇2-2-O-甲基-3-O-十八烷基碳酸酯通过诱导自噬降低细胞活力，并使U87胶质瘤细胞放射增敏[26]。丙咪嗪可以在胶质瘤形成模型中诱导自噬相关的细胞死亡，并降低胶质瘤的发生率。藤黄精可以通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路显着诱导自噬并对T98G细胞表现出抗增殖作用。NF-κBNrf2和AP1可以诱导SQSTM1基因转录，形成p62转录调控的正反馈。结果，炎症和氧化应激可通过NF-κB和Nfr2诱导p62促进细胞排毒和选择性自噬，从而预防细胞死亡和肿瘤发生。鸟苷酸结合蛋白3通过激活神经胶质瘤中的p62-ERK1/2信号通路促进细胞生长。发现在实验中IDH野生型组和IDH突变组之间p62的表达没有差异，表明p62的功能可能与IDH状态无关。但是，这仍需要在以后的工作中进行验证。此外，p62可以被其他分子调节。
    　　 MIR-124-3p已经证实在胶质瘤组织中下调，和miR-124-3p的损失与高恶性程度和预后不良患者的神经胶质瘤相关。血清外泌体中miR-124-3p的相对水平可以作为补充性诊断生物标志物，提供微创和创新工具来诊断神经胶质瘤，并预测手术前的转移和神经胶质瘤分级。由于单个miRNA可以靶向数百个mRNA靶标，因此miR-124-3p通过抑制多种靶标基因发挥抗肿瘤功能。MiR-124-3p通过阻断STAT3的表达来抑制神经胶质瘤细胞的增殖，iASPP，Smad4和Nur77。MIR-124-3p恢复通过靶向Capn4阻遏迁移或神经胶质瘤细胞侵袭，IQGAP1，iASPP和PIM1。通过直接靶向N-Ras和R-Ras，miR-124-3p通过抑制VEGF转录激活而损害血管生成。在研究中首次证明miR-124-3p可以直接调节神经胶质瘤中的p62。但是，出国看病服务机构的实验也有一些缺陷。抗miR-124-3p抑制miR-124-3p的效率相对较低，可能是抗miR-124-3p不能显着提高p62水平的主要原因。在未来的实验中，出国看病服务机构将尝试选择更有效的转染工具来解决此问题。总之，p62可以被miR-124-3p靶向，并通过调节神经胶质瘤细胞中的自噬，增殖，迁移，活性氧，TMZ耐药性，糖酵解和NF-κB信号传导途径，充当神经胶质瘤的肿瘤促进剂。p62作为神经胶质瘤的新型治疗靶点的价值。
 
出国看病概况

海外医疗在国外发展较为成熟，比如在欧美等医疗技术发达国家，很多医院都设有国际病人办公室并配备多语种医学专业翻译人员，就医流程和模式都已相对成熟。在国内，海外医疗虽然还属于新兴行业，但发展势头迅猛，发展潜力巨大，市场前景广阔。
　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
出国看病适应症
靶向药物
 

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