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神经胶质瘤中的细胞增殖
  • 　　如今，神经胶质瘤有很多治疗选择，例如手术，放射疗法，化学疗法，靶向疗法等等。但是，恶性脑肿瘤患者的临床预后仍然非常差。多形性胶质母细胞瘤患者的前景特别糟糕，中位生存期仅为12个月，而5年生存率仅为5％。在大多数胶质母细胞瘤患者中，神经胶质瘤细胞具有高度侵袭性，表现出不受控制的增殖，可以迁移到周围的大脑中。这些特征是GBM快速而致命的过程的原因。最近的研究表明，GBM的进展主要归因于GBM患者基因组表达的变化。例如，大多数神经胶质瘤患者发生表皮生长因子受体扩增突变，并促进神经胶质瘤的恶性进展。外周髓鞘蛋白的构件22基因家族是编码上皮细胞膜蛋白1的基因，其包含至少七个成员：PMP22，EMP1，EMP2，EMP3，PERP，TMEM47，和MP20。EMP1是一种小的疏水糖蛋白，包含160个氨基酸和4个跨膜结构域。它是参与细胞增殖和脑和乳房癌的进展强烈关联。EMP1还与非小细胞肺癌患者的吉非替尼耐药相关。尽管已经广泛研究了EMP1在肿瘤发生和发展中的作用，但还不知道EMP1在GBM中的功能。
    　　 神经胶质瘤干细胞可能是起源细胞，它驱动神经胶质瘤的形成和发展。CD44可促进神经胶质瘤干细胞的增殖。出国看病网研究人员发现EMP1在神经胶质瘤组织中表达更高，并且与神经胶质瘤患者的不良预后相关。沉默的EMP1抑制神经胶质瘤细胞的侵袭和增殖，并且EMP1可以调节CD44表达来促进神经胶质瘤干细胞的干性。综上所述，结果表明EMP1是潜在的新靶标，可提高生存率。将来自细胞库的U87和U251细胞系在加有10％胎牛血清的Dulbecco's改良Eagle's培养基中于37°C于潮湿环境中培养5％CO2气氛。从U251胶质瘤细胞系中分离出一个神经胶质瘤干细胞系。在补充剂中培养U251胶质瘤细胞，其中包括碱性成纤维细胞生长因子，表皮生长因子和B27补充剂，在37°C，95％空气和5％CO2增湿的气氛中。U251s胶质瘤干细胞在肿瘤球悬浮培养物中生长，并在传代时轻轻抽提。从6例颅脑损伤患者中收集了正常的脑组织，并从11例需要手术的患者中收集了GBM组织。切除后，研究人员立即将每个样品保存在液氮中，以便在需要时使用。研究人员分析了癌基因组图谱的神经胶质瘤组织和正常组织中的EMP1表达。聚合酶链反应来测量信使RNA的水平。研究人员使用TRIzol试剂方法获取总RNA，并使用RevertAidFirstStrandcDNA合成试剂盒合成互补DNA，所有操作均按照制造商的规程进行。使用QuantiNovaSYBRGreenPCRKit通过StepOne实时PCR系统测量EMP1mRNA水平。
    　　 细胞增殖用CCK-8分析试剂盒测量，操作按照制造商的规程进行。将100uL细胞悬液分散在96孔板中，然后在培养箱中将板预培养24小时。将CCK-8溶液添加到每个孔中，并将板孵育1-4小时。接下来，研究人员使用酶标仪在450nm处测量吸光度。研究人员进行了三个独立的实验。将无血清DMEM中的EMP1敲低细胞和非沉默对照细胞转移至Transwell测定室。将含有10％FBS的DMEM作为趋化剂添加到下腔室中。Transwell系统用于培养细胞约48至72小时。然后，使用棉签从顶部孔中取出细胞，并用4％甲醛将位于膜下表面的细胞固定下来。15分钟后，将细胞用0.2％结晶紫染色。在六个随机选择的区域中检查迁移的细胞，并在显微镜下计数。使用放射免疫沉淀测定缓冲液分离了蛋白质，并使用比辛可宁酸测定试剂盒测定蛋白质浓度。将蛋白加载到Bio-RadMini-Protean凝胶上，使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，然后将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上。用5％牛血清白蛋白封闭PVDF膜约1小时。一抗在4°C下在PVDF膜上探测过夜。接下来，用磷酸盐缓冲盐水清洗膜，并与辣根过氧化物酶偶联的抗兔或抗小鼠二抗孵育2小时。将细胞系和神经胶质瘤干细胞用4％多聚甲醛固定，然后用PBS洗涤细胞。使用0.1％TritonX-100渗透细胞，随后用5％BSA封闭它们。一抗在4°C下孵育16至18小时。接下来，用PBS洗涤样品3次，并在37°C下与荧光二抗孵育1小时，同时避光。并使用4'，6-二mid基-2-苯基吲哚对细胞进行复染，使用荧光显微镜检查细胞。
    　　 生物信息学调查表明与正常脑组织相比，GBM组织中的EMP1表达更高），定量逆转录聚合酶链反应分析证实了这一结果。使用蛋白质印迹法来测量GBM组织中EMP1蛋白的表达水平。与GBM组织相比，正常脑组织中EMP1蛋白的表达较低。使用GEPIA进一步研究了EMP1在神经胶质瘤患者中的预后潜力，发现较高EMP1水平的患者与较短的总生存时间和无病生存时间显着相关。为了评估siRNA对神经胶质瘤细胞中EMP1的功能，使用了免疫印迹和免疫荧光法来测量EMP1蛋白的表达的siRNA抑制显著在神经胶质瘤细胞系U251和U87。发现EMP1siRNA降低了EMP1mRNA的表达。综上所述，这些结果表明siRNA可以在神经胶质瘤细胞中提供足够的EMP1敲低。U251和U87胶质瘤细胞中的EMP1，以确定其作用。CCK-8分析显示，在EMP1敲减的U251和U87细胞中，细胞增殖速率显着降低。Transwell分析表明，EMP1沉默抑制了U251和U87胶质瘤细胞的侵袭能力。此外，U251和U87中的EMP1敲低可以减少CD44和MMP2蛋白的表达。EMP1使用的信号通路。研究人员发现在U251和U87胶质瘤细胞中的EMP1敲低降低了PI3K和AKT的磷酸化。在脑胶质瘤细胞系中，PI3K-AKT信号通路的下游，Bcl2和caspase-3水平降低。神经胶质瘤干细胞促进神经胶质瘤的发展。从神经胶质瘤细胞系U251中培养了U251s细胞，以确定EMP1在神经胶质瘤干细胞中的作用。胶质瘤干细胞中的EMP1沉默降低了CD44的表达。研究人员评估EMP1在Nestin，SOX2，OCT4和Nanog表达上的作用，发现在神经胶质瘤干细胞中EMP1沉默抑制了这些干标记蛋白的表达。结果表明，EMP1调节神经胶质瘤干细胞的特征。
    　　 发现跨膜蛋白EMP1通过涉及PI3K-AKT信号通路和CD44激活的潜在机制促进神经胶质瘤细胞的侵袭性迁移。EMP1是不可或缺的膜糖蛋白，可在肺，皮肤，胃肠道，脑等上皮组织中检测到。EMP1在人类癌症中显著生物学作用。在鼻咽癌细胞中，它可以诱导细胞凋亡并阻止血管生成，从而阻止癌细胞的生长和迁移。EMP1可以调节其他癌症的细胞增殖和转移，例如膀胱癌，胃癌，乳腺癌，前列腺癌和结肠直肠癌。在急性淋巴细胞白血病患者中，EMP1表达已被证明异常高，并在前体-BALL，EMP1表达的表达更高能预测更差的预后。最近发现EMP1在神经胶质瘤中过表达。然而，其在此类肿瘤中的特异性功能鲜为人知。证明了神经胶质瘤组织中EMP1的表达高于正常脑组织。通过分析TCGA的神经胶质瘤数据，研究人员还能够证明较高的EMP1表达与较短的生存时间有关。此外，EMP1的下调通过PI3K-AKT信号通路和CD44活性抑制U87和U251胶质瘤细胞的增殖和迁移。癌症干细胞很可能是恶性肿瘤的起源，例如乳腺癌，白血病和胃肠道癌。发现CD133阳性细胞是神经胶质瘤复发的主要原因。胶质瘤干细胞具有多种干细胞表面标记，例如CD133，A2B5，CD15和L1CAM。CD44是跨膜蛋白，在维持癌症干细胞的干性中起重要作用。CD44ICD是CD44的裂解细胞内结构域，可以激活干性因子来维持乳腺癌干细胞的干性。这些证据表明CD44可以帮助乳腺癌的发展。EMP1与维持干细胞有关，它在增殖和未分化的胚胎干细胞中的表达较高。但是当诱导细胞分化时，其表达被显着抑制。EMP1在早期和未成熟的神经元中强烈表达。因此，研究人员怀疑EMP1调节茎标记的表达。发现EMP1表达与神经胶质瘤细胞中CD44的表达有关，并且怀疑EMP1通过CD44调节神经胶质瘤干细胞。研究结果为研究人员提供了沉默EMP1表达可以通过下调CD44的表达来抑制细胞表面标志物的水平。总体而言，研究人员证明了神经胶质瘤组织中EMP1的水平相对较高，并且EMP1表达水平高预示着神经胶质瘤患者的预后较差。发现CD44可能是EMP1信号通路中的关键介质，并且CD44的表达可能影响神经胶质瘤中的的信号。这些结果为神经胶质瘤的治疗和预后提供了新的策略。
 
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靶向药物
 

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