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增生性小儿神经节神经胶质瘤
  • 　　增生性小儿神经节神经胶质瘤与增生性小儿星形细胞瘤一起形成了一组罕见的仅根据组织病理学特征定义的低度小儿神经上皮肿瘤。鉴于DIG和DIA具有相似的临床放射学特征和预后，它们在WHO的中枢神经系统肿瘤分类中被归为一个实体。最近，他们也已经显示出基于拷贝数和DNA甲基化分析为具有相对均匀的分子结构，进一步支持了DIG和DIA表示相同的肿瘤实体的频谱的概念。总体而言，DIG比DIA更为频繁。两者通常都可以通过大体全切除术治愈，并且在小计切除术中可能保持稳定。然而，肿瘤复发，恶性进展，而且很少，软脑膜传播已经报道了特别是当完全切除是不可行的，因为在nonhemispheric中线/鞍上肿瘤，并且似乎发生更常见DIA比DIG。在形态上，DIG/DIA可能表现出令人担忧的特征，例如分化程度差的原始神经上皮成分，坏死，细胞学非典型性和有丝分裂活性增加。然而，这些组织学特征是不能预测肿瘤复发，进展或扩散柔脑膜。偶发性复发/进行性肿瘤的治疗选择主要取决于再次切除或辅助治疗。
    　　 最近在DIG/DIA中发现的MAPK途径活化主要表现为BRAF改变，表明DIG/DIA可能代表了另一种MAPK途径驱动的神经上皮肿瘤，类似于毛细胞星形细胞瘤，从而扩大了需要辅助治疗的患者的治疗选择。值得注意的是，低得不成比例突变等位基因频率已被反复尽管所报道的高肿瘤细胞含量观察。这表明在DIG/DIA中，已鉴定的MAPK途径改变可能是亚克隆的，而不是克隆的驱动程序。在14年内，确定了11例经DIG/DIA进行组织病理学诊断的患者，其中该患者曾在Mayo诊所或Dell儿童医学中心进行过手术。仅选择具有足够残留组织以进行分子和免疫组织化学评估的婴儿病例，所有病例均为DIG。先前在一项针对临床的研究中报道了4例梅奥诊所病例。对所有7例病例的所有手术切片可获得的所有诊断载玻片和其他组织化学/免疫组化染色进行了回顾，并根据先前描述的组织病理学诊断标准在所有病例中均确认了DIG的形态学诊断。最初被诊断为DIA的一例病例被重新分类为DIG，因为鉴定出了突触素阳性的肿瘤神经节细胞，随后的切除显示出残留的DIG。所有入选病例均由表皮脑膜肿瘤组成，这些表皮神经瘤表面变化不一，直接或沿Virchow-Robin间隙进入基础脑实质。这些肿瘤主要由具有多个GFAP免疫反应性星形胶质细胞和分散的突触素免疫反应性成熟赘生物神经节细胞的去肿瘤成分组成，以及相当数量的GFAP突触素阴性梭形细胞在形态上使人联想到小胶质细胞。这些细胞与马森氏三色阳性的胶原蛋白丰富的基质有关，基质通常表现出星形结构。将去增塑成分与非去增塑成分局部混合，显示出成熟的神经元至嵌入神经pil的低分化神经上皮细胞。在6例病例中发现了数量不等的低分化神经上皮细胞。当存在时，除了在分化程度差的神经上皮成分附近或之内的局灶区域外，通常不存在有丝分裂活动。肿瘤坏死7例中均未发现明显的细胞学异型性和微血管增生。从电子病历中提取临床，放射学，治疗和随访数据。选择六个非肿瘤性脑外科手术标本作为微神经胶质/巨噬细胞免疫组织化学标记物评估的对照。截止到2019年3月，使用PubMed数据库搜索了术语“增生性神经节神经胶质瘤”，“增生性星形细胞瘤”，“增生性小婴儿”和“增生性非婴儿”。对具有分子数据的出版物进行了综述，并提取了分子发现并将指出没有任何组织病理学数字文档的病例。
    　　 在Mayo诊所使用临床验证的定制靶向神经肿瘤下一代测序面板，内部RNA测序测定法和OncoScan染色体微阵列对来自7个选定病例的第一次切除标本进行了全面的分子表征。在苏木精和曙红染色的载玻片上圈出肿瘤区域，并尽可能尝试进行肿瘤富集以排除邻近的非肿瘤性脑实质。在所有区域中，用肉眼估计圆圈区域内的肿瘤百分比。最初的肿瘤百分率评估仅基于苏木精和曙红染色的载玻片评估，而未考虑通过免疫组织化学鉴定的不同细胞群。在检查所进行的免疫组织化学标记后，估计了第二个肿瘤百分数。将福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织中的5um未染色切片与相应的苏木精和曙红染色切片相匹配，并手动宏观切开圈出的肿瘤区域。如前所述，提取核酸并制备基于扩增子的测序文库。
    　　 定制的靶向神经肿瘤NGS专家组利用分子条形码技术，可追溯PCR人工产物/重复序列，并询问150种与CNS肿瘤相关的基因以及104种已知基因融合体的编码区和内含子/外显子边界中的DNA序列变化，29个异常转录本变体，以及包含81种CNS肿瘤相关基因列表中至少1个基因伴侣的靶向区域的新型融合转录本。内部RNA测序测定法可评估2360种与癌症相关的基因。使用神经肿瘤DNA面板和RNA测序的IlluminaHiSeq2500和IlluminaMiSeq。定制的生物信息学流水线处理了神经肿瘤学小组和RNA测序数据，以检测具有至少15％的等位基因频率和100x覆盖率以及至少5个独特的基因融合事件的单核苷酸变体和小插入/缺失融合读取。根据不同同工型的频率和大小选择优选的基因转录物清单。AlamutVisual用于分析DNA序列改变；基于预定义的首选基因转录本，使用带有定制嵌合参考的IGV评估基因重排。根据遗传数据库和文献的公开数据，DNA序列改变被归类为致病突变，意义不明或良性多态性的变异，框内基因重排被归为致病/致癌或意义不明。临床上仅考虑致病突变和致癌融合。
    　　 染色体的微阵列分析，OncoScanFFPE测定试剂盒施加到所提取的DNA。简而言之，靶向独特DNA碱基对的分子倒置探针与靶DNA中的互补核苷酸退火并被环化。通过核酸外切酶处理可去除任何单链DNA，然后释放，切割环状探针，然后进行转化步骤，并使用通用引物对进行扩增。将生物素化的寡核苷酸与OncoScan全基因组阵列杂交过夜。对于非马赛克缺失和重复，该阵列的全基因组功能分辨率为500千个碱基。大于1兆碱基的缺失，大于2兆碱基的重复和大于10兆碱基的拷贝中性杂合性缺失被认为具有临床意义。验证性分子测试包括靶向Sanger直接测序，RT-PCR/靶向Sanger直接测序和液滴数字PCR。对于RT-PCR，第一链cDNA合成使用随机六聚体，并使用iScriptSelectcDNA合成试剂盒输入500ng总RNA。使用铂DNA聚合酶进行PCR。通过凝胶电泳分离PCR产物，用QIAquick凝胶提取试剂盒提取。使用ABI3730xlDNA分析仪进行靶向Sanger直接测序。使用ddPCR进行了两次基于Taqman的，LNA修饰的探针测定。如前所述制备PCR反应混合物。使用Veriti热循环仪获得了BRAF野生型和V600D的同时终点PCR扩增。在QX200液滴读取器上分析反应。液滴携带的绝对数量BRAFV600D和野生型进行定量和百分比BRAF使用QuantaSoft软件计算V600D对于野生型。纯合BRAFV600D突变细胞系和身份不明的临床非肿瘤DNA样品分别用作阳性和阴性对照。使用2009年2月NCBI人类基因组构建37.1分析并报告了来自分子研究的所有数据。
    　　 为了评估肿瘤细胞的组成，免疫组化研究使用了一组常规在血液病理学实践中使用的临床可用标志物，这些标志物可检测出小胶质细胞/巨噬细胞，淋巴细胞检查。此外，在一个单一的BRAFV600E突变病例中获得了BRAFV600E免疫染色，以进行确认；在所有7个病例中，考虑到小胶质细胞/巨噬细胞标志物的结果以及支持PD-L1表达的数据，在所有7个病例中均进行了PD-L1免疫染色。胶质瘤肿瘤相关巨噬细胞。根据预期的染色方式对所有免疫染色进行评分和形态细胞类型。如果在预期的染色模式和细胞类型内，则在任何细胞中的染色均被视为阳性。小胶质细胞/巨噬细胞标志物根据增生性肿瘤成分中总细胞的百分比进行评分。对于PD-L1，如果>5％形态肿瘤细胞具有膜状染色模式，则认为病例为阳性。
    　　 有4名女性和3名男性患者，诊断中位年龄为4个月。多数表现为头围增大。其他症状包括单侧无力，顽固性癫痫，呼吸暂停，单侧凝视，呕吐和上运动神经元体征。所有肿瘤均为幕上肿瘤，其中2个累及中线结构。放射学上，所有病例均增强了对比度，除1例外，所有病例均具有囊性成分。当可测量时，肿瘤尺寸为3.2至9.5厘米。4例患者接受了全切术，分别在84、109、40和21个月的随访中均未复发或有疾病迹象。其余3例均行大部切除术。1例在术后83个月保持稳定，而2例经历了多次肿瘤再生/复发并接受了额外的治疗。病例3进行了化学放疗并发展为顽固性癫痫，在术后97个月接受了颞叶切除/杏仁核海马切除术；除了内侧颞叶硬化症外，还发现了微小的残留DIG与更成熟的神经节胶质瘤样成分相关的病灶;该患者已稳定42个月。先前已经报道了病例7，并接受了化学疗法和靶向治疗，临床反应仅限于靶向治疗，并且在19个月的随访中对疾病保持稳定。总体而言，有或没有再生长/复发的肿瘤的组织病理学特征没有差异，在任何情况下均未观察到具有恶性转化的肿瘤进展。即使有残留肿瘤，所有患者都还活着。
    　　 免疫组化前后中位估计的肿瘤含量分别为80％和30％。从标本采集到测试的中值时间为11年。除3例神经肿瘤RNA评估失败但具有RNA测序结果的病例外，所有病例均通过多种平台获得了有益的结果。3例神经肿瘤RNA面板不合格的病例都是在测试前10年内获得的，其中包括研究中最老的病例。在7例病例中有4例识别出激活的MAPK途径改变，并且所有情况均通过其他方法得到了证实。三种肿瘤的BRAF改变，包括1个V600E以及2个罕见突变：V600D和V600。这些突变被发现在8％-27％的变体等位基因频率这些肿瘤内，并且BRAF在8％V600D突变VAF被确定仅取决于NGS测序人工审核读取给定的先验知识BRAFV600密码子DIG/DIA的热点突变区；由于预先设定的15％VAF临界值，生物信息学管道未对此变化进行调用。另一个肿瘤是BRAF野生型，具有TPM3-NRTK1框内融合。通过染色体微阵列，该样品在1q21.3q22处至少有3个重复，并且TPM3和NTRK1均被第一次和第三次重复破坏，支持检测到的融合事件，并表明该融合是通过染色体内重复形成的。尽管通常以平衡的基因组为特征，但通过染色体微阵列鉴定了非复发性的收益和损失，包括TPM3-NRTK1中的7p22.3p14.1的收益和13q13.3q34的损失。融合阳性病例，BRAFV600E突变病例9号染色体缺失，BRAFindel病例X染色体花叶丢失。以前未观察到这些拷贝数变化，而在DIG中已反复报道BRAFV600E和V600D突变。尽管以前没有在任何中枢神经系统或非中枢神经系统肿瘤类型中观察到V600_W604delinsDQTDG突变，但根据蛋白质模型预测它可以被激活。TPM3-NRTK1融合在功能上表征为致癌和是最常见的类型之一NTRK1融合体。尽管以前没有在DIG/DIA中报道，但在高级神经胶质瘤和其他非CNS肿瘤类型中已反复观察到类似的TPM3-NRTK1融合蛋白。
    　　 在所有7例病例中，所有免疫染色的免疫组织化学研究均已成功完成。在所有情况下，总体免疫组织化学模式均相似。CD68-PGM1，CD163，CD14和CD11c免疫染色突出了增生性肿瘤成分内至少30％GFAP/突触素非免疫反应细胞。这些细胞主要具有细长的纺锤体细胞形态，散在的细胞显示出饱满的外观，胞质更丰富，并且在形态上分别与小胶质细胞和巨噬细胞一致。在非增塑的成熟神经元/分化程度差的神经上皮成分中，这些细胞较少，主要由丰满的巨噬细胞组成。潜在的非肿瘤性脑实质还显示CD68-PGM1，CD163，CD14和CD11c免疫反应性小胶质细胞/巨噬细胞遍布各处。溶菌酶阳性细胞很少见，形态上与巨噬细胞一致。CD3和CD20免疫染色分别鉴定出少量的分散T和稀有B淋巴细胞。CD34染色仅限于丰富的细微血管网络。在6个对照非肿瘤性外科手术脑标本中，与小胶质细胞/巨噬细胞谱系形态一致的细胞具有与DIG中观察到的模式相似的免疫染色模式，对CD68-PGM1，CD163，CD14和CD11c具有反应性。在这些对照脑样本中，CD11c和较小程度的CD68-PGM1表现出比其他标记更广泛的染色，这可能是由于除活化的小胶质细胞和巨噬细胞外，其余的未活化的小胶质细胞也被染色了。
    　　 在这项研究中，确定了7个DIG中的4个DIG的MAPK激活改变，并扩展了报道的MAPK激活改变的范围，使其包括新型激活的BRAFindel和致癌的TPM3-NTRK1融合。这2例符合临床批准的靶向疗法的非标签使用条件。已记录了具有新型BRAFindel的肿瘤患者的临床反应，临床前数据表明，带有TPM3-NTRK1融合物的肿瘤可能对NTRK靶向疗法有反应。对于BRAFV600E突变型肿瘤患者，BRAFV600E抑制剂疗法可以考虑到对部分临床反应代表一种治疗选择BRAFV600E抑制剂已在DIA。因此发现支持常规的DIG/DIA分子检测，并加强了精密医学在儿科神经肿瘤学实践中的效用。保持BRAFV600E/V600D低突变频率在DIG/DIA具有高肿瘤百分比，也观察到较低的不成比例的等位基因频率为所识别的MAPK激活改变，因此预期的肿瘤百分比范围比预期的范围高8％–27％）。所观察到的低的突变等位基因频率可能低于检测临床分子测定的极限，因为是BRAF出国看病服务机构研究中的V600D突变，导致假阴性结果，可能低估了MAPK途径的实际频率/DIG/DIA中的其他改变。此外，该观察结果表明，这些激活的改变可能代表了亚克隆乘客而不是克隆驾驶员事件。这种区别在临床上很重要，因为在前一种情况下，预期对靶向疗法的耐药性会更快发展。
    　　 然而，支持MAPK激活改变是DIG中主要的一击克隆驱动因素，而不是亚克隆事件，并且将观察到的低等位基因频率归因于这些肿瘤中高的小胶质/巨噬细胞含量。在肿瘤增塑成分中发现了大量梭形细胞，形态和免疫组织化学与小胶质细胞/巨噬细胞一致。虽然最初认为代表的成纤维细胞，成纤维细胞样或Schwannian样细胞，研究结果支持在DIG主轴细胞群的小神经胶质细胞/巨噬身份。在低级和高级神经胶质瘤中已描述了数量不等的小胶质细胞/巨噬细胞，似乎对肿瘤具有支持作用。在视神经星形细胞瘤毛细胞型小鼠模型中，例如，小胶质细胞已被证明在肿瘤形成和维护以发挥关键作用。先前也已经证明DIG/DIA增塑成分中的BRAFV600E免疫反应性细胞在区域内受到BRAFV600E阴性梭形细胞群包围的巢区域限制，这表明该增塑成分在自然界具有反应性。不管它们的作用如何，假设在去增生性肿瘤成分中的小胶质细胞/巨噬细胞的大部分“稀释”了突变体等位基因频率，因为在评估免疫组化标记后估计的肿瘤百分数与观察到的突变等位基因频率更接近在肿瘤性神经上皮成分中。需要更多的研究来使用更完善的技术/技术以及扩大评估病例的数量来证实出国看病服务机构的假设。
    　　 评估了PD-L1的免疫组织化学表达，考虑到显着的小胶质细胞/巨噬细胞成分，在所有情况下肿瘤细胞以及小胶质细胞/巨噬细胞成分均为阴性，这与先前评估低级神经胶质瘤的研究一致。尽管由于仅评估了一个PD-L1克隆，并且未评估DNA错配修复，微卫星不稳定性和肿瘤突变负担，因此仍需要进行其他研究，但小胶质细胞/巨噬细胞和肿瘤细胞缺乏PD-L1表达表明免疫治疗可能在DIG中无效。在DIG/DIA中也观察到了局灶性复发拷贝数变化，尽管尚未发现具体的模式，并且许多病例显示出平衡的基因组。通过染色体微阵列鉴定了TPM3-NTRK1融合事件的足迹，这表明了融合形成的潜在潜在机制。尽管染色体微阵列可能提示存在融合事件并在组织学诊断不直接且考虑其他肿瘤实体时提供帮助，DIG/DIA似乎主要由序列点突变和插入缺失/融合事件驱动，而不是拷贝数变化导致基因组不稳定。因此，包括DNA或RNA测序以及基因融合分析在内的分子谱分析有望比拷贝数评估具有更高的产量，以检测这种罕见肿瘤实体中的临床显着改变。在出国看病服务机构的系列文章中，还注意到手术切除的程度与DIG的更好结局有关。接受完全肿瘤切除术的所有4名患者术后病程平稳，并且在没有疾病证据的情况下还活着。在分子上，一个病例具有BRAFV600D突变，其中3例为BRAF野生型肿瘤。相比之下，三分之二的患者接受了不完全的肿瘤切除并且患有BRAF突变的肿瘤经历了多次肿瘤再生/复发，并且在一个病例中，软脑膜扩散需要进一步的治疗；另一例患有BRAF野生型肿瘤，TPM3-NTRK1融合。尽管临床过程较差，但所有未完成肿瘤切除的患者仍活着且病情稳定。该2中报道的患者用DIG窝藏TP53经历恶性转化的突变，这表明TP53突变可以代表负预后发现;在系列中所有病例均为TP53野生型。此外，最近有人提出非半球性肿瘤位置与手术切除不完全和临床过程不良有关，并且在BRAF中恶性转化/进展可能更常见野生型的情况下，包括与其它非箱子BRAF改变。确实，经历了多次肿瘤再生/复发的2例肿瘤未完全切除的病例中，有1个涉及了鞍上区。尽管没有观察到任何恶性转化/进展情况，并且仅评估了少数病例，但在研究中，BRAF突变而非BRAF野生型肿瘤似乎与次全切除肿瘤的不良预后相关。所有4例BRAF患者野生型肿瘤在完全切除肿瘤后仍无生命迹象，或在肿瘤切除不完全后仍稳定病情。另一方面，在3例BRAF突变型肿瘤患者中，2例大体切除的肿瘤经历了多次肿瘤复发，对于肿瘤中携带新型BRAF的患者而言，其病程明显更强插入其余患者的肿瘤已完全切除，在随访期间无疾病迹象。在无法进行完整的肿瘤切除并且存在肿瘤再生长或发生恶性转化的情况下，通常会启动辅助治疗，在有记载的靶向改变的情况下，靶向治疗是潜在的替代治疗选择。总之，本研究进一步支持DIG作为另一种低级MAPK途径驱动的神经上皮肿瘤。还建议DIG的特征是突出的，大概是非肿瘤性的但可能具有肿瘤支持性的小胶质细胞成分，导致克隆驱动基因突变等位基因频率低。推荐使用大解剖进行肿瘤富集和高灵敏度技术的常规分子检测，因为在分析DIG/DIA时应相对较高的产率，以鉴定治疗上可靶向的事件，特别是在不适合手术治愈的肿瘤患者中。
 
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海外医疗在国外发展较为成熟，比如在欧美等医疗技术发达国家，很多医院都设有国际病人办公室并配备多语种医学专业翻译人员，就医流程和模式都已相对成熟。在国内，海外医疗虽然还属于新兴行业，但发展势头迅猛，发展潜力巨大，市场前景广阔。
　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
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