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神经胶质瘤细胞周期进程和增殖
  • 　　脑胶质瘤是成人中最侵袭性和最普遍的原发性脑肿瘤类型，标准治疗后中位生存期为15个月。脑胶质瘤占所有原发性脑恶性肿瘤的80％。目前的治疗方法，包括手术切除，化疗，放疗，极大地改善患者的存活。尽管如此，肿瘤抵抗力和复发仍然是治疗上的困难需要关注。因此，深入于底层胶质瘤发病的研究是必要的，这有助于开发更敏感的诊断标志物和有效的疗法。非编码RNA由于其组织特异性和肿瘤中异常表达模式的特征而被广泛研究。它们与肿瘤细胞行为的各个方面紧密相关。lncRNA是真核基因组的转录产物，长度超过200nt。根据最近提出的竞争内源RNA理论，lncRNAs能够通过揩的miRNA，包括lncRNAXIST，调节下游基因的表达的10PFL，11HOXD-AS1和HCP5。结果，下游mRNA被下调并进一步影响肿瘤的进展。邻近反向链RNA1的lncRNAFOXD2位于染色体1p33上，含有2527个核苷酸。先前的研究已证实FOXD2-AS1在非小细胞肺癌，胃癌，膀胱癌，鼻咽癌和大肠癌中上调。在本文中，主要探讨了FOXD2-AS1在神经胶质瘤进展中的表达特征和生物学功能。作为miR-31海绵，FOXD2-AS1通过上调细胞周期蛋白依赖性激酶1调节神经胶质瘤的细胞周期和增殖能力。出国看病网研究人员的研究为神经胶质瘤靶向治疗的未来发展提供了潜在的新方向。
    　　 2016年1月至2017年12月，从医院获得7例正常脑组织和30例神经胶质瘤组织。所有程序均经临床医学院伦理委员会批准。至少两名经验丰富的病理学家根据WHO分类标准在病理学上证实了神经胶质瘤组织。将组织长期保存在液氮中。人神经胶质瘤和星形胶质细胞系购自美国典型培养物保藏中心。将胶质瘤细胞和293FT细胞在含有10％胎牛血清的DMEM中于5％CO2培养箱中于37摄氏度培养。将细胞接种在96孔板中。在0、24、48、72或96小时，使用细胞计数试剂盒-8测定活力。记录每个样品在450nm的吸光度。
    　　 miR-31模拟物，抑制剂和阴性对照由RiboBio合成。在出国看病网研究人员的实验室中制备了pcDNA3.1-CDK1。用Lipofectamine2000转染脑胶质瘤细胞。将sh-FOXD2-AS1和shCtrlcDNA转录本扩增后，将它们插入载体中，并共转染到293FT细胞中。胶质瘤细胞被产生的慢病毒颗粒感染。使用弹性蛋白选择稳定的细胞系。RNA序列示于表S1中。将1×103细胞接种到两孔板中。培养2周后，将细胞用1×磷酸盐缓冲盐水洗涤，固定并用0.百分之一　结晶紫染色30分钟。PBS洗涤并风干后，捕获菌落并计数。将细胞接种在24孔板中，并用200uL乙炔基-脱氧尿苷溶液标记2小时。在4％低聚甲醛中固定30分钟，在0.5％TritonX-100中渗透20分钟，再用30分钟Apollo荧光染色后，用Hoechst33342染色细胞。30分钟后，在荧光显微镜下拍摄图像以计算EdU阳性率。
    　　 使用TRIzol试剂裂解细胞或组织，以分离总RNA。用PrimeScriptRT试剂盒将提取的RNA反转录为cDNA。使用Nanodrop分光光度计测量RNA浓度和质量b。实时定量聚合酶链反应使用SYBRGreenqPCR混合试剂盒，以3-磷酸甘油醛脱氢酶和U6作为内部参照物进行定量，以定量mRNA和miRNA的相对水平，分别将融合度为80％-90％的细胞用70％的预冷乙醇固定过夜。随后，将细胞在37℃黑暗中用含有10mg每毫升RNase的1mg每毫升的碘化丙啶培养。30分钟后，通过荧光激活细胞分选Calibur流式细胞仪确定细胞凋亡。根据启动子区域的结合位点，将扩增的野生型和突变型序列插入pGL4载体中，以构建FOXD2-AS1-野生型，CDK1-野生型，FOXD2-AS1突变和CDK1突变向量。使用Lipofectamine2000，将细胞与野生型载体和miR-31共转染。使用来自Promega的双荧光素酶报告基因检测系统确定荧光素酶活性。
    　　 在含有苯基甲基磺酰氟的放射免疫沉淀测定裂解缓冲液中从裂解的细胞中分离提取的蛋白质，并通过BCA蛋白质测定试剂盒进行定量。蛋白样品在12.5％的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离，并上样到聚偏二氟乙烯上。在5％脱脂牛奶中阻塞60分钟后，将膜与第一抗体在4摄氏度反应过夜。之后，膜与辣根过氧化物酶标记的二抗反应1小时。通过化学发光试剂系统进行带暴露。石蜡包埋的组织切片在二甲苯中脱蜡并梯度脱水。将组织浸入百分之一　过氧化氢中10分钟，然后在三乙二胺四乙酸中煮沸15分钟。然后，将组织封闭并与抗CDK1抗体发生反应。使用激光扫描显微镜采集图像，并使用LSM510软件进行分析。数据表示为来自三次记录的平均值±SEM。使用GraphPadPrism6或R3.4.3软件进行统计处理。通过不成对的学生t检验比较正态分布的组间数据。通过Kaplan-Meier曲线分析生存率。P <.05被认为具有统计学意义。每个样品独立测定三次。
    　　 分析了可从TheCancerGenomeAtlas数据库获得的脑癌中lncRNA的RNA-Seq数据。FOXD2-AS1在神经胶质瘤中上调。根据对511例低级别胶质瘤和156例胶质母细胞瘤的分析，FOXD2-AS1水平与恶性程度呈正相关。此外，确定了正常组织，I-II级和III-IV级神经胶质瘤组织中的FOXD2-AS1水平。FOXD2-AS1水平随着神经胶质瘤的恶化而增加。根据TCGA数据，Kaplan-Meier曲线显示LGF和GBM患者的总生存期较差，这些患者表达高水平的FOXD2-AS1。同样，相对于正常星形胶质细胞SVGp12，胶质瘤细胞U87和U251中的FOXD2-AS1上调。总的来说，高水平的FOXD2-AS1表明神经胶质瘤患者的预后较差。为了研究FOXD2-AS1对神经胶质瘤细胞的生物学作用，构建了si-FOXD2-AS1，转染显着下调了胶质瘤细胞中的FOXD2-AS1水平。FOXD2-AS1沉默会降低胶质瘤细胞的活力，因为CCK-8结果显示。此外，菌落形成试验显示，在FOXD2-AS1敲低后，克隆形成的生长显着下降。EdU分析得出的结论是，FOXD2-AS1沉默会减弱胶质瘤的增殖能力。如流式细胞仪所示，神经胶质瘤细胞中FOXD2-AS1的下调提高了G1期的细胞比例。FOXD2-AS1沉默导致神经胶质瘤细胞G1期停滞和增殖抑制。
    　　 为了表征神经胶质瘤中FOXD2-AS1的分子机制，使用R软件和Pearson相关系数，在TCGA数据库中分析了LGG和GBM中FOXD2-AS1相关mRNA的表达。基因与基因组百科全书相关基因的通路富集分析显示FOXD2-AS1主要影响LGG和GBM的细胞周期进程。在胶质瘤组织中，FOXD2-AS1和CDK1的表达呈正相关。作为蛋白激酶复合物的高度保守的催化亚基，CDK1也被称为M相促进因子，它与恶性神经胶质瘤细胞中的G2相变有关。21TCGA分析表明，LGG和GBM中CDK1的上调与神经胶质瘤的肿瘤分期相关。同样，PCR分析也显示神经胶质瘤组织中CDK1的上调并与晚期肿瘤分级相关。此外，皮尔逊在TCGA数据库上的相关性分析还显示LGG和GBM中FOXD2-AS1和CDK1之间存在正相关关系。相应地，免疫组化分析表明，CDK1在弥漫性星形细胞瘤和GBM组织中阳性表达，表达的FOXD2-AS1含量很高。蛋白质印迹分析表明，FOXD2-AS1的敲低下调了胶质瘤细胞中CDK1的表达。有趣的是，在FOXD2-AS1沉默的情况下，CDK1沉默能够逆转胶质瘤细胞活力的降低和细胞周期的停滞。结果表明，CDK1是受FOXD2-AS1影响的神经胶质瘤进展的原因。
    　　 利用microRNA.org程序搜索FOXD2-AS1的可能靶标，最后选择了miR-31。相对于正常脑组织，神经胶质瘤组织中miR-31的表达下调。通过在神经胶质瘤细胞中转染si-FOXD2-AS1，miR-31水平升高。随后，主要讨论了miR-31在神经胶质瘤中的生物学功能。CCK-8分析表明，miR-31过表达的神经胶质瘤细胞活力降低。miR-31模拟物的转染可显着阻滞G1期的细胞。此外，miR-31模拟物和FOXD2-AS1-WT的共转染降低了萤光素酶活性。这些数据表明FOXD2-AS1使miR-31发挥作用，以调节神经胶质瘤细胞的生长。为了探索miR‐31调节神经胶质瘤细胞的机制，通过miRTarBase和miRanda预测了miR‐31的靶基因。观察到CDK1是miR-31的潜在靶标。以同样的方式，验证了神经胶质瘤细胞中CDK1和miR-31之间的结合关系。这些结果表明miR‐31抑制了CDK1转录。CCK-8分析显示，胶质瘤细胞中FOXD2-AS1的沉默抑制了胶质瘤细胞的增殖。此外，由于FOXD2-AS1的敲低，miR-31抑制剂的转染抵消了活力的降低，表明FOXD2-AS1是miR-31的海绵。si-FOXD2-AS1和miR-31抑制剂共转染后，胶质瘤细胞中CDK1蛋白的下调和FOXD2-AS1的敲低被部分逆转。因此，证实FOXD2-AS1通过抑制神经胶质瘤细胞中的miR-31增强CDK1表达。
    　　 某些内源性lncRNA可以通过充当ceRNA来影响miRNA的转录后调控，此后调控许多致癌过程。FOXD2-AS1得到显着上调神经胶质瘤和与肿瘤分级和神经胶质瘤的生存相关。敲低FOXD2-AS1可抑制神经胶质瘤细胞的增殖能力并使其细胞周期停滞。此外，还发现FOXD2-AS1调节环负责调节神经胶质瘤的进展。这一发现可能为神经胶质瘤治疗提供新的方向。测序数据表明，超过90％的人类基因组可以产生转录产物，但是只有2％的组织能够编码蛋白质。大多数非编码转录物称为ncRNA。ncRNA包括rRNA的，非编码RNA短，和lncRNAs。miRNA是小的ncRNA，可通过与miRNA响应元件结合而在转录后水平调控靶转录本。lncRNA是真核基因组中有超过200个核苷酸长。异常表达的lncRNA可能是参与肿瘤发生的主要因素。lncRNA和编码蛋白质的信使RNA通过竞争共享的miRNA相互作用。例如，GAS5的ncRNA通过揩的miR-21或miR-222，之后通过激活PTEN途径抑制肿瘤生长上调PTEN。lncRNAROR能够通过调节干细胞来调节多能干细胞的重编程因子OCT4，NANOG和SRY盒2作为CERNA。XIST通过肝癌中的miR-139-5p调节环促进细胞周期并抑制细胞凋亡。在神经胶质瘤中，HOXD-AS1使miR-130海绵化，从而通过靶向E2F8来调节神经胶质瘤的发展。16FOXD2-AS1促进多种癌症中的细胞生长。例如，FOXD2-AS1与miR-363-5p相互作用以调节S100A1表达，从而加重了鼻咽癌。在结直肠癌中，FOXD2-AS1使miR-185-5p发挥海绵作用，以介导增殖和转移能力。FOXD2-AS1轴在膀胱癌细胞的吉西他滨耐药性发展中起关键作用。出国看病网研究人员的发现表明，FOXD2-AS1在神经胶质瘤中上调，并与肿瘤分期相关。FOXD2-AS1的沉默抑制了神经胶质瘤的增殖能力并诱导了G2期阻滞。miR-31是一个经过充分研究的癌症相关基因。例如，miR-31的下调和RDX的上调预示了神经胶质瘤患者的OS较差。通过生物信息学分析，证实FOXD2-AS1与神经胶质瘤中的miR-31结合并对其负调控。
    　　 细胞周期蛋白依赖性激酶是细胞周期进程中的关键介质。出芽的酵母仅表达一种CDK，通过配对9个细胞周期蛋白伴侣来调节不同的细胞周期事件。CDK1可以磷酸化14个TF中的11个，从而在酵母细胞周期中促进或抑制其活性。在酵母，CDK1，与G1或G2细胞周期蛋白复合物，控制细胞周期。CDK1还诱导G2和G1基因的表达。在这里，CDK1是miR-31的潜在靶标，诱导神经胶质瘤细胞G1期停滞。miR-31下调增加了神经胶质瘤中CDK1的表达。这些结果表明，miR-31通过靶向CDK1来调节细胞周期。FOXD2-AS1的沉默释放了miR-31以下调CDK1。FOXD2-AS1在神经胶质瘤中上调，并与肿瘤分期和神经胶质瘤的存活相关。因此，FOXD2-AS1可能是神经胶质瘤的预后因素。FOXD2-AS1沉默可减轻神经胶质瘤胶质瘤，表现为增殖抑制和细胞周期停滞。作为ceRNA，FOXD2-AS1用miR-31调节CDK1的水平。神经胶质瘤中的FOXD2-AS1调节环为神经胶质瘤提供了潜在的治疗靶标。
 
出国看病概况

海外医疗在国外发展较为成熟，比如在欧美等医疗技术发达国家，很多医院都设有国际病人办公室并配备多语种医学专业翻译人员，就医流程和模式都已相对成熟。在国内，海外医疗虽然还属于新兴行业，但发展势头迅猛，发展潜力巨大，市场前景广阔。
　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
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靶向药物
 

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