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抑制神经胶质瘤中的细胞增殖
  • 　　神经胶质瘤是成年人中枢神经系统中最具侵略性的肿瘤，占肿瘤的70％以上。尽管在治疗策略，如手术切除，化学疗法和放射进展，神经胶质瘤的预后仍然很差和IV级神经胶质瘤的中位生存时间是约12至15个月。主要原因差的存活是神经胶质瘤的分子机制仍是未知。因此，重要的是揭示诱导神经胶质瘤发展的分子机制，以便开发出更有效的方法。MicroRNA是小的非编码RNA，其长度约为22个核苷酸。在的miRNA胶质瘤的进展涉及，并且它们可以被视为诊断生物标志物和治疗靶标。最近的研究表明的miR-628-5p在几个肿瘤中失调。miR-628-5p在上皮性卵巢癌和前列腺癌中起抑癌作用。已经有显示的miR-628-5p在胶质瘤中的作用尚未见报道。DDX59属于RNA解旋酶家族。RNA解旋酶在RNA代谢的大多数方面起着关键作用。突变的DDX59参与了肺癌的发展。从癌症基因组图谱和中国脑胶质瘤基因组图谱数据库，发现DDX59在脑胶质瘤表达。但是，DDX59在神经胶质瘤中的分子机制尚不清楚。人胶质瘤组织和细胞中的miR-628-5p降低。调节神经胶质瘤的生长和细胞周期。而且，miR-628-5p通过直接靶向DDX59而充当新型肿瘤抑制物。这些发现证实，miR-628-5p可能是神经胶质瘤治疗的靶标。
    　　 miRNA的表达是从CGGA获得的。非肿瘤脑组织和神经胶质瘤临床组织得自徐州医科大学附属淮安医院神经外科。在27个样本中，有5个是NBT，有9个是低度神经胶质瘤样本，有13个是高度神经胶质瘤样本。DDX59表达的数据是从CGGA和TCGA数据库获得的。正常人星形胶质细胞使用短串联重复DNA图谱。胶质瘤细胞在补充有10％胎牛血清的Dulbecco's改良Eagle培养基中培养。为了研究miR-628-5p的表达，使用TaqManmiRNA逆转录试剂盒进行了定量实时聚合酶链反应。miR-628-5p的过表达是通过用pre-miR-628-5p慢病毒载体转染细胞实现的。CDK2，CDK4，细胞周期蛋白D1，DDX59，AKT和p-AKT的表达模式均使用特异性抗体检测到。肌动蛋白被用作加载对照。抗CDK2，CDK4，CCND1，DDX59，AKT，p‐AKT和肌动蛋白的一抗。每个实验至少进行三个生物学重复。当细胞分别培养24、48、72和96小时时，进行细胞计数试剂盒-8测定。然后，将CCK-8溶液添加到每个孔中。最后，将神经胶质瘤细胞系温育3小时，然后在450nm下测量。孵育36小时后将细胞用Alexa-Fluor594反应混合物和苯基吲哚染色。最后，用荧光显微镜检查样品并照相。将约400个转染的U87和T98细胞接种在六孔培养板上。孵育约2周后，将细胞固定在4％多聚甲醛中，并用Giemsa染色并计数菌落。通过以1000rpm离心5分钟收集转染的U87和T98细胞，并在-20°C的70％乙醇中固定。转染后48小时，使用荧光素酶报告基因测定系统检测到相对荧光素酶活性。
    　　 将十只裸鼠随机分成两组。裸鼠注射了过表达的miR-628-5p或其阴性对照U87细胞。收获细胞并重悬于L15中。使用立体定位仪将U87细胞颅内注射到裸鼠的纹状体中。在第7、14和21天使用体内成像系统计算肿瘤体积。注射后30天，将小鼠处死，并收集大脑进行分析。进行了免疫组织化学测定以确定Ki-67在异种移植物中的表达。首先，将异种移植肿瘤组织固定在4％多聚甲醛中，包埋在石蜡中，并切成5μm切片。其次，在4°C下使用Ki-67抗体将组织切片染色过夜，然后在室温下与生物素标记的免疫球蛋白一起孵育1小时。最后，在光学显微镜下对组织成像。所有实验均进行至少三个生物学重复，并使用GraphPadPrism5软件分析数据。使用Studentt检验对数据进行统计评估。P?<.05被认为具有统计学意义。
    　　 为了确定miR-628-5p在神经胶质瘤中的功能，使用CGGA数据库分析了198个神经胶质瘤组织中的表达。结果表明，低LGG中的miR-628-5p表达高于HGG。通过qRT-PCR调查了27个样品中的miR-628-5p表达，包括5个NBT，9个LGG病例和13个HGG病例。与NBT相比，LGG和HGG患者的miR-628-5p表达降低。此外，HGG病例的miR-628-5p表达低于LGG病例。最后，研究了miR-628-5p在U87，T98和正常脑星形胶质细胞中的表达水平。与NHA相比，U87和T98细胞中的miR-628-5p被下调。为了探讨miR-628-5p在神经胶质瘤中的功能，将miR-628-5p或其阴性对照过表达了U87和T98细胞。通过qRT-PCR评估转染效率。在集落形成试验中，miR-628-5p的过表达阻止了U87和T98细胞的增殖。EdU分析表明，相对于阴性对照，miR-628-5p转染的细胞的生长受到显着抑制。CCK-8分析表明，miR-628-5p转导的U87和T98细胞的生长能力明显低于对照组。因为增殖的变化通常与细胞周期进程有关，所以出国看病网的研究人员检测到生长抑制是否参与细胞周期阻滞。miR-628-5p过度表达的U87和T98细胞的细胞周期被阻滞在G1期。还测量了在过度表达miR-628-5p或其对照的细胞中细胞周期相关蛋白CDK2，CDK4和CCND1的表达。所有这些蛋白质都是G1期的调节剂。总的来说，结果表明，miR-628-5p减弱了神经胶质瘤细胞的增殖。
    　　 为了寻找miR-628-5p抑制神经胶质瘤细胞增殖的分子机制，使用TargetScan和miRanda算法确定了miR-628-5p的潜在靶标。DDX59是miR-628-5p的候选目标。然后，探索双荧光素酶报告系统，以确定miR-628-5p是否可以直接结合DDX59的3'-UTR。通过Western印迹分析评估，过表达的miR-628-5p降低了DDX59的蛋白质水平并抑制了p-AKT的表达水平。此外，在TCGA和CGGA数据库中检查了DDX59mRNA表达模式。与NBT相比，胶质瘤组织中DDX59的表达显着增加。与LGG组织相比，HGG组织中的DDX59表达也上调。Pearson的相关分析显示，HGG组织中的miR-628-5p与DDX59之间呈显着负相关。在48小时后，siRNA-DDX59胶质瘤细胞中DDX59的蛋白表达下降了50％以上。使用U87和T98细胞中的集落形成和Edu分析研究了DDX59沉默对细胞增殖的影响。发现DDX59抑制作用显着抑制神经胶质瘤细胞的生长。然后，DDX59组合式诱导的神经胶质瘤细胞周期停滞在G1期。这些结果表明，与miR-628-5p过表达相同，DDX59敲低可抑制神经胶质瘤细胞生长并诱导G1阻滞。将DDX59或其对照转染到过表达U87和T98细胞的miR-628-5p中。这些数据表明，miR-628-5p和DDX59的过度表达消除了miR-628-5p的抑制作用。同时，在外源导入DDX59后，p-AKT和DDX59的表达水平得以恢复。这些结果表明，DDX59是神经胶质瘤细胞中miR-628-5p的功能靶标。裸鼠接受过表达miR-628-5p的U87细胞或其阴性对照。与miR-NC组相比，miR-628-5p组的异种移植瘤显示出明显的肿瘤缩小。Westernblot表明，miR-628-5p组中DDX59和p-AKT蛋白的表达下调。Ki‐67染色显示miR‐628‐5p组肿瘤的增殖细胞少于miR‐NC组肿瘤。miR-628-5p通过抑制DDX59抑制了体内胶质瘤的生长。
    　　 胶质瘤是人类中枢神经系统最常见和恶性的肿瘤。虽然极大地促进了神经胶质瘤治疗几十年来已取得胶质瘤的基本机制仍然不明确，导致预后差。在这项研究中，探索了miR-628-5p及其靶基因DDX59在神经胶质瘤增殖中的功能。充当肿瘤抑制因子的miRNA在神经胶质瘤的发展中起着至关重要的作用。miR-628-5p已经报道在上皮性卵巢癌和前列腺癌的肿瘤抑制基因。以前尚未在神经胶质瘤中报道过miR-628-5p。最初研究人员通过CGGA数据库分析发现miR-628-5p表达与神经胶质瘤呈负相关。然后，分析了miR-628-5p在临床组织和神经胶质瘤细胞中的表达。结果显示，神经胶质瘤的组织和细胞中miR-628-5p升高。为了探索miR-628-5p在神经胶质瘤中的作用，通过转染miR-628-5p慢病毒在U87和T98细胞中稳定表达了miR-628-5p。在CCK-8，集落形成和Edu分析中稳定表达miR-628-5p的U87和T98细胞表现出细胞增殖能力下降。MiR-628-5p可能在G1期阻滞神经胶质瘤细胞并抑制CDK2，CDK4和CCND1蛋白的表达。此外，为了探索神经胶质瘤中miR-628-5p的潜在分子机制，通过TargetScan和miRanda算法将DDX59预测为miR-628-5p的靶标。然后，荧光素酶报告基因检测证明DDX59是神经胶质瘤中miR-628-5p的直接靶标。DDX59属于DEADboxRNA解旋酶家族，是一种表征较差的蛋白质。许多DEAD盒蛋白都参与细胞生长。已发现DDX59参与口咽数字综合征的发病机理和肺癌的发展。萤光素酶报告基因检测确定DDX59是神经胶质瘤中miR-628-5p的直接靶标。在稳定表达miR-628-5p的神经胶质瘤细胞中DDX59表达降低。还发现临床样品中DDX59蛋白与miR-628-5p水平呈负相关。观察到与miR-628-5p过表达相同，沉默DDX59可以显着抑制神经胶质瘤细胞的增殖。更重要的是，将DDX59重新引入到过表达miR-628-5p的细胞中可阻断miR-628-5p对神经胶质瘤细胞增殖的作用。总之，结果表明，miR-628-5p被直接调节并通过直接靶向DDX59抑制神经胶质瘤的进展。因此，DDX59轴可能是神经胶质瘤治疗的有希望的治疗靶标。
 
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