出国看病
 
胶质瘤中遗传损失靶向核糖体
  • 　　细胞动态平衡需要精确调节蛋白质水平。在诸如细胞转化的病理状态下，蛋白质组会发生巨大变化。已经进行了大量的努力来研究导致异常RNA转录调控的事件如何产生癌症转录组。然而，总的转录活性和蛋白质丰度之间有重要的区别。蛋白质降解的缺陷，例如影响vonHippel-Lindau泛素连接酶复合物的缺陷和内质网相关的蛋白质降解途径，可能部分地解释这种差异，但是图像已经出现的怎样的关键的癌基因蛋白水平通过在从头的蛋白质合成变更失调。原点，维护和肿瘤细胞进展过程中发生异常的翻译控制。癌细胞的生长增强通常需要在全球蛋白合成的增加，它强烈地与增加的核糖体的活性。然而，最近已经变得清楚的是此图象甚至比以前认为的更为复杂，因为致癌信号和应激相关病症可以增强特异性转录物翻译，即使在受限制的总蛋白质的合成上下文。
    　　 尽管就RNA翻译和蛋白质产生而言，几种表型可能涉及上述表型，但核糖体生物发生和蛋白质合成机制的组成部分的改变可能在这些过程中起着核心作用。在这一点上，核糖体蛋白的突变发生在Diamond–Blackfan贫血中，该综合征的特征是对癌症的敏感性增加。在X连锁性先天性角化不全症中，这是另一种与癌症风险增加相关的综合征，其主要突变基因是DKC1，一种伪尿苷合酶，可在转录后水平修饰核糖体RNA。在DKC1缺陷引起改变的内部核糖体进入位点相关的平移方案。除了假尿苷，核糖体RNA表现出另一种转录后修饰：5-甲基胞嘧啶存在。既不在人类癌症也不RNA甲基转移用于细胞转化的作用，为5-甲基胞嘧啶在rRNA基因的rRNA扭曲5-甲基胞嘧啶轮廓的存在已被正确地表征。在这里，显示NSUN5，作为人类28SrRNAC3782位置的RNA甲基转移酶，是一种具有肿瘤抑制特性的酶，在神经胶质瘤中会发生表观遗传损失，从而导致蛋白质合成中的整体缺陷和特定蛋白的启动。适应细胞应激条件的翻译程序。最重要的，因为它也发生与异柠檬酸脱氢酶的突变，NSUN5DNA甲基化相关的沉默在人类gliomagenesis识别患者具有良好的临床结果，它是受人的优异功能的存在这种肿瘤类型。
    　　 人神经胶质瘤细胞系DBTRG-05MG，M059J，A172和LN229购自典型培养物保藏中心；CAS-1是从IRCCS的生物库获得的，它是由圣马蒂诺大学的IRCIstitutoNazionale所组成的。KS-1购自日本研究生物资源库。细胞系均在补充有10％v/v胎牛血清和1％v/v青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle's培养基中培养。人三级神经胶质瘤细胞系SW1088和BT142mut/购自典型培养物保藏中心，MOG-G-CCM购自Sigma-Aldrich。根据供应商的要求培养这些细胞系。通过亚硫酸氢盐基因组测序和DNA甲基化微阵列确定NSUN5基因的5'端启动子相关的CpG岛的DNA甲基化状态。对于所有方法，使用EZDNA甲基化金试剂盒将基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化。对于亚硫酸氢盐基因组测序，每个样品至少询问八个单独的克隆，并在每种情况下计算甲基化频率。使用BioEdit软件分析结果，并使用BSMap软件绘制甲基化胞嘧啶图。儿科神经胶质瘤中NSUN5CpG甲基化状态通过焦磷酸测序法使用补充关键资源表中显示的引物序列确定。使用的DNA甲基化阵列是InfiniumHumanMethylation450BeadChip。使用带有背景校正的“对照归一化”，使用IlluminaGenomeStudio软件对原始荧光强度值进行归一化。然后将标准化强度用于计算DNA甲基化水平。
    　　 对于实时定量逆转录-PCR实验，使用MaxwellRSC设备上的SimplyRNA试剂盒提取总RNA，并使用带有oligo引物的ThermoScriptRT-PCR系统进行再活化处理，时间为0.5uM，持续72h。对于免疫印迹测定，出国看病网研究人员用300uLRIPA缓冲液提取细胞沉淀和脑白质样品。将在氨基末端包含FLAG-Tag的NSUN5的cDNA序列克隆到EcoRI和XbaI限制性酶切位点之间的pLVX-IRES-ZsGreen1表达质粒中。含该构建慢病毒共转染通过HEK-293T细胞用重组pLVX-IRES-ZsGreen1，psPAX2和pMD2.G，采用jetPRIME产生转染试剂并遵循供应商的说明。6小时后移出转染混合物，并用新鲜培养基代替。72小时后，收集含病毒的上清液，进行0.45uM过滤，并在感染前于4°C保存。通过慢病毒转导将重组产物随机插入A172和LN229神经胶质瘤细胞系的基因组中。5次传代后，通过FACS分选绿色荧光细胞，并在补充有10％FBS和1％v/v青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养。有关引物序列，请参阅补充的关键资源表。
    　　 设计了四个针对NSUN5mRNA的不同序列基因特异性短发夹RNA分子，并将其转导到DBTRG-05MG和CAS-1胶质瘤细胞系中。针对MSS2酵母mRNA的shRNA用作加扰。将所有shRNA分子连接至pLVX-shRNA2-ZsGreen质粒。每个编码质粒的10微克与7.5微克PS-PAX2和PMD2.G质粒的2.5微克混合，使用jetPRIME转染试剂。在RT温育10分钟后，将转染混合物逐滴加入到含有HEK293-TLV慢病毒包装细胞且融合率为80％的10cm培养板上。72小时后，将具有高滴度慢病毒颗粒的培养基过滤0.45um。在含病毒的培养基中培养DBTRG-05MG和CAS-1胶质瘤细胞系24小时。5次传代后，通过FACS分选绿色荧光细胞，并在补充有10％FBS和1％v/v青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养。
    　　 所有小鼠实验均已根据Valld'Hebron研究所的机构动物护理委员会的指导原则批准并进行。立体定向地将1×106细胞接种到9周龄无胸腺小鼠Nude-Foxn1nu小鼠的右脑半球纹状体中。为了估计肿瘤的大小，在IVIS的Xenogen-CCD照相机中对接种的肿瘤细胞的荧光素酶活性进行了定量。所有小鼠实验均已获得Valld'Hebron研究所机构动物护理委员会的批准并根据其指导方针，并与欧盟和国家指令相一致。3×105将A172和LN229或DBTRG-05MG细胞立体定向接种到右脑半球体纹状体中，接种8周岁的Balb/c裸鼠。出国看病网研究人员每组接种了7只动物。肿瘤进展通过使用精诺生物发光IVIS测量来监测(R)谱。接种后第17天对小鼠实施安乐死。根据Bellvitge生物医学研究所的机构动物护理委员会的指导，批准并进行了所有小鼠实验。为了使肿瘤生长进入大脑，分别将LN229和DBTRG-05MG的3×105或1.5×106细胞接种到9体的纹状体中，或每个细胞系分别有10只小鼠。
    　　 用RIP缓冲液中的LN229总提取物过夜进行免疫沉淀0.5mMDTT，0.5％NP40，蛋白酶抑制剂。然后将小珠用RIP缓冲液洗涤3次，然后将10％的小珠在Laemmli缓冲液1x中煮沸，并加样到蛋白质凝胶上以检查免疫沉淀效率。通过添加1mLTRIzol试剂，从剩余的90％的珠子中提取下拉的RNA。苯酚萃取和异丙醇沉淀后，进行DNase处理步骤，并将最终沉淀重新悬浮在水中。然后将等量的每个样品进行逆转录，并通过定量PCR进行分析。按照EpigentekMethylampRNA亚硫酸氢盐转化试剂盒的说明进行RNA亚硫酸氢盐转化和测序。使用ThermoScriptRT-PCR系统和随机六聚体引物将所得的亚硫酸氢盐修饰的RNA转化为cDNA。有关目标序列的PCR引物可在补充的关键资源表中找到。扩增子PCR条带进行纯化并连接到pGEM-TEasy载体中，转化的，并且如在DNA甲基化分析先前所描述的测序。如Suppl中所述进行亚硫酸氢盐RNA深度测序方法。
    　　 在不同的实验条件下整体蛋白质合成中评估通过氧-炔丙基嘌呤霉素掺入使用点击-IT新生蛋白质OPP试剂和亮氨酸掺入。如Suppl中所述，通过根据深度测序RNA转录组数据将核糖体谱分析深度序列数据标准化为转录本长度和总转录本丰度，确定每种RNA的翻译效率。基因集用于对公共GSEA签名数据库集合和DAVIDWeb服务中包含的GO-生物学过程和KEGG途径进行基因集过度表达分析。最后考虑了由超几何试验得到的顶部基因簇，FDR调整后的P值小于0.05。来自选定基因的5'UTRDNA序列被用于进行基序识别分析。使用MEME套件4.12.0中的RegRNA2.0和FIMO软件执行CERT，TOP，PRTE和uORF基序扫描。IRESPredWeb服务和Infernal软件用于识别IRES主题。使用QGRSMapper软件识别G4四链体。如先前所述进行SILAC。使用SILAC-Lys8-Arg10-Kit培养基进行SILAC标记。使用OrbitrapFusionLumos质谱仪和EasyLC对肽混合物进行分析。所有数据均使用Xcalibur软件v3.0.63获取。ProteomeDiscoverer软件套件和Mascot搜索引擎用于肽的鉴定和定量。在SwissProt数据库中搜索了样本，其中包含对应于人类条目，常见污染物列表和所有相应诱饵条目的条目。过滤得到的数据文件，以使FDR小于1％。
    　　 使用磺基罗丹明B分析对药物暴露后的神经胶质瘤细胞系进行IC50研究。简而言之，在暴露于九种浓度不断增加的脱氧nyboquinone后48小时，除去培养基，并向孔中添加100uL10％三氯乙酸，在4°C下将细胞固定1h。然后将细胞用蒸馏水洗涤两次，并在30分钟内用100uL的0.4％SRB的1％乙酸溶液染色，遮光，并用1％乙酸洗涤两次。然后将SRB溶解在Tris碱中，并使用酶标仪测定540nm的光学密度。对于最初的神经胶质瘤验证队列，回顾性收集了来自四个不同中心的115个福尔马林固定的石蜡包埋肿瘤组织。从1989年至2018年进行了组织学回顾。大多数患者接受了基于替莫唑胺或不联合放疗的治疗，并且可获得IDH1突变状态和MGMT甲基化的分子分析。115例病例中只有23例具有共删除1p19q状态。患者已征得他们的知情同意以参加研究，该研究已获得每个机构审查委员会的伦理批准。这些案件已签署书面知情同意书，并在各自的出版物描述进行组织学回顾。
    　　 变量之间的关联，通过评估χ2检验，Fisher精确检验，Mann-Whitney检验，韦尔奇吨试验，威尔科克森配对检验或Spearman相关每当指示。使用Kaplan–Meier图和对数秩检验来估计总体生存率。使用Windows的SPSS和Windows的GraphPadPrism5进行统计分析。P小于0.05的值被认为具有统计学意义。所有统计检验都是双面的。GBM和LGGTCGA原发肿瘤样品的甲基化和表达值是从NCI的GenomicDataCommons获得的。从COSMIC细胞系数据库获得对应于神经胶质瘤细胞系的值。通过计算Spearman秩相关检验和相关的rho系数获得相关性。所有获得的深度测序数据已通过以下链接存放在SRA中。
    　　 为了确定拟议的核糖体RNA胞嘧啶甲基转移酶NSUN5，NSUN1和NSUN4在人类肿瘤发生中的候选遗传和表观遗传缺陷，首先对1001个人类癌细胞系进行了数据挖掘，其中最近确定了外显子组的突变，转录组学，基因拷贝数和DNA甲基化谱。现有的基因组数据未表明所考虑的细胞系中存在NSUN5，NSUN1或NSUN4突变，扩增或缺失。尽管未发现所述基因的遗传缺陷，但启动子CpG岛超甲基化引起的转录沉默是使人类癌症基因失活的另一种机制。与NSUN1和NSUN4启动子相关的CpG岛在研究的细胞系中未甲基化。NSUN5启动子CpG岛在所研究的神经胶质瘤来源的细胞系。微阵列表达结果的数据挖掘表明，NSUN5甲基化，用在神经胶质瘤细胞系中。除了神经胶质瘤来源的恶性肿瘤以外，出国看病网研究人员的数据集中还发现NSUN5启动子CpG岛在其他肿瘤类型中未甲基化，除了甲状腺癌，胆道癌20％），自主神经节和软组织肉瘤。在所有研究的正常人类组织中，NSUN5启动子CpG岛未甲基化。
    　　 确定了上述NSUN5CpG岛甲基化谱后，更详细地研究了它们与神经胶质瘤细胞系中RNA和蛋白水平上NSUN5基因可能的转录失活的关系。使用包含转录起始位点相关的CpG岛的引物，对胶质母细胞瘤细胞系DBTRG-05MG，MO59J，CAS-1，A172，LN229和KS-1中的多个克隆进行了亚硫酸氢盐基因组测序。发现LN229的NSUN5，A172的5'端区域，和在与正常脑白质所示，而DBTRG-05MG，CAS-1，和MO59J细胞未甲基化。这些结果验证了通过微阵列方法获得的DNA甲基化模式。在所有情况下，正常的星形胶质细胞，胎儿脑和不同的大脑区域均未甲基化。Suppl中显示了用于DNA甲基化测定的阳性和阴性技术对照。NSUN5-高甲基化神经胶质瘤细胞系LN229，A172和KS-1最低限度地表达的RNANSUN5转录物和蛋白质，如通过分别定量实时PCR和免疫印迹。相反，在NSUN5启动子上未甲基化的神经胶质瘤细胞系表达NSUN5RNA和蛋白质。用DNA脱甲基化剂5-氮杂-2-脱氧胞苷甲基化成胶质细胞瘤细胞系的治疗恢复NSUN5表达在RNA和蛋白水平与在启动子CpG岛。将研究扩展到三种III级神经胶质瘤细胞系：BT142mut/-，具有纯合的R132H突变和SW1088和MOG-G-CCM。在BT142mut/-细胞中发现了NSUN5的DNA甲基化相关沉默，而其余两个细胞系未甲基化并表达了NSUN5。用DNA甲基化抑制剂处理甲基化细胞系BT142mut/-，可在RNA和蛋白质水平上恢复NSUN5的表达。对16例来自裸鼠移植的原发性神经胶质瘤的患者异种移植物的研究表明，NSUN5在3例中发生了甲基化。RNA可用于四种情况，并且NSUN5高度甲基化与转录水平降低相关。
    　　 一旦证明胶质瘤细胞系中存在NSUN5CpG岛超甲基化相关的转录损失，出国看病网研究人员便研究了其对这些细胞生长的贡献。为此，分析NSUN5-超甲基化胶质母细胞瘤细胞系LN229和A172中NSUN5表达恢复的作用。一旦NSUN5的有效转染中，通过测量荧光素酶活性进行使用LN229和A172GFP-吕克细胞系，以及量化肿瘤生长随时间脑内小鼠异种移植实验，研究在体内神经胶质瘤细胞的生长。与单独空载体转染的细胞相比，从NSUN5转染的LN229和A172细胞系获得的肿瘤在接种后10天和17天的大小显着减小。在相反的实验中观察到，与未经处理的shRNAs细胞相比，未经甲基化的DBTRG-05MG细胞经历了NSUN5shRNA介导的耗竭，肿瘤的大小显着增加。对裸鼠皮下注射癌细胞的研究提供了相似的结果：与空载体转染的肿瘤相比，NSUN5转染的LN229细胞起源的肿瘤的体积和重量明显更低，而NSUN5shRNA介导的肿瘤未甲基化的DBTRG-05MG细胞系的耗竭增加了衍生肿瘤的体积和重量。比较裸鼠原位注射NSUN5shRNA的耗竭和争夺的DBTRG-05MG细胞，发现NSUN5的下调与总体生存期较短有关，而转染介导的LN229甲基化的NSUN5表达的恢复细胞与更长的总生存期有关。通过在高甲基化胶质母细胞瘤细胞中转染的NSUN5还原也减少了体外增殖，而其在NSUN5未甲基化细胞中的shRNA介导下调增加了细胞活力。胶质瘤相关基因IDH1，TET1或TET3在所研究的细胞系中是野生型，观察到这三种蛋白质在三种NSUN5未甲基化和甲基化神经胶质瘤细胞系中的相似表达。这些蛋白质的表达在LN229细胞中恢复NSUN5或在DBTRG-05MG细胞中耗竭后都没有改变。结果表明NSUN5在神经胶质瘤中具有特定的肿瘤抑制作用。
    　　 在人类细胞中的NSUN5的活性和目标尚未正式确定，但酵母酿酒酵母和蠕虫线虫的同系物是负责甲基化C2278分别在25SrRNA和26SrRNA中的C2381中。系统发育分析表明，酵母和蠕虫25S和26SrRNA中的C2278和C2381位置分别对应于人28SrRNA的C3782位置。这个网站是放置在大核糖体亚基的肽酰转移酶中心附近，表明它与核心核糖体功能有关。因此，出国看病网研究人员着手证明NSUN5负责在神经胶质瘤模型中甲基化C378228SrRNA。为了这个目的，首先表明28SrRNA的表示NSUN5的结合靶，因为NSUN5的免疫特异性检索在RNA下拉测定法。接下来对从NSUN5非甲基化胶质母细胞瘤细胞系DBTRG-05MG，MO59J和CAS-1，以及NSUN5超甲基化和转录沉默的LN229，A172和KS-1胶质母细胞瘤细胞系中提取的28SrRNA的多个克隆进行了亚硫酸氢盐测序。虽然表达NSUN5的DBTRG-05MG，MO59J和CAS-1细胞显示出高水平的C378228SrRNA甲基化，但经历NSUN5表观遗传失活的LN229，A172和KS-1细胞却缺乏C378228SrRNA甲基化。的NSUN5的治疗胶质母细胞瘤的甲基化的细胞系用DNA脱甲基化剂5-氮杂-2-脱氧胞苷不仅恢复NSUN5表达，而且还回收C378228SrRNA的甲基化。LN229和A172细胞显示出NSUN5表观遗传沉默，在通过转染恢复NSUN5活性后，也恢复了C378228SrRNA甲基化。
    　　 由于存在多个无法恢复C378228SrRNA甲基化的工程化突变，构建NSUN5催化惰性形式。绿豆核酸酶保护试验证实C378228SrRNA甲基化的RNA亚硫酸氢盐测序数据。具有NSUN5表观遗传缺失的LN229细胞在核和细胞质部分均被C378228SrRNA甲基化所消耗，而NSUN5转染恢复了两个区室的甲基化状态。为了证明实验方法的特异性，在LN229和A172细胞中转染NSUN5不会改变其他两种候选人核糖体RNA甲基转移酶NSUN1和NSUN4的水平。还研究短发夹RNA方法在表达NSUN5和未甲基化的神经胶质瘤细胞系DBTRG-05MG和CAS-1中对NSUN5的稳定敲低。在有效的NSUN5shRNA介导的下调后，在DBTRG-05MG和CAS-1细胞的C378228SrRNA位点观察到了甲基化不足。在III级神经胶质瘤细胞系中也观察到了NSUN5表观遗传沉默与C378228SrRNA甲基化之间的联系：BT142mut/-细胞具有NSUN5的DNA甲基化相关沉默，显示了未甲基化的C378228S位点，而SW1088和MOG-G-CCM均显示甲基化的C378228SrRNA位置。
    　　 出国看病网研究人员还从候选方法转变为无偏倚的基因组设置，以识别NSUN5目标的范围。为了在整个人类转录组中绘制NSUN5依赖的修饰的胞嘧啶位点，将亚硫酸氢盐转化的细胞RNA与下一代测序结合在NSUN5转染的LN229胶质瘤细胞和空载体转染的细胞中。在有效恢复NSUN5表达后，在NSUN5转染后，甲基化水平达到90％以上的RNA中唯一的胞嘧啶位点是28SrRNA的C3782位置。该方法的特异性通过鉴定28SrRNA中唯一的其他甲基化胞嘧啶而得以进一步证实，C4447位置与小鼠28SrRNA中的C4099位置相对应，并建议由其他RNA-甲基转移酶NSUN1介导在空载体和NSUN5转染的细胞中都被完全甲基化。因此，所有结果表明NSUN5是人C378228SrRNA甲基转移酶，并且神经胶质瘤细胞中NSUN5的表观遗传沉默阻止了此处考虑的rRNA转录物中这种化学修饰的形成。
    　　 为了评估去除28SrRNA的C3782位置的甲基的结构影响，通过分子动力学模拟了人类28S亚基在5mC3782附近的一个子区域。用甲基化的C3782对系统进行的仿真显示，甲基化的C3782和C3781之间存在稳定的甲基-π相互作用，而在未甲基化的系统中这种相互作用消失了。甲基的去除显着改变了C3781-G3810碱基对和C3809位置的凸起结构。凸起与位于28S亚基边缘的小发夹相互作用，暴露于核糖体的P位。在未甲基化的系统，所述发夹经历构象变化从P站点空腔移开，表示相对于甲基化形式。这个小发夹的作用是通过几个残基直接与P位的tRNA分子甚至与mRNA相互作用，这对于确保三级复杂rRNA–tRNA–mRNA的结构稳定性至关重要。在模拟中观察到的甲基去除后，发夹上的扭曲可能足以通过改变P位构象来损害正常的蛋白质合成。
    　　 与空载体和NSUN5转染的LN229细胞相比，没有观察到核糖体分布，rRNA成熟和总rRNA水平方面的主要影响。因此想知道NSUN5和C3782丢失会影响癌细胞中蛋白质水平的更具体方式。尽管总体上翻译率在癌细胞中通常会增加，但由于各种条件，肿瘤在生长过程中可能会遇到不利的微环境。癌细胞在这种压力条件下生存的一种方法是减少整体翻译，从而防止这种耗能的过程并避免积累受损和错误折叠的蛋白质。因此，想知道神经胶质瘤细胞中NSUN5表观遗传失活介导的28SrRNA甲基化位点的丢失是否可以这种方式起作用。为了测量整体蛋白质的合成，在实验模型中定量了将O-炔丙基-嘌呤霉素掺入新生蛋白质中。使用培养基中的H2O2产生氧化应激，发现具有NSUN5表观遗传损失的三种胶质母细胞瘤细胞系显示出总体上低于三种NSUN5未甲基化细胞系的整体蛋白质合成，MO59J和CAS-1。在NSUN5NSUN5表达的转染介导的恢复表观遗传学缺陷LN229细胞显著增加全球蛋白质合成。在另一个应力状态，营养剥夺用空载体转染的NSUN5表观遗传学缺陷LN229细胞还显示蛋白质合成的低的总体水平，而NSUN5表达的转染介导的恢复显著增加全球蛋白质合成。使用[3H]亮氨酸掺入来测量整体蛋白合成获得了相似的结果：表观遗传失活的LN229细胞中NSUN5活性的恢复显着增强了[3H]亮氨酸掺入，从而增强了整体蛋白合成。NSUN5未甲基化的CAS-1细胞系中NSUN5shRNA介导的下调具有相反的作用。总体而言，结果表明启动子CpG岛对NSUN5的转录失活和28SrRNA中甲基化的C3782介导的丢失与整体蛋白质合成的限制有关。
    　　 提及的是除了全球蛋白质合成的抑制如上所述，人类肿瘤表现出与细胞应激应对另一种方法：替代平移方案中涉及的应力适应性反应的活化。为了确定直接依赖于NSUN5表观遗传失活后C378228SrRNA甲基化损失的候选翻译程序的存在，在没有HSC的情况下比较了空载体和NSUN5转染的LN229细胞，进行了RNA-Seq和Ribo-seq分析。恢复了NSUN5表达的胶质瘤细胞在不到2％的转录本中表现出RNA丰度差异，而98％的转录本丰度保持不变。另一方面，分析了相同条件下核糖体占用的差异。观察有7.2％的转录本，其核糖体谱分析存在差异。具有增强翻译效率的RNA被定义为那些在RNA-SEQ不变，但上调核糖SEQ。与NSUN5转染的细胞相比，在LN229空载体转染的细胞中鉴定了1987个转录物，翻译效率更高。通过应用通用线性模型，通过对RNA-seq和Ribo-seq测量值的过度分散分析计算翻译效率值，从而证实了这些观察结果。
    　　 出国看病网研究人员没有观察到这些NSUN5控制的转录物的5'-非翻译区中已知调节基序的过度表达，这些转录物包括CAP独立元件，例如内部核糖体进入位点，或CAP独立元件，例如G-四链体，富含胞嘧啶的翻译调节剂，末端寡嘧啶束，富含嘧啶的翻译序列和上游开放阅读框。编码萤火虫和海肾萤光素酶的双顺反子报告质粒的使用进一步证明了NSUN5对CAP依赖性和CAP依赖性翻译的影响）。为了更好地表征在NSUN5表观遗传缺陷细胞中具有明显更高翻译效率的1987年描述的RNA集，通过进行基因集富集分析开发了基因功能注释。使用KEGG和GO标志集，观察到与癌症，细胞周期和核糖体有关的细胞途径和生物学术语的过度表达。GSEA和序列基序识别分析之后，使用DAVID和GSEA签名数据库集合对TE候选基因进行了FDR调整P值小于0.05的超几何测试。最令人惊讶的是与细胞对压力和代谢适应的反应有关的本体论有所增强。
    　　 为了证实这种情况，其中NSUN5表观遗传沉默促进了蛋白质合成的整体减少，但是出现了一种特定的蛋白质生产程序，该程序与提高的翻译效率以应对细胞应激有关，在细胞培养物中进行了氨基酸的稳定同位素标记与经NSUN5稳定转染的LN229细胞相比，在空载体转染的LN229细胞中。在SILAC分析中使用的分离度水平上，鉴定出128种蛋白质，这些蛋白质在NSUN5转染后在LN229细胞中具有明显不同的表达。为了改善NSUN5转染后表达差异显着的蛋白质的特性们通过进行基因集富集分析开发了基因功能注释。FDR调整后的P使用DAVID和GSEA签名数据库集合的候选基因值小于0.05。使用KEGG和GO标志集，观察到与细胞信号传导，错配修复和RNA加工对应激反应有关的细胞途径和生物学术语的过度表达。恢复NSUN5后，大多数蛋白质被上调，而其余27％被下调。在Suppl中显示了在NSUN5转染后三种下调的蛋白质的蛋白质印迹验证。这些数据与神经胶质瘤细胞中NSUN5的丢失限制了一般蛋白质合成的想法是一致的。建议在NSUN5缺乏的情况下选择性合成特定蛋白质。选择其中一个靶点，即应力激活蛋白NQO1，用于蛋白质印迹和定量逆转录-PCR分析，证实了其NSUN5调控发生在mRNA的翻译水平，与RNA的差异无关水平。此外，NQO1与NSUN5转染LN229细胞的多核糖体级分中。比较空载体和NSUN5转染的LN229细胞但存在H2O2的其他RNA-seq实验的进一步发展压力，证实NSUN5转染对转录组几乎没有影响，其余99.5％的转录本保持不变。在经历H2O2胁迫的这些细胞中进行的Ribo-seq分析进一步证实，与NSUN5转染的细胞相比，NQO1在LN229空载体转染的细胞中显示出更高的翻译效率。还在另一个胶质母细胞瘤细胞系A172中在不存在H2O2的情况下进行了RNA测序，它还显示了NSUN5表观遗传失活获得了几乎相同的结果：NSUN5转染后99％的转录本水平未改变。
    　　 功能丧失实验中也验证了上述场景。为了确定直接依赖于NSUN5缺失的候选翻译程序的存在，在NSUN5shRNA缺失与加扰的shRNADBTRG-05MG细胞中进行了RNA-Seq和Ribo-seq分析。NSUN5表达缺失的神经胶质瘤细胞在不到1％的转录本中表现出RNA丰度差异，而99％的转录本丰度保持不变，而对于核糖体占用，观察到2.2％的转录本，其核糖体谱分析存在差异。具有增强翻译效率的RNA被定义为那些在RNA-SEQ不变，但上调核糖SEQ与扰乱的shRNA细胞相比，鉴定在NSUN5shRNA缺失的DBTRG-05MG细胞中具有更高翻译效率的787个转录物。出国看病网研究人员通过应用通用线性模型通过对RNA-seq和Ribo-seq的过度分散分析计算翻译效率值来证实这些观察结果。
    　　 为了改善在NSUN5shRNA介导的缺陷细胞中具有明显更高翻译效率的所述787RNA集合的特征，通过进行基因集富集分析开发了基因功能注释。使用KEGG和GO标志集，观察到与癌症和核糖体相关的细胞途径和生物学术语的过度表达。遵循“材料和方法”中所述的GSEA和序列基序识别分析后，使用DAVID和GSEA签名数据库集合对TE候选基因进行了FDR调整P值小于0.05的超几何测试。正如之前针对LN229模型所述，与细胞对应激和代谢适应的反应有关的本体的增强。NQO1这是其特征在于上述作为具有增强翻译效率和过表达在LN229细胞NSUN5后生损失，也被确定为shRNA介导的NSUN5缺失耗竭，可提高DBTRG-05MG细胞翻译效率的目标。Western印迹和定量逆转录-PCR分析证实，NSUN5耗尽细胞中蛋白质水平的NQO1上调与RNA水平的差异无关。总而言之，这些数据与神经胶质瘤细胞中NSUN5的丢失限制了一般蛋白质合成同时激活特定应激相关蛋白质的选择性合成这一想法是一致的。
    　　 NSUN5表观遗传沉默与NQO1过表达发现促使研究神经胶质瘤细胞是否更容易受到针对这种特定压力相关蛋白的化合物的攻击。已经有人提出产生活性氧的药物可用于推动癌细胞超过氧化应激阈值并进入细胞死亡。在这方面，deoxynyboquinone和异丁基deoxynyboquinone是NQO1致使所述生产大量ROS的不能由癌细胞被容忍，导致其死亡[bioactivatable基板。因此评估这些化合物增强的生长抑制作用是否依赖于NSUN5甲基化。首先通过Western印迹分析证明了三种研究的NSUN5高度甲基化的神经胶质瘤细胞系显示高水平的NQO1，而在三种NSUN5未甲基化的细胞系中观察到NQO1的最低表达中。这些数据证实了NSUN5表达在调节NQO1蛋白水平中的上述作用。最重要的是根据SRB细胞活力测定，确定相应的IC50值表明，NSUN5高甲基化神经胶质瘤细胞比NSUN5非甲基化神经胶质瘤细胞株对DNQ和IB-DNQ药物的敏感性显着更高。此外，扩展这些测定以NSUN5甲基LN229神经胶质瘤细胞，在这里外源恢复NSUN5活性，因此耗尽NQO1蛋白质。与空载体转染的细胞相比，NSUN5转染后的细胞对NQO1可生物激活的底物的抵抗力显着增强。类似的结果也见于体内的癌细胞在裸鼠中。使用NQO1bioactivatable基板的与肿瘤那些裸鼠存活增加源自NSUN5与模拟治疗组中，而观察到对药物和模拟治疗之间的存活率没有差异小鼠携带从NSUN5未甲基化的细胞系DBTRG-05MG。因此，NSUN5甲基化的出现指出了对NQO1底物的细胞毒性作用更为敏感的神经胶质瘤细胞。
    　　 一旦在神经胶质瘤细胞系和小鼠模型中确定了NSUN5表观遗传沉默的作用，便研究了NSUN5启动子CpG岛超甲基化对人原发性神经胶质瘤的影响。可从癌症基因组图谱获得的人类神经胶质瘤收集物的分析，该DNA使用相同的DNA甲基化此处用于最初的Sanger细胞系筛选的微阵列平台显示，在28％不同等级的神经胶质瘤中存在NSUN5启动子CpG岛甲基化。TCGARNA测序数据显示，NSUN5高甲基化与胶质瘤样本中的转录物下调相关。根据世界卫生组织的《中枢神经系统肿瘤分类》中所述，基于组织增生程度的组织学分级对疾病的自然病程有重大影响。低级别胶质瘤具有更有利的预后，而高级别胶质瘤，也称为胶质母细胞瘤，有一个非常不利的结果。观察到相对于GBM，低度神经胶质瘤中NSUN5高度甲基化的富集。TCGARNA测序数据显示NSUN5高甲基化与低级和高级神经胶质瘤的转录下调有关。除了成人神经胶质瘤，还在小儿脑肿瘤中检测到NSUN5甲基化，例如弥漫性桥脑神经胶质瘤和髓母细胞瘤。重要的是从三个DIPG肿瘤中获得RNA，观察两个NSUN5高甲基化病例在28SrRNA的C3782位置显示了低甲基化，而NSUN5未甲基化的病人在该部位显示了高水平的rRNA甲基化。
    　　 考虑到神经胶质瘤等级与临床结果之间的已知关系，出国看病网研究人员想知道NSUN5甲基化是否也能提供任何预后价值。在TCGA队列中所有神经胶质瘤级别中，NSUN5高度甲基化与总生存期的增加有关[log-rank;P小于10-5;风险比=5.17，95％CI=2.78-9.61]所示。NSUN5高度甲基化与LGG和GBM中较高的OS相关。这些数据在GBM中尤为重要，因为90％的患者预后不良。然而，个体的剩余的10％是长期存活者，分子因素参与尚未完全确定。低水平的NSUN5RNA转录物也与TCGA队列中的OS升高相关。按等级划分后，低水平的NSUN5RNA转录物也与LGG中OS升高相关。在GBM中发现了NSUN5低表达与OS较短之间的趋势，但是由于 根据既定的临界值，少数病例低表达，因此缺乏统计功效。
    　　 出国看病网研究人员在一个新获得的115个原发性神经胶质瘤的验证队列中证实了TCGA神经胶质瘤的发现，其中NSUN5甲基化状态是通过焦磷酸测序测定来确定的：NSUN5启动子的高甲基化与OS增高相关和延长的无进展生存期。进一步扩大了与列入303名患者两个独立的神经胶质瘤群组，其中NSUN5甲基化状态可从在TCGA胶质瘤例使用的相同的DNA甲基化微阵列的该初始验证队列。与这一大型验证队列的临床结果相关，这三组病例仅可获得PFS，因此它是评估变量。证实NSUN5启动子甲基化与增加的PFS相关联。将神经胶质瘤验证样品分为等级时，可以保持NSUN5甲基化对PFS的影响。NSUN5甲基化与低级神经胶质瘤中的PFS延长相关和胶质母细胞瘤。
    　　 出国看病网研究人员研究的临床相关性的神经胶质瘤其它遗传和外遗传改变是否帮助定义患者NSUN5甲基化相关联的延长的存活。在这方面，IDH1突变的神经胶质瘤的存在是已知的改善的结果的预测。发现TCGA储存库中包含的神经胶质瘤就是这种情况：IDH1突变与更长的OS相关。有对于那些均具有不良预后的野生型IDH1病例，NSUN5超甲基化的存在突出了一部分OS长的病例。类似的临床观察比IDH1突变体所观察到的一个被发现涉及到染色体臂1P和19Q，结果的另一个预测器的共缺失，这也与来自TCGA储存库的神经胶质瘤中较长的OS有关。对于那些没有1p/19q共缺失的患者，都被认为预后较差，NSUN5高甲基化确定了OS改善的亚组。附加的互补分子的场景被发现与在人神经胶质瘤的另一个关键标记物也是在临床实践中使用：DNA修复酶MGMT。MGMT的后生失活被链接到对化疗烷化剂增强的响应和在神经胶质瘤增加OS。发现TCGA神经胶质瘤就是这种情况：MGMT甲基化程度较高与更长的OS相关。另外，在对于那些在MGMT未甲基化的神经胶质瘤，这些神经胶质瘤应该显示不良预后，NSUN5高度甲基化定义了OS延长的子集。上述TCGA结果大部分在扩大的神经胶质瘤验证队列中得到了证实。首先在这组病例中，证实IDH1突变，染色体臂1p和19q的共同缺失以及MGMT甲基化都与更长的PFS相关。对于那些没有1p/19q共缺失的患者，NSUN5高甲基化可精确定位PFS改善的亚组。与IDH1突变状态有关，出国看病网研究人员观察到在野生型IDH1未达到统计学意义的情况下，NSUN5高度甲基化和更长的PFS之间存在趋势。对于MGMT未甲基化和高甲基化的患者，NSUN5高度甲基化定义了具有扩展PFS的子集。
    　　 对于这两种TCGA和验证群组中，观察NSUN5甲基化与临床益处的其它生物标志物如IDH1突变，1P/19Q和MGMT甲基化。所有这三个分子标记之间也都具有显着相关性。NSUN5甲基化与神经胶质瘤CpG岛甲基化子表型不相关，这是IDH1突变患者的常见现象。如预期的那样，TCGA胶质瘤数据集中存在gCIMP表型与改善的临床预后相关。令人惊讶的是，当出国看病网研究人员根据gCIMP状态和NUSN5甲基化对TCGA数据集进行分层时，出国看病网研究人员观察到对于那些缺乏gCIMP表型的病例，这些病例均被认为临床效果较差，NSUN5甲基化的存在突出了一个子集总体生存期长的病例。最后，重要的是确定NSUN5甲基化作为候选独立生物标志物的价值，对NSUN5甲基化状态和所描述的临床结果已知的生物标志物进行了多变量分析。对于这两个研究的神经胶质瘤队列。多变量Cox回归分析表明，NSUN5高甲基化是TCGA胶质瘤队列中OS的独立预测因子和PFS在PFS中的独立预测因子。询问的神经胶质瘤患者的验证队列。
    　　 多于100个不同的核苷酸修饰已经报道RNA分子在跨越所有生命形[范围，其中有许多是还存在于人的RNA分子，例如N6-甲基腺苷，N1甲基腺苷，假尿苷，或5-甲基胞嘧啶。RNA的化学修饰，在全球范围内为epitranscriptome称为，进行到细胞稳态的关键功能，有助于RNA稳定性，出口，定位，结构，剪接加工，再编码，靶向和翻译。对表观转录组的破坏如何能够引发和促进肿瘤发生的了解还处于曙光，但是新出现的发现表明，改变的RNA修饰模式在癌症中起着基本作用。X连锁性先天性角化不全症中假尿苷合酶DKC1突变的发生，因为它直接影响关键的细胞因子核糖体。DKC1是假尿苷合酶其介导引入在核糖体RNA此修饰的碱基的。小鼠是hypomorphically突变体显示出DKC1降低在它们的RNA假尿苷和一个翻译缺陷尤其影响含有内部核糖体进入位点的mRNA。翻译控制也受损在人X-DC患者。这些结果表明核糖体不是细胞转化中的被动结构，而是对癌细胞表型有积极作用。这个想法也由专门核糖体，并用这些结构和rRNA的相关的复杂机械的存在支撑，除了突变的癌症相关的综合征存在下，在核糖体蛋白。对于rRNA而言，除了假尿苷外，还有另一个修饰，即5-甲基胞嘧啶，似乎具有重要的调节作用。这种RNA的化学修饰也作用在的tRNA，其中所述5-甲基胞嘧啶RNA甲基转移NSUN2的损失驱动蛋白质合成降低全球水平和改变的平移方案，以类似的方法，使发生在DKC1损失。
    　　 在研究中结合了基因组学，表观基因组学和表观转录组学方法来表征5-甲基胞嘧啶RNA甲基转移酶NSUN5，并展示其表观遗传沉默如何在28SrRNA的特定位置产生低甲基化事件，从而耗尽整个蛋白质的合成，但是使胶质瘤细胞参与特定的翻译程序，以在细胞应激条件下存活。出国看病网研究人员还通过分子动力学表明，人类28SrRNA的C3782位置的甲基化可以介导三级复合rRNA–tRNA–mRNA的结构稳定性，从而导致其丢失，从而导致其在28S亚基边缘的结构变形。P位腔可能会损害生理蛋白的合成。观察“翻译悖论”是在全球蛋白质生产不足的情况下翻译程序的出现，是细胞利用其对基因表达施加强大而及时的影响以应对压力条件的众所周知的机制。随着肿瘤的进展，它们遇到许多障碍和不友好的环境，这些环境经常产生氧化，复制，遗传毒性，蛋白毒性或代谢应激。如果能产生高水平的对癌细胞有毒的ROS，那么即使在早期阶段就促进肿瘤发生的致癌突变也会变得令人讨厌。肿瘤对这些疾病的主要适应性之一是对蛋白质合成的整体抑制，它关闭了对能量的高度需求的过程，同时防止了错误折叠或受损蛋白质的积累。然而同时实现了所选mRNA的翻译，这对于适应性细胞反应至关重要。NQO1是另一种示例性案例，NQO1是一种受Keap1/Nrf2/ARE途径调控的多功能抗氧化酶如本文报道的，其抗神经胶质瘤中NSUN5丢失后其翻译效率提高，以克服这些转化细胞遇到的许多类型的氧化应激。NQO1的NSUN5甲基化介导的过表达也可以构成在这些神经胶质瘤的治疗机会，因为它们变得于使用NQO1-bioactivatable分子给ROS诱导的死亡更敏感。因此，NSUN5DNA甲基化相关的失活通过其与28SrRNA甲基化相关的缺陷，代表了一种善意的机制，该机制解释了人类神经胶质瘤如何通过消耗总体合成同时促进特定的翻译程序来适应具有挑战性的细胞应激条件。此外，尽管在所研究的模型中未观察到NSUN5基因组缺陷，但仍需要更全面的研究以丢弃其他基因改变。
    　　NSUN5表观遗传沉默在耐受细胞应激环境中的作用类似于胶质瘤发生中的另一个关键分子事件:IDH1突变的发生。已经证明，NSUN5活性的丧失会延长体内和体外的细胞生存能力，但与改善临床预后相关。以类似的方式，IDH1正常催化活性的丧失有助于神经胶质瘤的发生，但它也与良好的OS有关。可以考虑癌细胞在面对破坏性压力条件时如何避免死亡，因为正如针对NSUN5所表明的那样，IDH1的破坏是应对代谢和低氧压力的另一种方式。因此，那些表现出NSUN5表观遗传沉默的神经胶质瘤患者，例如那些携带IDH1突变的神经胶质瘤患者，其肿瘤细胞可能濒临死亡，其生存的最后手段是限制整体蛋白质合成并启动特定的紧急翻译程序处理多种压力条件。总之，神经胶质瘤中NSUN5的缺失在表观遗传事件，其启动子的启动子CpG岛超甲基化与表观转录事件，人的C3782位置的低甲基化状态之间提供了联系。已经证明NSUN5失活是神经胶质瘤细胞通过抑制高能量消耗的全球蛋白质合成，同时刺激诸如NQO1的适应性蛋白质的翻译来克服敌对应激条件的可能途径。发现如果在更大范围的前瞻性临床研究中得到证实，可能对神经胶质瘤患者的治疗有用，因为在疾病的预后通常不佳的情况下，NSUN5表观遗传病灶有助于确定哪些患者可能会有好的结果。
 
出国看病概况

海外医疗在国外发展较为成熟，比如在欧美等医疗技术发达国家，很多医院都设有国际病人办公室并配备多语种医学专业翻译人员，就医流程和模式都已相对成熟。在国内，海外医疗虽然还属于新兴行业，但发展势头迅猛，发展潜力巨大，市场前景广阔。
　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
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