出国看病
 
如何抑制人胶质瘤中的细胞增殖
  • 　　神经胶质瘤是主要在脑的神经胶质组织中产生的主要脑部肿瘤。暴露于电离辐射已被证实是胶质瘤出现的唯一危险因素，其他环境暴露仍是不确定因素。治疗挑战来自神经胶质瘤在大脑外侧的扩散以及成功交付足够化学治疗剂量的困难。近年来有证据证明，miR-16和miR-365等microRNA可以作为神经胶质瘤发展的抑制剂。鉴于现有疗法的不良结果，对神经胶质瘤的更好了解对于更有效的干预措施至关重要，从而限制了神经胶质瘤的快速发展。作为基因表达的重要调节剂，miRNA指生物体内存在的具有约22个核苷酸的非编码RNA。使微RNA对癌症的发展做出重要贡献。miR-133a是miRNA家族之一，已被证明在多种肿瘤中表达不足，并通过调节膜1型基质金属蛋白酶在神经胶质瘤进展中发挥负作用。miR-133a下调基质金属肽酶9以抑制神经胶质瘤引起的不良情况。miR-133a的减少与结缔组织生长因子表达的增加有关。CTGF是一种分泌的蛋白质，能够调节多种生长因子并导致细胞外基质的产生，并且还发现它可以通过调节其增殖和成熟来促进小鼠B细胞再生。12，13早期的研究表明，富含CTGFs通过促进CTGF-ITGB1-TrkA的在肿瘤启动或肿瘤干细胞复合物的活化增加胶质瘤侵袭。在CTGF刺激后，Janus激酶以及信号转导和转录激活剂的活性可以增加。JAK/STAT途径是众多生长因子和细胞因子的主要信号传导机制，它通过许多信号的传导作用作用于动物的发育和体内稳态。还有一项研究表明，人类神经胶质瘤的发生与JAK/STAT通路密切相关。然而很少有研究集中于miR-133a在神经胶质瘤中的作用，因此，本研究探讨了miR-133a/CTGF/JAK/STAT轴对神经胶质瘤的机制。
    　　 研究前从所有患者获得书面知情同意书。这项研究的方案已由医院伦理委员会批准，并基于涉及赫尔辛基宣言中涉及人类受试者的医学研究的伦理原则。该实验也得到了医院动物伦理协会的批准，并得到了动物伦理协会的监督。从2012年9月至2016年3月收集了65例人类神经胶质瘤标本，所有病例均经过病理证实。根据2007年世界卫生组织对中枢神经系统肿瘤的分类将肿瘤分类39个I-II级肿瘤，26个III-IV级肿瘤；肿瘤大小：大于等于5cm30例，小于5cm35例；肿瘤切除程度：根治性切除33例，姑息性切除32例。术后所有患者均获随访，时间336个月。选择来自内部减压的颅脑损伤患者的另外30个正常脑组织作为对照。将所有组织样本切成小块后，迅速放入冷冻管中，以便在液氮中存储，然后移至-80°C的冰箱中。
    　　 将上述样品固定在10％甲醛中，并用石蜡包埋制成4um的切片。常规对组织切片进行脱蜡和脱水，然后在3％H2O2孵育30分钟在37°C时，在0.01M柠檬酸缓冲液中于95°C沸腾20分钟。接下来，在切片中补充结缔组织生长因子，在4℃下过夜。然后加入相应的二抗在室温下孵育30分钟，随后用二氨基联苯胺进行染色，然后进行染色用苏木精进行密封。每个部分随机选择五个高倍视野，并根据阳性细胞的百分比进行评分：阳性肿瘤细胞/所有大于10％的肿瘤细胞被视为阳性，而小于等于10％的阳性细胞被视为阴性。结果由两个人以盲目方式独立评分。胶质瘤细胞和正常神经胶质细胞HEB的冷冻悬浮液分别为移至离心管中进行800-rpm离心5分钟，然后除去上清液。将细胞放入补充有10％胎牛血清的完全培养基中，均匀地重悬，并转移到25cm2烧瓶中，然后在培养箱与5mL完全培养基混合，每24至48小时更换一次。然后当细胞汇合度升至60-70％时，用0.25％的胰蛋白酶进行分离并传代，然后选择处于对数生长期的细胞进行后续实验。逆转录定量聚合酶链反应用于确定每个细胞系中的miR-133a和CTGF表达，并筛选出具有最高和最低相对表达的细胞系用于后续细胞实验。
    　　 转染前将细胞在12孔板中接种24小时，然后向每个孔中加入1.5mL完全不含抗生素的培养基。当感染时细胞密度达到约60％时，通过lipofectamine2000介导，瞬时转染U87和A172胶质瘤细胞系，并在6小时后更换培养基。培养48小时后，收集细胞用于后续实验。
    　　 使用RNA提取试剂盒提取组织和细胞总RNA。miR-133a，CTGF，U6和甘油醛磷酸脱氢酶的引物设计委托给Takara。然后根据PrimeScriptRT试剂盒的说明将RNA反转录为cDNA，并根据SYBR(R)PremixExTaqII试剂盒说明并在ABIPRISM7,300系统下进行RT-qPCR。miR-133a和CTGF相对表达的内部参考分别是U6和甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用2-△△Ct相对定量法20计算靶基因的相对mRNA转录表达。提取组织和细胞总蛋白。根据二辛可宁酸试剂盒的说明确定蛋白质浓度，并制备10％十二烷基硫酸钠分离凝胶和堆积凝胶。将样品与上样缓冲液充分混合，并将凝胶上的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，然后在4°C下用5％脱脂奶粉密封过夜。加入一抗在4°C下过夜孵育，包括CTGF，E-钙粘蛋白，基质金属蛋白酶-2，基质金属蛋白酶-9，JAK2，STAT3，与B细胞淋巴瘤相关的X，N-钙黏着蛋白，B细胞淋巴瘤2，GAPDH，细胞周期蛋白D1和增殖细胞核抗原。然后加入辣根过氧化物酶标记的免疫球蛋白G，并在37°C下孵育1小时。将该膜在室温下置于电化学发光反应溶液中1分钟。除去液体后，将细胞用保鲜膜覆盖，在黑暗环境中暴露，并在显影和照相定影后观察。将GAPDH用作内部参考，并通过ImageJ2x软件分析图像。重复实验三次，取平均值。
    　　 转染后48小时，对细胞进行计数，并以2×102个细胞每毫升的密度接种到6孔板中，每组设置三个重复孔，然后添加2mL含血清的培养基。然后在培养箱中进行2到3周的培养，每周更换一次液体。当显微镜下观察到每个菌落中有超过50个细胞时，终止培养，然后进行30分钟的4％低聚甲醛固定，磷酸盐缓冲液洗涤和10分钟的结晶紫染色。最后，计算孔中的菌落数。当细胞生长密度达到约80％时，在三遍PBS洗涤后，通过0.25％的胰蛋白酶分离制成单细胞悬液。然后将细胞接种到96孔板中，密度为每孔1×104个细胞，重复6个孔并进行孵育。在第24、48和72小时取出培养板，并在每个孔中补充10uLCCK-8试剂进行2小时孵育。在酶标仪上于490nm读取每个孔的光密度。每个实验重复三遍，并以时间点为横坐标，OD值为纵坐标，绘制细胞活力曲线。将细胞在无血清培养基中饥饿24小时，分离，用PBS洗涤，然后重悬于无血清Opti-MEMI培养基中，以在48小时转染后将细胞密度调整为2×105细胞mL。实验使用带有24孔板的8umTranswell室，每组分别设置了三个具有100uL细胞悬液的室。在基底外侧室中补充500uL10％Dulbecco's改良的Eagle培养基后，将室在37°C和5％二氧化碳下孵育。在迁移测试中，转染24小时后，将细胞用4％多聚甲醛固定30分钟后，将小室置于0.2％TritonX-100溶液中15分钟，然后加入5分钟的0.5％晶体紫染色。
    　　 在侵袭试验中，将细胞密度调节为1×106个细胞每毫升。在测试之前，将50uLMatrigel和100–150uL细胞悬液置于每个腔室中，并将500uL含10％FBS的完全培养基添加到基底外侧腔室中。24小时后，如上所述进行固着和染色。在倒置显微镜下计数染色的细胞数，并选择五个随机视野进行计数，细胞数用平均值表示。细胞周期的碘化丙啶单一染色分析：转染后48小时，收集所有细胞并进行上述处理，在PBS洗涤后补充70％冰乙醇，并在4°C过夜。离心后弃去上清液，两次PBS洗涤后将细胞重悬于400uL结合缓冲液中。然后加入50uLRNaseA，将细胞沉淀物重悬，在37°C下孵育30分钟，然后与50uLPI在黑暗中放置30分钟-在室温下孵育一分钟。流式细胞仪用于确定细胞周期。通过AnnexinV-FITC/PI双重染色进行细胞凋亡分析：将U87和A172以2×105个细胞/孔接种到6孔板中。在转染后72小时除去培养基之前，将每组细胞以100nmol/L转染，在4℃下用预冷的PBS洗涤一次，并在胰蛋白酶消化后收集到15mL离心管中。弃去上清液后，在两次PBS洗涤后，根据AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒I的说明将细胞重悬于500uL结合缓冲液中。加入五微升FITC和5uLPI并混合均匀，避开光照15分钟。通过流式细胞术分析细胞凋亡。将对数生长期的7组A178细胞和7组U87细胞胰蛋白酶消化成单细胞悬液，然后进行3次PBS洗涤并以500rpm离心5分钟。接下来，将细胞重悬于具有10％FBS的DMEM中，然后计数。3-4周龄的42只特定的无病原体Balb/c裸鼠购自生物医学研究所。将裸鼠在干净的动物房中饲养1周，在22–25°C的室温下以正常的昼夜节律自由进食和喝水。将小鼠分为14组，每组三只。每只裸鼠腹侧皮下注射14种细胞液，为期7天。肿瘤大小用游标卡尺每3天测量，和体积，并在实验后计算每组的平均值。实验后将所有裸鼠安乐死。
    　　 双重荧光素酶报告基因检测证实CTGF是miR-133a的直接靶标。人工合成了CTGF3'-非翻译区基因片段，并通过SpeI和HindIII核酸内切酶位点引入了pMIR-reporter。在野生型的CTGF中设计了种子序列的互补序列突变位点，并在限制性内切酶消化后，通过T4DNA连接酶将目标片段插入了pMIR-reporter质粒。正确序列的荧光素酶报告质粒分别与miR-133a共转染到HEK-293T细胞中。转染48小时后裂解细胞，并通过萤光素酶检测试剂盒检测萤光素酶活性。所有数据均使用SPSS21.0统计软件进行处理。测量数据表示为平均值±SD。两组之间的比较采用t检验，多组之间的比较采用单向方差分析。卡方检验用于验证miR-133a和CTGF的表达与神经胶质瘤的临床病理特征之间的关系。Kaplan–Meier分析了神经胶质瘤患者的生存预后。p小于.05表示差异具有统计学意义。
    　　 免疫组织化学表明，CTGF蛋白主要在细胞质中表达，阳性表达主要为棕黄色。正常脑组织中CTGF蛋白的阳性表达率为3.78％，远低于人脑胶质瘤组织中的77.19％。RT-qPCR和蛋白质印迹分析表明，人脑胶质瘤组织中的miR-133a表达明显下降，而CTGFmRNA表达大幅上升。根据miR‐133a相对表达的中位数将患者分为两组，并分析miR‐133a表达与神经胶质瘤患者临床病理特征之间的关系。CTGFmRNA表达与神经胶质瘤患者的临床病理特征之间的关联以相同的方式进行。根据WHO标准，III-IV期脑胶质瘤患者的miR-133a低表达和CTGFmRNA高表达比例增加，即WHO分期和肿瘤大小与miR-133a和CTGFmRNA表达显着相关，但年龄，性别和肿瘤切除程度与该表达无关。Kaplan–Meier分析用于检测miR-133a和CTGFmRNA表达对神经胶质瘤患者预后的影响。结果表明，较低的miR-133a表达和较高的CTGFmRNA表达反映了患者的预后较差。
    　　 神经胶质瘤约占脑和中枢神经系统肿瘤的30％，占恶性脑肿瘤的4/5。尽管神经胶质瘤可以通过化学疗法，放射疗法和手术切除来控制，但不可避免的是，残疾和死亡率很高。最近已经证明了多种miRNA表达可对涉及神经胶质瘤发生的关键信号通路产生重大影响。尽管如此，miR-133a在神经胶质瘤中的作用仍有待研究。因此，出国看病网研究人员的研究旨在探索miR-133a在神经胶质瘤发育中的功能。总体而言，研究表明，miR-133a的过表达和CTGF的下调通过JAK/STAT信号通路抑制人胶质瘤中的细胞增殖，迁移和侵袭。通过一系列测定发现人胶质瘤组织和神经胶质瘤细胞中miR-133a被下调，CTGF被上调，而miR-133a和CTGF被下调导致胶质瘤的预后不良。根据出国看病网研究人员的结果，以前的研究发现神经胶质瘤中miR-133a表达低而CTGF表达高。miR-133a低表达可导致骨肉瘤患者预后不良。还有一项研究表明，CTGF高表达与胃癌患者预后不良有关，其表现为在短时间内发生淋巴结转移和死亡的可能性更高。出国看病网研究人员还发现miR-133a的上调和CTGF的下调抑制了细胞集落的形成，增殖，迁移和侵袭，并促进了神经胶质瘤的凋亡。有人认为miR-133a可以作为神经胶质瘤抑制剂，通过调节膜1型基质金属蛋白酶来抑制其出现和发育。在乳腺癌中，发现miR-133a降低是不利生存的促进因素，而miR-133a的表达升高会对乳腺癌细胞的侵袭和发展产生负面影响。siRNA抑制CTGF抑制了神经胶质瘤干细胞和神经胶质瘤细胞的迁移。也有证据表明，CTGF的下调可抑制胃癌细胞的侵袭和增殖。
    　　 此外，发现上调的miR-133a抑制了CTGF的表达和JAK2/STAT3信号通路的激活。先前的研究中已经证明，miR-133a的过表达能够预防CTGF的升高，也就是说，miR-133a可以作为CTGF的有效抑制剂。发现在人类肾癌细胞中，miR-133b和miR-135a调节JAK2/STAT3信号通路来促进细胞凋亡。有涉及人类肝细胞癌的证据表明，miR-219升高通过限制SMC4表达而导致JAK2/STAT3显着降低。已经证明CTGF刺激人肥厚性瘢痕成纤维细胞后，JAK1和STAT1活性增加。在人肺成纤维细胞中，凝血酶通过JAK2对c-Src的作用激活JAK2后，JAK2激活STAT3来诱导CCN2表达。较早的研究都与出国看病网研究人员在研究中获得的一致。总而言之，研究表明，通过调节JAK/STAT信号通路，miR-133a升高和CTGF敲低对人脑胶质瘤的细胞增殖，迁移和侵袭具有负面影响。研究为miR-133a在神经胶质瘤发展中的功能及其临床治疗提供了新思路。但是，由于样本量有限，无法进行全面的研究，因此仍需要进行深入研究以更好地阐明miR-133a在神经胶质瘤中的作用。
 
出国看病概况

海外医疗在国外发展较为成熟，比如在欧美等医疗技术发达国家，很多医院都设有国际病人办公室并配备多语种医学专业翻译人员，就医流程和模式都已相对成熟。在国内，海外医疗虽然还属于新兴行业，但发展势头迅猛，发展潜力巨大，市场前景广阔。
　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
出国看病适应症
靶向药物
 

  • 联系出国看病服务机构网

  • 电话：13263277712
    北京办公室地址：北京市丰台区万丰路

出国看病服务机构网 版权所有 2012-2022 日本房产 海外医疗 BNCT 网站优化 卡马替尼 索托拉西布