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神经胶质瘤患者的新型预后生物标志物
  • 　　胶质瘤是最常见和恶性的原发性颅内肿瘤。尽管对神经胶质瘤的分子机制有了更深入的了解，并且外科技术，放射疗法和化学疗法取得了进步，但是神经胶质瘤，WHOIV级神经胶质瘤）患者的预后仍然很差。GBM患者的中位生存时间约为12-15个月。神经胶质瘤的生物学特性包括自我更新，侵袭，血管新生强，高死亡率和复发率。多项研究表明，基于基因表达的分类和组织学分类的联合应用可能比单独的组织学分类更好地预测治疗效果和预后。在世界卫生组织2016年对神经胶质瘤的分类中，异柠檬酸脱氢酶突变和1p/19q缺失已被列为神经胶质瘤分类的决定性标志。根据WHO2016实体，星形细胞瘤，间变性星形细胞瘤和胶质母细胞瘤可分为IDH突变组和野生型组。此外，1p/19q编码成为少突胶质瘤的重要标志物，其诊断必须基于IDH突变加上1p/19q编码。由于神经胶质瘤具有独特的分子特征，因此有必要为神经胶质瘤的诊断，预后和治疗发展确定新的生物标志物和分子靶标。
    　　 不可控制的侵袭性限制了治疗效果并导致肿瘤复发，是神经胶质瘤的重要病理生物学特征。神经胶质瘤的迁移和侵袭可以通过许多蛋白质和信号传导途径如PI3K和MAPK途径来调节。在可以精确影响神经胶质瘤迁移和侵袭的基因和蛋白质中，GTPases的Rho家族，包括RhoA，Rac1和Cdc42，是神经胶质瘤迁移和侵袭的关键介质。它们可以通过调节细胞骨架的组织来调节细胞极性和细胞运动。除RhoGTPases外，Rho特异性鸟嘌呤核苷酸交换因子也起重要作用，可通过催化GTP的GDP交换来调节GTPases活性。Pleckstrin同源性和RhoGEF含G5的结构域主要在神经系统中表达，起GEF激活RhoA的作用。许多研究表明，PLEKHG5参与内皮细胞迁移，内皮细胞连接完整性，细胞屏障功能，血管渗漏和血管生成。此外，PLEKHG5也已报道，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭，癌症干细胞球状体形成和血管生成潜力，表明PLEKHG5可能在肿瘤进展中起重要作用。然而，尚未确定PLEKHG5在人脑胶质瘤中的表达模式，诊断和预后价值。在这里，出国看病服务机构在这项研究中调查了PLEKHG5在不同等级的人类神经胶质瘤中的表达模式，其临床意义和潜在功能。PLEKHG5可能是一种新型的预后生物标志物，并且是人类神经胶质瘤的潜在抗肿瘤靶标。人GBM细胞系U87MG和U251获自细胞银行。将U87MG和U251在补充有10％FBS的DMEM中进行培养。将细胞在含有20％O2和5％CO2的加湿室中于37°C培养。
    　　 从接受减压治疗的严重创伤患者中收集正常的脑组织。不同等级的神经胶质瘤标本取自医院神经外科初次手术的神经胶质瘤患者。本研究得到医院伦理委员会和制度审查委员会的批准。出国看病服务机构收集了所有61例神经胶质瘤患者的书面知情同意书。人类神经胶质瘤样品用4％多聚甲醛固定。切片石蜡包埋的神经胶质瘤组织，并使用1mMEDTA进行抗原修复。内源过氧化物酶活性被含有3％H2O2甲醇阻断。首先将切片与山羊血清一起孵育，然后与PLEKHG5抗体在4°C孵育过夜。通过DAB试剂盒可视化染色。代表性图片由奥林巴斯显微镜收集。阳性染色细胞的百分比和染色强度评估PLEKHG5表达水平。免疫反应性细胞的百分比评分如下：0.0％;1.1-10％；2.11–50％；3.51–75％；4.超过75％。染色强度评分如下：0。阴性；0。1.弱染色2.中度染色；3.强烈染色。PLEKHG5的总分是百分比与染色强度的乘积。计算总分为0–12，分为2组：低表达PLEKHG5组：得分在0到3之间；低表达组在0和3之间。PLEKHG5高表达组：得分在3到12之间。PLEKHG5高表达组进一步分为不同的组：PLEKHG5组：得分在3到5之间；PLEKHG5组：得分在5到7之间；PLEKHG5组：得分在7到10之间；使用Matlab软件和TCGA数据库，对与PLEKHG5相关的基因进行了分析。通过 使用DAVID网络工具分析与PLEKHG5正相关和负相关的基因，PLKEHG5可能参与了潜在的生物学过程和信号通路被确定。使用专用软件进行基因集富集分析，以分析和确定PLEKHG5表达与分子标记数据库中的基因之间的相关性。
    　　 根据制造商的说明，使用Lipofectamine3000用PLEKHG5siRNA转染U87MG和U251。转染后48小时，收获细胞用于进一步研究。根据制造商的说明，用transwell室进行迁移测定。将经处理的神经胶质瘤细胞接种到DMEM的顶部室中，并在底部室中填充含有30％FBS的DMEM。迁移到膜底部的神经胶质瘤细胞用4％多聚甲醛固定并用结晶紫染色。胶质瘤细胞在含有蛋白质抑制剂混合物的RIPA缓冲液中裂解。使用PierceProteinAssayKit定量蛋白质浓度。蛋白质在SDS-PAGE上电泳，转移到聚偏二氟乙烯膜上，并通过一抗检测。使用了以下一抗：PLEKHG5，MMP2，MMP9，mDia，N-钙黏着蛋白，波形蛋白，GAPDH。根据制造商的方案，使用化学发光法对蛋白质进行定量。使用GraphPadPrism6和SPSS20.0进行数据分析。数据表示为平均值±SD。Kaplan–Meier分析用于估计生存曲线。PLEKHG5表达与临床病理特征之间的相关性，通过双尾确定x2测试。使用学生测试或方差分析分析各组之间的比较。P小于0.05被认为具有统计学意义。
    　　 为了确定PLEKHG5在人脑胶质瘤中的潜在功能，通过免疫组织化学在正常脑组织，低度胶质瘤和GBM中研究了PLEKHG5的表达水平。正常脑组织和不同等级的神经胶质瘤的IHC结果表明，与正常脑组织和LGG相比，GBMs的PLEKHG5表达水平相对较高，这表明PLEKHG5的表达水平可能是与神经胶质瘤的等级相关。但是，LGEK和正常脑组织中PLEKHG5的表达水平没有显着差异。这些结果表明，神经胶质瘤的等级与LGG中的PLEKHG5表达水平之间没有强相关性。PLEKHG5的较高表达水平可能表明神经胶质瘤组织的等级较高。接下来，研究表达PLEKHG5的神经胶质瘤组织的比率。发现尽管一些III和IV级神经胶质瘤组织的有PLEKHG5至多非常温和的表达，GBM中当与LGGs相比有PLEKHG5表达更高比率。PLEKHG5表达的比率与胶质瘤级增加中，这表明有胶质瘤等级和PLEKHG5表达的比率之间的相关性。此外，出国看病服务机构发现GBM中曾与LGG。超过一半的GBM具有相对较强的PLEKHG5表达强度。与GBM相比，大多数LGG的PLEKHG5表达强度较低。PLEKHG5表达的强度也随胶质瘤级中，这表明神经胶质瘤等级和PLEKHG5表达的强度之间的关系。总的来说，这些结果表明神经胶质瘤的等级与PLEKHG5表达的比率以及PLEKHG5表达的强度之间存在相关性。
    　　 出国看病服务机构打算确定神经胶质瘤患者的生存与PLEKHG5表达模式之间的相关性。为了证实获得的临床数据的质量，分析了神经胶质瘤等级与患者生存时间之间的关联。在临床数据中，较高级别的神经胶质瘤总是预后较差，生存时间较短，这表明临床数据质量良好。然后确定了患者存活率与PLEKHG5表达水平之间的关系。发现患者PLEKHG5表示胶质瘤始终有一个较差的生存时间。还在LGG，高级别神经胶质瘤，间变性神经胶质瘤和GBM中证实了这些发现。PLEKHG5表达的神经胶质瘤通常意味着预后较差。然后，调查了神经胶质瘤患者生存率与PLEKHG5不同表达水平之间的相关性。PLEKHG5在神经胶质瘤中的较高表达水平意味着患者生存较差，在高级别神经胶质瘤和GBM中也可以观察到相似的结果。最后，出国看病服务机构在TCGA数据库中确定了PLEKHG5的预后价值。与上述发现一致，TCGA数据库中GBM患者中PLEKHG5高表达的预后明显低于PLEKHG5低表达。所有这些结果表明，PLEKHG5的表达模式与神经胶质瘤患者的生存有关。
    　　 为了进一步确定PLEKHG5在神经胶质瘤进展中的潜在功能，在TCGA数据库中进行了PLEKHG5表达的相关分析，随后获得了8646个PLEKHG5相关基因。与PLEKHG5相关的基因中有4368个基因为正相关，而其他4278个基因为负相关。使用PLEKHG5相关的基因，GO分析表明PLEKHG5正相关的基因是主要参与细胞迁移，细胞粘附，血管生成，细胞增殖和细胞外基质拆卸。尽管PLEKHG5负相关基因可能主要参与大脑发育和神经系统发育，包括突触组织和化学突触传递。KEGG途径分析显示，PLEKHG5正相关基因在肌动蛋白细胞骨架，细胞粘附和与肿瘤进展相关联的信号传导途径的调控富集的中。PLEKHG5阴性相关基因与神经活动和神经信号相关。接下来，使用TCGA数据库，将患者分为PLEKHG5-high和PLEKHG5-low组。通过基因组富集分析分析了PLEKHG5表达与上皮-间质转化，基于肌动蛋白的细胞运动，细胞外基质分解和肌动蛋白细胞骨架调控之间的关系。EMT，基于肌动蛋白细胞运动，细胞外基质分解和肌动蛋白骨架的调节的基因签名都高度富集的患者PLEKHG5高表达中，这表明PLEKHG5参与这些生物过程。综上所述，这些结果提示PLEKHG5可能参与了肌动蛋白细胞骨架，细胞外基质的分解和EMT的调控，以调节神经胶质瘤细胞的迁移和侵袭。为了验证GO，KEGG和GSEA分析的结果，进行了迁移分析，以确定PLEKHG5对神经胶质瘤运动的影响。迁移分析表明，敲低PLEKHG5可以显着抑制U87MG和U251胶质瘤细胞迁移。蛋白质印迹分析显示PLEKHG5敲低抑制了MMP2和MMP9的表达，它们都是胶质瘤迁移和侵袭的重要基质金属蛋白酶，提示PLKEHG5至少部分地通过调节细胞外基质降解来促进胶质瘤迁移。此外，PLEKHG5的抑制下调了mDia的表达，mDia充当RhoA效应物，调节F-肌动蛋白的细胞骨架，支持肿瘤细胞的运动，意味着PLEKHG5参与神经胶质瘤细胞骨架组织。而PLEKHG5-siRNA的对间充质没有作用因子N-钙粘蛋白和波形蛋白，表明PLEKHG5不得参加EMT。
    　　 近年来，基于基因表达的分类，诊断，预后预测和治疗已引起抗肿瘤研究的极大兴趣。在正常组织和肿瘤中差异表达的基因具有作为诊断，预后指标和治疗靶标的潜力。首次确定PLEKHG5作为Rho特异性鸟嘌呤-核苷酸交换因子，是神经胶质瘤患者的一种新型预后生物标志物。PLEKHG5的较高表达水平表明神经胶质瘤组织的等级较高。而且，PLEKHG5表达的比例和强度均与神经胶质瘤的等级有关。与LGGs相比，GBMs始终具有较高的PLEKHG5表达比例和强度。PLEKHG5的表达模式也与神经胶质瘤患者的生存时间有关。PLEKHG5的高表达通常表明神经胶质瘤患者的预后较差，生存时间较短。转移是导致肿瘤复发的主要原因。为了侵入周围组织，神经胶质瘤细胞必须降解细胞外基质。在肿瘤细胞入侵的主要步骤中，ECM拆卸是一个重要过程。基质金属蛋白酶是可以降解ECM各种成分的主要蛋白质。MMP介导的ECM降解促进肿瘤的侵袭和转移。在所有的MMP中，MMP2和MMP9受到了更多的关注，因为据报道在神经胶质瘤，乳腺癌和肺癌中MMP2和MMP9的表达升高。MMP2和MMP9被认为对脑肿瘤的迁移和侵袭至关重要。通过GO，KEGG和GSEA分析，出国看病服务机构发现PLEKHG5参与了ECM拆卸。进一步的迁移测定和蛋白质印迹分析表明，PLEKHG5表达的敲低显着抑制了神经胶质瘤的迁移以及MMP2和MMP9的表达。所有这些结果表明，PLEKHG5通过调节可降解ECM的MMP参与肿瘤细胞的迁移和侵袭。
    　　 除了分泌蛋白水解酶降解ECM外，基于肌动蛋白细胞骨架的肿瘤细胞移动也很重要。它帮助肿瘤细胞移动到通过蛋白水解作用降解了ECM的区域，进一步渗入淋巴或血管，并最终扩散到远处的器官。GTPases的Rho家族是关键蛋白，不仅可以促进肌动蛋白和微管细胞骨架的组织，而且还可以调节细胞形态，细胞极性，细胞迁移和细胞侵袭。在RTP家族的Rho家族的所有成员中，RhoA，Rac1和Cdc42具有良好的特性，被视为细胞骨架，细胞迁移和侵袭的关键调节剂。RhoA被描述为调节应力纤维的组装。Rac1在片状脂膜的形成中很重要，而Cdc42被认为会影响丝状伪足的组装。此外，作为Rho的两个主要效应子，Rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶和果蝇通透性的哺乳动物同源物在肌动蛋白细胞骨架的调节中也很重要。一些研究表明，Rho/ROCK信号传导可以维持肌动球蛋白的收缩力，并随后使细胞具有变形虫侵袭性。尽管mDia也参与细胞黏附和细胞迁移，但一些研究表明mDia和ROCK可能相互拮抗，从而影响Rho诱导的细胞迁移。通过进行GO和KEGG通路分析，出国看病服务机构还发现PLEKHG5与基于肌动蛋白的细胞运动和肌动蛋白细胞骨架的调节密切相关。迁移分析和蛋白质印迹分析表明，敲除PLEKHG5表达可显着抑制神经胶质瘤迁移和mDia的表达。这些结果表明，PLEKHG5还通过调节肌动蛋白细胞骨架的组装也参与了肿瘤细胞的迁移和侵袭。
    　　 总之，出国看病服务机构确定PLEKHG5是一种新型的预后生物标志物，它与神经胶质瘤的等级和神经胶质瘤患者的生存时间有关。出国看病服务机构还确定了PLEKHG5与肿瘤转移的许多关键步骤有关。PLEKHG5可能调节蛋白水解酶的分泌和肌动蛋白细胞骨架的组装，以影响神经胶质瘤细胞的迁移和侵袭。PLEKHG5对神经胶质瘤运动的确切功能及其潜在机制需要进一步的研究。出国看病服务机构的结果基于一项基于医院的回顾性研究。应当指出，可能存在无法衡量的差异，可能会影响结果。需要进行多中心前瞻性研究来确认PLEKHG5在神经胶质瘤预后中的作用。
 
出国看病概况

海外医疗在国外发展较为成熟，比如在欧美等医疗技术发达国家，很多医院都设有国际病人办公室并配备多语种医学专业翻译人员，就医流程和模式都已相对成熟。在国内，海外医疗虽然还属于新兴行业，但发展势头迅猛，发展潜力巨大，市场前景广阔。
　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
出国看病适应症
靶向药物
 

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