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神经胶质瘤细胞细胞增殖
  • 　　癌症被定义为从细胞分裂和细胞死亡之间的平衡的破坏导致作为物理，化学或生物因素的结果细胞增殖失控。它仍然是世界上最重要的健康问题之一。原发性脑肿瘤主要是神经胶质瘤，而胶质母细胞瘤是最致命的。由于多种复杂因素，通常很难治疗胶质母细胞瘤。癌细胞发展对化疗药物耐药;脑是易于损坏由于与自我修复能力非常有限的常规疗法，和许多药物不能穿过血脑屏障作用于肿瘤。由于所有这些原因，如今研究人员一直在不断寻求治疗神经胶质瘤的更有效药物。近年来，天然材料已被视为药物开发中的重要资源。类黄酮是天然存在于植物来源的营养物中的化合物，具有9000多种口味。菲塞汀是类黄酮的亚组。人们对类黄酮的初步研究证明对心脏有保护作用，而在后来的研究中，这些化合物被确定具有多种生物学作用。不同浓度的非瑟酮通过停止细胞周期或通过不同的信号通路触发凋亡机制来抑制细胞增殖。在肝，肺，子宫颈中观察到了这些作用。前列腺，膀胱，白血病和肾癌细胞呈时间和剂量依赖性。
    　　 在这项研究中，在形态学和人胶质母细胞瘤的增殖不同剂量的漆黄素的效果细胞以剂量和时间依赖的方式影响。通过电子显微镜检查了非瑟汀诱导的T98G细胞的形态变化。另外，在同一研究中所选浓度的细胞凋亡/坏死的发生率和影响胱天蛋白酶3，CASPASE9，蛋白caspase8，BAX，BCL-2和存活还首次研究了mRNA表达。同样，在健康的人支气管上皮细胞中研究了非瑟定对正常细胞的可能的形态，细胞毒性和凋亡作用。因此，首次比较了非瑟定对神经胶质瘤细胞和正常细胞的形态，细胞毒性和凋亡作用。在这项研究中，人类GBM和健康人支气管上皮细胞用于从美国培养物保藏中心细胞系。将细胞在37℃在烧瓶中于5％CO2的湿润气氛中培养。培养基由Dulbecco改良的Eagle培养基，10％的胎牛血清和1％的青霉素-链霉素溶液组成。当达到汇合后，通过胰蛋白酶消化将细胞解离，依次混合并继代培养。
    　　 在每个实验之前，将非瑟酮溶解在二甲基亚砜中以制备储备溶液。每种新鲜制备的储备溶液均用作在生长培养基中制备稀释液的来源。用台盼蓝对细胞染色，并使用细胞计数装置确定细胞数。然后将细胞接种在96孔板中并孵育24小时。在24和48小时内研究了非瑟定浓度为1至500uM的细胞毒性作用。卡莫斯汀是临床上用于治疗GBM病例的药物，在研究中用作阳性对照。在两个不同的时间段内，研究了卡莫司汀浓度对T98G细胞活力的影响。所有实验至少进行了3次。根据计算处理细胞的生存力。数据表示为对照的平均百分率±平均值的标准误。使用单向方差分析，然后进行Tukey多重比较检验确定统计学显着性。通过倒置光学显微镜研究了在T98G细胞系中用fisetin处理24h引起的形态变化。
    　　 为了确定细胞器水平细胞的变化，使用了透射电子显微镜法。以每25-cm22.5×106个细胞的密度接种T98G细胞烧瓶。一天后，用50和100uM浓度的非瑟定处理细胞。处理后，用胰蛋白酶消化细胞，并用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次。在2.5％戊二醛中固定过夜。洗涤后，添加1％的四氧化，并进行二次固定。使样品分别通过分级的醇系列以进行脱水。随后，将细胞包埋在钠长石中，然后在60°C聚合48小时。样品的完整薄片用乙酸铀酰-柠檬酸铅染色，然后在TEM下进行检查。将T98G和BEAS-2B细胞以每孔1×104个细胞的密度接种到96孔板中。孵育24小时后，分别用浓度分别为50、100和200uM的非瑟汀和100、200和300uM的BEAS-2B细胞处理T98G细胞24小时。根据试剂盒方案进行细胞死亡检测ELISAPlus试剂盒。实验进行了三次。根据下式计算细胞中DNA断裂率的倍数变化：富集因子＝剂量组的吸光度/对照组的吸光度。使用未配对的t检验分析DNA片段的倍数变化，p小于0.05被认为是显着的。
    　　 50uM非瑟酮对影响和存活通过定量逆转录酶-聚合酶链反应方法确定24小时的mRNA表达水平。使用高纯RNA分离试剂盒分离总RNA。根据制造商的说明，使用快速入门必备的DNAGreenMasterKit使用LightCyclerNano仪器使用定量RT-PCR。β-肌动蛋白和GAPDH被用作管家基因进行标准化。所有实验至少重复三遍。相对基因表达水平通过2ΔCt方法计算，并通过GraphPadPrismV使用不成对t检验分析所有数据。采用基于线粒体活性的MTT法测定非瑟定浓度对T98G和BEAS-2B细胞增殖的影响。已确定在24小时内应用1uM的非瑟汀没有抑制T98G细胞的增殖。在其他浓度下，与对照组相比，细胞存活率分别降低了21％，55％，65％，67％，68％和70％。虽然在48小时1uM的非瑟汀没有任何抑制作用，但其他浓度的细胞存活率分别降低了31％，70％，80％，83％，84％和86％。IC50值计算为24小时为93uM，48小时为75uM。发现测试1uMfisetin24h不会在T98G细胞中引起任何形态学变化，并且与对照相比没有观察到差异。从50uMfisetin开始，细胞形态发生了变化，细胞数量减少了。同样，细胞间的相互作用也消失了。将分别用50和100uMfisetin处理24小时的T98G细胞的形态和细胞变化与对照组进行比较，并通过TEM进行检查。在对照组中，观察到组织良好的核染色质结构，核心膜的完整性，线粒体的管状结构和规则的ista，内质网的正常形态特征以及细胞质膜的完整性。用50uMFisetin处理的细胞显示线粒体完整性丧失。此外，在内质网中检测到一些自噬泡和扩张。同时，在细胞的细胞质中确定了不同大小的脂肪囊形成。观察到以收缩，染色质浓缩和细胞核降解为特征的早期凋亡迹象。
    　　 用100uM非瑟酮治疗后，线粒体和内质网消失。在细胞质中，在细胞膜中观察到囊泡结构和多层体以及结构缺陷。还发现细胞核以碎片状态被推到细胞边缘。获得的数据支持非瑟定可能引起凋亡细胞死亡的提示。为了确定由T98G和BEAS-2B细胞凋亡或坏死引起的DNA片段化，使用了细胞死亡检测ELISA试剂盒来确定DNA片段的存在。选择24小时的非瑟酮处理浓度，以接近根据MTT分析结果得出的IC50值：T98G细胞为50、100和200uM剂量，BEAS-2B细胞为100、200和300uM剂量。根据试剂盒方案中确定的公式计算细胞中的DNA片段化率，将非药物对照细胞的富集因子视为1。已经确定，非瑟汀治疗以剂量依赖性方式引起T98G细胞中凋亡DNA片段化的升高。发现细胞凋亡作用分别增加了3.7倍，4.4倍和5.3倍。在用相同浓度处理的细胞中，坏死作用分别增加了1.5倍，1.9倍和3倍。经测定，在T98G细胞25种50uM非瑟酮浓度增加的mRNA表达CASP3由2.4和152倍，分别相比于对照组。经计算，浓度为25uM时，不会引起CASP9和CASP8mRNA表达水平的任何变化，而50uM剂量时，CASP9mRNA表达增加3.5倍，而CASP8表达增加。Fisetin在浓度为50uM的情况下导致survivinmRNA表达降低0.2倍，而25uMfisetin不会引起任何明显的影响。发现BAX的mRNA表达分别提高了3倍和32倍，而BCL-2mRNA的表达分别降低了0.4倍和0.3倍非瑟汀治疗。
    　　 多形性胶质母细胞瘤是最危险的星形细胞肿瘤之一，被定义为脑胶质瘤生存率低，分化差，预后最差的脑肿瘤类型。菲西汀是植物中发现的一种类黄酮，对人体健康有积极作用。先前的研究表明，非瑟汀可以抑制各种肿瘤细胞中的细胞增殖或通过不同的信号通路触发细胞凋亡。在这项研究中，表明非瑟汀治疗以剂量和时间依赖性方式降低了T98G细胞的活力。在2015年检查了fisetin24和48h，发现它能抑制人胶质母细胞瘤细胞增殖，但在这些浓度下抑制细胞的侵袭和迁移。在人膀胱癌，肝癌，前列腺癌和早幼粒细胞白血病细胞上进行的非瑟酮相关研究相似，表明一定剂量下细胞增殖减少且随时间变化的方式。在另一项研究中发现用不同浓度的非瑟定处理的乳癌细胞的细胞活力降低了。同样，在七种不同类型的癌症中研究了各种浓度的非瑟定的细胞毒性作用，并且在HeLa细胞中具有最大的细胞毒性。24小时和48小时的IC50值分别确定为52和36uM。卡莫司汀浓度对T98G细胞活力没有明显影响。确定了10、100和1000uM卡马汀浓度72小时对T98G细胞增殖的影响。尽管检测到T98G细胞数量减少，但IC50值无法计算。
    　　 已发现增加的非瑟定浓度在BEAS-2B细胞中具有生长抑制作用。进一步证明了这一结果，在高浓度的健康人前列腺上皮，肺成纤维细胞和包皮成纤维细胞细胞中发生了对细胞活力的抑制。应用非瑟定的浓度会引起神经胶质瘤细胞的形态和超微结构变化，并具有凋亡的迹象。在A549细胞研究中，用10uMfisetin处理24h，观察到液泡量增加。另外，研究发现自噬体结构的存在可以由自噬细胞死亡引起。通过TEM显微镜比较了小鼠皮质神经元细胞中24h时5uMfisetin与对照细胞的剂量时，自噬囊泡数量的增加。在T24，EJ，PC3中通过不同方法测定了不同非瑟定剂量引起的凋亡变化。当出国看病服务机构比较T98G和BEAS-2B细胞时，发现非瑟酮在神经胶质瘤细胞中以剂量依赖性方式引起细胞凋亡。相反，在BEAS-2B细胞中发现300uMfisetin有坏死作用。先前使用不同方法进行的体外研究表明，非瑟汀可根据LNCaP，HIM-7，EJ，J82和PC3细胞系中的剂量和时间增加凋亡作用。确定这种凋亡作用是通过线粒体途径在人口腔鳞状细胞中发生的。
    　　 出国看病服务机构的研究表明，基于剂量增加，T98G细胞中的CASP3，CASP8和CASP9mRNA水平增加。与出国看病服务机构的结果相似，在HL-60，HepG-2，Caco-2和Suit-2细胞中caspase3活性增加了。在SK-HEP-1细胞系中，浓度40和80uM的非瑟定增加caspase3的活性。相比之下，施加了10uMfisetin24h，并通过RT-PCR方法确定在A549细胞中CASP3表达没有增加。研究人员还报告说10uMfisetin对于基因激活而言是低浓度。在另一项研究中，非瑟定增加了CASP3和CASP8的表达，而对HeLa细胞中CASP9的基因活性没有任何影响。另一方面，半胱氨酸蛋白酶3和9酶的活性增加了T24细胞系用80uM的fisetin处理。Survivin是调节细胞凋亡的凋亡抑制蛋白之一。发现在减少存活50uM的非瑟酮mRNA表达的生存造成的下降，最终导致引起的增加表达胶质瘤细胞凋亡CASP3和CASP9。没有关于在不同癌细胞中用非瑟汀治疗引起的survivinmRNA表达改变的数据。用非瑟定治疗通过剂量增加评估了T24细胞系中Bax蛋白的量和Bcl-2蛋白的量。但是，发现非瑟定不会在HL-60和A549细胞中引起BAX和BCL-2的任何变化。
    　　 在这项研究中，出国看病服务机构首次证明了在两个不同的时间段中，低剂量的非瑟酮在T98G中比BEAS-2B细胞更有效。此外，非瑟汀比卡莫司汀更有效。选定的非瑟汀浓度导致T98G细胞凋亡，并通过TEM和细胞死亡检测试剂盒进行了检测。此外，已表明在T98G细胞非瑟酮的低浓度增加的mRNA表达水平CASP3，CASP9，CASP8，和BAX和降低其的BCL-2和存活。考虑到这些结果，出国看病服务机构认为凋亡是在T98G细胞中触发的。出国看病服务机构认为非瑟定在神经胶质瘤细胞中具有凋亡作用，并且出国看病服务机构已经证明了重要的数据可用于未来的研究。
 
出国看病概况

海外医疗在国外发展较为成熟，比如在欧美等医疗技术发达国家，很多医院都设有国际病人办公室并配备多语种医学专业翻译人员，就医流程和模式都已相对成熟。在国内，海外医疗虽然还属于新兴行业，但发展势头迅猛，发展潜力巨大，市场前景广阔。
　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
出国看病适应症
靶向药物
 

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