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小胶质细胞和巨噬细胞减轻神经胶质瘤的生长
  • 　　胶质母细胞瘤是中枢神经系统的高度侵袭性肿瘤，其特征在于快速生长和侵袭。肿瘤对治疗的反应较差，整体存活率在21个月时仍然很低GB的恶性表型由一个良好的微环境支持，该环境通过一个活跃的分泌组进行编排。肿瘤相关的巨噬细胞和小胶质细胞占GB细胞含量的40％，是由肿瘤细胞产生的趋化因子招募的。然后，肿瘤诱导TAM产生可溶因子，例如IL-6，IL-1，TGF-B和基质金属蛋白酶，这些因子可增强GB细胞和神经胶质瘤干细胞的活力，侵袭，血管生成和增殖。还可以通过产生TGF-B和PD-L1等因子来诱导TAM抑制抗肿瘤免疫细胞。临床病理数据强调了TAM对GB进展的积极影响，这与更高的肿瘤等级和更差的预后与TAM人群的增加有关。TAM对神经胶质瘤细胞释放的旁分泌因子的分子应答显然是复杂的，并且涉及许多信号通路和转录因子，例如STAT和NF-κB。然而，很少关注这些信号通路产生的mRNA的转录后调控。出国看病网研究人员最近证明了RNA调节剂HuR可以调节这些信号通路产生的许多下游mRNA靶标，并且对激活的初级小胶质细胞的分子标记具有重大影响。HuR是ElavRNA结合蛋白家族的成员，并具有三个RNA识别基序。它对许多趋化因子，细胞因子和生长因子的3'非翻译区中存在的富含U和AU的元素具有结合亲和力。通常，HuR通过稳定转录本和提高翻译效率来正向调节靶mRNA。这些功能与HuR易位到细胞质，与多核糖体的缔合和与沉默miRNA的竞争有关。HuR还可以经常在内部核糖体进入位点或附近与5'UTR结合，并抑制或增强翻译。先前，报道了HuR在GB中的重要作用，该位置在肿瘤细胞中高度上调并在体内促进肿瘤进展。通过化学抑制或shRNA介导的沉默来阻断HuR可以产生有效的抗神经胶质瘤作用。在当前的研究中，假设TAM中的HuR表达通过调节关键细胞因子和趋化因子的表达而促进肿瘤进展。使用从TAM中删除了HuR的小鼠，观察到在同基因GB鼠模型中生存期显着延长，肿瘤大小减小，肿瘤内免疫细胞谱从免疫抑制转变为细胞毒性。这种免疫细胞转移可能与HuR缺失的TAM对肿瘤细胞产生的可溶性因子的分子和细胞反应改变有关。
    　　 为了收集GL261条件培养基，将Gl261细胞在新鲜干细胞培养基中培养24小时，并收集上清液用于下游应用。对于颅内注射，使用pGreenFire1-CMV转导GL261细胞。使用混合神经胶质培养方法从新生小鼠幼崽中分离出用于实验的PMG。从星形胶质细胞层脱落后，将小胶质细胞培养在巨噬细胞无血清培养基中进行下游测定。安乐死后，从小鼠中取出脾脏，并将其转移到置于50毫升管顶部的70um细胞滤网中。使用10毫升注射器柱塞将组织推过过滤器，并用10毫升冰冷的DMEM洗涤以制成单细胞悬液。通过离心收集细胞，并通过红细胞裂解缓冲液去除红细胞。然后将脾细胞重悬于DMEM中，在TC2自动细胞计数器上计数，并置于冰上进行流式细胞术染色。异氟烷完全麻醉后，以约7毫升每分钟的速度对小鼠进行15毫升冰冷的PBS心脏灌注。然后将无肿瘤幼稚小鼠的大脑或带有荷瘤小鼠肿瘤的大脑提取并切成小块，并在5毫升酶溶液中消化PBS补充2％FBS，1mg每毫升胶原酶和0.5mg每毫升DNaseI在37摄氏度下放置1小时。消化后将细胞通过70um细胞过滤器制成单细胞悬液，在30gPercoll中以400g离心30分钟以去除髓磷脂和细胞碎片。然后将细胞重悬于DMEM中，在TC20自动细胞计数器上计数，并保存在冰上进行流式细胞术染色。
    　　 将八至十二周大的HuRKO或同窝对照小鼠用于肿瘤颅内注射。用氯胺酮和甲苯噻嗪混合物诱导麻醉后，将鼠标正确放置在立体定位仪上，并使用0.45毫米的牙钻在前reg侧2毫米和前reg1毫米处钻一个毛刺孔。非切割位。使用由Harvard11Plus注射泵控制的26GHamilton注射器，以1uL每分钟的速率将104GL261-Luc细胞重悬于DMEM中进行2分钟注射。为了进行生存研究，每天两次监测小鼠，直到它们处于垂死状态记录生存时间。注射GL261细胞后，使用LuminaSeriesIII体内成像系统测量肿瘤的生长。为了成像，给小鼠腹膜内注射2.5mgD-荧光素底物，并在10分钟后成像。使用软件测量了感兴趣区域的发光。每秒光子用于组之间的比较。
    　　 从脾脏，骨髓，幼稚脑或荷瘤脑中分离出单细胞。对于流式细胞仪，2×106将细胞接种在96孔板中，并与ZombieAquFixableViabilityKit在4摄氏度下孵育20分钟。用染色缓冲液洗涤细胞，并在4℃下用荧光偶联的细胞表面标记物孵育30分钟，然后用染色缓冲液洗涤一次。对于细胞内标记染色，首先将细胞用固定溶液试剂盒固定20分钟，用渗透缓冲液洗涤一次，并在4℃在渗透缓冲液中渗透过夜。在第二天，将细胞用荧光偶联的细胞内标记物在4摄氏度染色30分钟。用染色缓冲液进行最后一次洗涤后，将细胞重悬于200uL染色缓冲液中，并在BDLSRII细胞分析仪上进行分析。如上所述，从带有肿瘤的大脑中分离出单细胞。来自一个样品的所有细胞均收集在5毫升Falcon圆底聚苯乙烯试管中。
    　　 异氟烷完全麻醉后，以7毫升每分钟的速度向小鼠心内灌注15毫升冰冷的PBS，然后以4毫升每分钟进行20毫升冰冷的4％多聚甲醛。提取脑并将其在4％PFA中固定在4摄氏度下过夜。在PrecisionBrainSlicer上将固定的大脑冠状切成2毫米，然后在70％的乙醇中脱水24小时。在将样品包埋在石蜡块中之前，先在Leica组织处理机上对其进行处理。对于免疫组织化学，将8um切片用以下抗体染色：1：200的HuR，1：50的Iba-1，1：1000的ki67、1的MPO50和CD4。使用illustraRNAspin试剂盒从细胞中提取总RNA，并通过Nanodrop进行定量。使用高容量cDNA逆转录试剂盒对一微克RNA进行逆转录。使用预先设计的TaqMan基因表达测定法通过实时qPCR测量目标mRNA的表达水平，并使用GAPDH作为参考基因，使用deltadeltaCT方法进行计算。
    　　 全细胞裂解液使用M‐PER哺乳动物蛋白提取试剂进行制备，并使用PierceBCA蛋白测定试剂盒进行定量。用Laem毫升样品缓冲液在95摄氏度变性50微克蛋白质提取物10分钟，然后使用4-20％的Mini-PROTEAN(R)TGX预制蛋白凝胶进行电泳分离。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，并用抗HuR和GAPDH抗体进行探测。将PMG以每孔5×105个细胞的密度接种在六孔板中，并以GL261条件培养基或干细胞普通培养基作为对照处理24小时。收集培养上清液，并通过ELISA定量以下趋化因子的浓度：CXCL1，CXCL2，CCL5，CXCL10。在巨噬细胞-SFM中，将PMG以5×105的密度接种在六孔板中。24小时后，将细胞用GL261条件培养基处理24小时。收集培养基用于酶谱分析。使用PierceBCA蛋白测定试剂盒对所有培养基样品进行定量。将200微克培养基与Zymogram样品缓冲液以1：2的体积混合，并使用含明胶的10％CriterionZymogramGel与凝胶进行电泳分离。凝胶在室温下变性30分钟，然后在37摄氏度过夜显影。第二天，首先用考马斯亮蓝R-250染色溶液将凝胶染色30分钟，然后脱色2小时。使用ImageJ扫描凝胶并定量。
    　　 使用具有8.0um膜孔的CorningBioCoatMatrigelInvasionChambers进行跨孔侵袭测定。对于PMG侵袭试验，将2.5×104HuRKO的单细胞悬液或对照PMG在巨噬细胞-SFM中的悬浮液添加到顶部腔室中，并将GL261条件化的干细胞培养基作为趋化剂添加到底部腔室中。使PMG在细胞培养箱中迁移24小时，然后使用Hema3手动染色系统和StatPack进行固定和染色。取出插入物并固定在显微镜载玻片和染色的细胞上。为了定量每个孔捕获了30张图像，并对染色的细胞计数。对于GL261入侵测定，2.5×104将干细胞培养基中的GL261细胞添加到顶室中。如上所述收集PMG条件培养基，并将其作为化学吸引剂添加至底部腔室。使GL261细胞迁移24小时，然后如上所述染色和定量。对于刮伤试验，将PMG以2×105的密度接种在Macrophage-SFM中的12孔板中。24小时后，用1毫升移液器吸头轻轻划伤PMG单层，使其穿过孔的中心。用GL261条件培养基代替培养基。使细胞在细胞培养室中迁移48小时。用OlympusIX73倒置显微镜捕获系列图像，并对迁移到间隙中的细胞进行计数。使用GraphpadPrism7进行统计分析。在所有实验中，使用了两面学生t检验对HuRKO和对照组进行比较。Kaplan–Meier生存曲线是使用GraphpadPrism7生成的。当p值<.05时，组之间的差异被认为是显着的。
    　　 为了生产Cx3cr1启动子驱动的HuR基因敲除小鼠，将HuR小鼠与在Cx3cr1启动子控制下表达Cre重组酶的小鼠杂交。为了验证HuR基因敲除，首先从新生幼仔中分离出了PMG，并通过流式细胞仪和westernblot评估了HuR的表达。蛋白质印迹证实不存在表达。接下来，出国看病网研究人员使用抗HuR和Iba1抗体通过免疫组织化学检查了成熟的小鼠大脑切片。在HuRKO脑中，由Iba1鉴定的细胞中没有HuR染色。在与PMG相邻的细胞中检测到免疫反应性，这些细胞可能是表达与3A2抗体交叉反应的HuR或其他神经元Hu抗原的神经元。在对照脑中，存在Iba1和3A2的共定位免疫染色，与小胶质细胞HuR表达及其典型的核定位一致。为了确定HuRKO是否影响大脑中PMG的数量，出国看病网研究人员通过流式细胞仪对源自全脑的单细胞悬液进行了定量分析。对照和HuRKO小鼠之间的总小胶质细胞计数相似，约为12％，通过组织学进行的小胶质细胞计数范围内。由于Cx3cr1在单核吞噬细胞中更广泛地表达，因此对源自脾脏的细胞进行了流式细胞术，以确定降低的HuR表达的程度。观察到细胞的HuR平均荧光强度总体上显着降低。对骨髓亚群的进一步分析显示，与对照小鼠相比，巨噬细胞，多形核细胞和单核细胞的HuRMFI减少。在培养的PMG细胞中，与KO小鼠中没有HuR的峰完全分离。综上所述，HuR表达在髓样细胞群中降低，这与先前在单核吞噬细胞系统中更广泛地观察到的Cx3cr1活性相一致。
    　　 将表达荧光素酶报告基因和绿色荧光蛋白的GL261胶质瘤细胞颅内注射到对照组和HuRKO小鼠中以产生肿瘤。荧光素酶活性的体内连续成像显示，随着时间的推移，HuRKO小鼠的发光显着减弱，与肿瘤大小减小相一致。将其用8天中。通过抗-ki67抗体的免疫组织化学染色评估了肿瘤的增殖。来自HuRKO肿瘤的阳性细胞减少了大约三倍，表明对肿瘤细胞增殖有显着影响。通过流式细胞仪评估了具有恶性神经胶质瘤的小鼠大脑，以量化免疫细胞的亚群。HuRKO小鼠的免疫细胞总体CD45数量显着较低，为60％，而对照小鼠为70％。有在噬细胞减少了50％，如通过定义的CD11b+和CD45相对于对照小鼠。对照和HuRKO小鼠的肿瘤切片的免疫组织化学显示，HuRKOTAM中没有HuR免疫染色，而对照肿瘤中则有丰富的HuR染色。在来自对照部分的许多TAM中，HuR免疫反应性与Iba1融合，这与HuR在细胞质中的重新分布和激活一致。带有M1和M2标记的TAM的进一步分析显示，HuRKO小鼠中M1TAM的百分比增加了两倍。另一方面，HuRKO中M2极化的TAM降低了两倍。HuRKOTAM中MHCII的MFI较高。HuRKO小鼠的CD45-GFP+肿瘤细胞上MHCII的表达是对照小鼠的两倍。接下来评估了TAM和MG的PD-L1，PD-L1是一种可在这些细胞中被肿瘤诱导的配体。正如高MFI所反映的那样，该配体在TAM中被大量检测到，但在MG中仅处于低水平。与对照组相比，来自HuRKO脑的TAM中PD-L1表达明显较低。出国看病网研究人员研究了Gr1Ly6G+多形核髓样抑制细胞，并观察到HuRKO脑肿瘤减少了2.5倍。单核细胞-的MDSC。用抗髓过氧化物酶抗体免疫染色的代表性肿瘤切片在对照小鼠中沿肿瘤边界显示了PMN簇，这在HuRKO小鼠中未见，与流式细胞仪数据一致。总之，HuRKO改变了肿瘤微环境中的髓样群体，增加了促炎作用并抑制了抗炎作用。
    　　 随着在HuRKO小鼠中观察到的TAM减少，接下来确定了HuR的丧失是否响应胶质瘤细胞的趋化信号抑制了迁移或侵袭特性。出国看病网研究人员用幼稚小鼠的培养对照和HuRKOPMG进行了该实验。使用基质胶包被的transwell系统将PMG置于上室，将来自GL261细胞的条件培养基置于下室。对于野生型PMG，观察到向GL261CM的大量迁移，但在对照培养基中几乎没有运动，这与先前观察到的胶质瘤细胞分泌PMG的有效趋化因子的观察结果一致。使用GL261CM，HuRKOPMG的迁移被抑制了两倍以上。使用刮擦试验，出国看病网研究人员观察在暴露于GL261CM后，HuRKOPMG进入间隙的运动有类似的两倍衰减。接下来评估了HuR抑制对PMG趋化胶质瘤细胞的能力的影响。使用经过siHuR处理的PMG的CM，与对照相比，观察到迁移的GL261细胞受到了近三倍的抑制。综上所述，这些发现表明HuR在向神经胶质瘤细胞的小胶质细胞迁移吸引和向PMG的化学胶质细胞的化学吸引中起重要作用。这些细胞的迁移特性失调可能有助于HuRKO小鼠微环境的改变和肿瘤生长的减少。
    　　 首先分析了PMG可能影响MG和神经胶质瘤细胞迁移吸引谱的趋化因子和毫米Ps的表达。对受影响的趋化因子进行了初步筛选，并对经过GL261CM处理24小时的HuRKOPMG进行了多重分析。然后通过qPCR和ELISA进一步分析明显改变的神经胶质瘤相关趋化因子。HuRKOPMG中的CXCL1和CXCL2mRNA在基线降低了两倍，而CXCL10和CCL5则增加了3倍和11倍。使用GL261CM处理后，对照PMG中的趋化因子mRNA的诱导作用较基线高160倍至430倍。与未刺激的细胞相似，HuRKOPMG中的模式发生了变化，尽管CXCL1和2更为明显。为了确定体内的模式是否相似，通过荧光激活细胞分选从原发肿瘤中分离了TAM，并通过qPCR评估了mRNA的变化。发现趋化因子表达的差异模式匹配培养的PMG。接下来，出国看病网研究人员在GL261CM处理之前和之后，通过ELISA在培养的PMG培养基中通过ELISA测量了这些趋化因子。在基线时HuRKOPMG中CXCL10和CCL5明显增加了四倍。使用GL261处理后，在对照中检测到高水平的CXCL1和2，但在HuRKOPMG中被抑制了2到3倍。HuRKOPMG中的CXCL10和CCL5保持增加，但幅度较小。研究了毫米P-2和9，这两种与胶质瘤细胞迁移和侵袭有关的关键金属蛋白酶。在基线时，毫米P2mRNA被抑制了四倍以上。暴露于GL261CM后，对照PMG的诱导增加了30倍，而HuRKOPMG中的诱导减少了3倍。另一方面，HuRKOPMG中的毫米P-9mRNA在基线时增加了约2.6倍。GL261CM处理后，观察到了类似的模式，尽管总诱导比毫米P-2小得多。用GL261CM处理后，使用PMG的CM对两种毫米P进行Zymography。HuRKOPMG中pro-毫米P2的衰减是2.5倍，而毫米P-9没有明显变化。综上所述，这些发现表明，PMG中HuR的丧失对趋化因子和毫米P对神经胶质瘤细胞分泌因子的分子反应具有混合作用。在用GL261CM处理的PMG中，检查了与M1和M2样表型相关的细胞因子，以确定HuR缺失的影响。基线时，经典与M1样激活相关的标志物的mRNA低，但GL261CM治疗后IL-1B和IL-6的增加了1000倍以上，TNF-α的增加了15倍。HuRKO显着减弱了所有三种诱导，最显着的是IL-6。GL261CM可抑制COX-2，但在HuRKOPMG中未改变。PMGCM的ELISA显示这些蛋白质总体上显着增加，对于HuRKOPMG，IL-1的抑制率为50％，IL-6的抑制率为约30％。TNF-α未见变化。对于与M2相关的标记，产生了混合的影响。GL261CM治疗后，TGF-B1总体上被抑制，但HuRKOPMG中TGF-B1总体抑制了25％。CM处理后，YR1在HuRKOPMG中衰减了50％。IL-10和精氨酸酶1升高。PMGCM的ELISA与mRNA模式平行，显示出TGF-B1减弱和IL-10显着增加。除这些标志物外，研究了PD-L1和VEGF，这是促进肿瘤进展的两个因素。观察到在GL261CM处理后，两种mRNA的HuRKOPMG均受到抑制，对于PD-L1更明显。这种减少与体内TAM中观察到的减少一致。分泌的VEGF减少约40％。两者合计，PMG中HuR的丧失导致抑制与GL261细胞分泌的因子有关的经典与M1型表型相关的细胞因子和几种促肿瘤因子，但对经典与M2相关的标志物具有混合作用像表型。
    　　 HuRKO小鼠的肿瘤内PMN-MDSC减少，M1超过M2TAM群体，MHCII在TAM和肿瘤细胞中的表达增加以及PMG产生的T细胞相关趋化因子CXCL10的增加的发现促使出国看病网研究人员确定是否肿瘤浸润性T细胞的变化可能导致肿瘤表型减弱。在胶质瘤细胞注射后14天通过流式细胞术评估了对照和HuRKO脑中的T细胞群体。用于T细胞分析的门控策略。对于CD8+T细胞，观察到HuRKO小鼠的GranzymeB+亚群增加了近三倍，而整个CD8群体没有定量变化。另一方面，HuRKO小鼠的CD4+T细胞百分比几乎增加了四倍。通过用抗CD4抗体进行免疫染色也可以看到这种增加。虽然瘤内的FoxP3+CD4+Treg细胞是在的HuR敲除小鼠增加，但在FoxP3的亚群增加四倍-CD4+效应T细胞和CD4+表达GranB效应T细胞在的HuR敲除小鼠几乎高两倍。IFNγ+细胞的增加更大。因此，多功能CD4+在HuRKO小鼠中，在肿瘤中表达GranB和IFNγ的效应T细胞都增加了。两者合计，CD8+和CD4+T细胞区隔的肿瘤浸润细胞毒性效应T细胞增加，这可能是HuRKO小鼠增强的抗肿瘤反应的基础。
    　　 HuR通过调节TAM的分子标记而在神经胶质瘤的发展中起重要作用。这些细胞中HuR的缺失改变了肿瘤微环境，导致神经胶质瘤肿瘤生长的显着减弱和延长的生存期。在HuRKO肿瘤中，TAMs向着MHCII表达水平较高的M1型表型转移，PMN-MDSCs减少。在肿瘤微环境中，细胞毒性效应T细胞群体增加。HuR的丧失导致关键细胞因子，趋化因子和其他因素的产生变化，这些因素驱动这些细胞迁移并降低了肿瘤的生长。发现强调了TAM的分子可塑性以及它如何影响神经胶质瘤的进展。TAM代表GB的很大组成部分，并响应CSF-1，MCP-1和GDNF等分泌肿瘤的化学吸引剂而主动迁移至肿瘤。对照和HuRKO小鼠肿瘤中的大多数CD45+细胞均为CD45，与组织M+和GB特征一致。在KO小鼠中，神经胶质瘤肿瘤内的IBA1+细胞不存在HuR，巨噬细胞周围则减少，表明PMG和巨噬细胞均表达Cre重组酶。这与先前的观察结果一致，即在募集到神经胶质瘤肿瘤之后，Cx3Cr1的外周巨噬细胞表达增加。HuRKO小鼠中TAM的减少可能是多因素的，反映出化学引诱的固有缺陷以及与神经胶质瘤细胞改变的串扰的结合。神经胶质瘤产生的可溶性因子的强大化学趋化作用在transwell数据中得到了强调，其中GL261CM迁移的PMG增加了约60倍。在穿孔和刮擦试验中，HuRKOPMG向GL261CM的迁移明显减少表明趋化和迁移方面存在缺陷。这一发现与出国看病网研究人员先前使用ATP作为化学引诱剂对PMG中siRNA诱导的HuR敲低的观察结果一致。在该报告中，对经脂多糖刺激和HuR沉默的PMG的RNA测序分析显示，调节趋化因子反应的几种mRNA显着减弱，包括CCR2和BAIAP2对丝虫足形成和细胞迁移很重要。因此，出国看病网研究人员发现PMG迁移减少的原因可能是趋化因子的感知减弱或迁移受损。第三种可能性是减少与ECM修饰剂衰减有关的细胞外基质分解。这可能会影响PMG和神经胶质瘤细胞的迁移。例如，HuRKOPMG中的毫米P-2明显减弱。毫米P-2的3'UTR包含HuR可以结合并调节表达的富含AU的元件。毫米P-2的显着抑制可能在体内对GB产生更大的影响，因为毫米P-2在分解ECM以促进神经胶质瘤细胞的迁移和侵袭中起关键作用。毫米P-9在HuR基因敲除后在RNA水平上增加，在3'UTR中也有ARE，并且在其他细胞系统中受到HuR的正调控。这些相反的作用可能反映了HuR的多效性功能，或者是HuRKO对其他基因靶标的间接作用。HuR可以正向调节MG中的其他ECM调节剂，包括毫米P12，ITGB3，Adamts1和血小板反应蛋白1，它们也有助于小胶质细胞和神经胶质瘤细胞迁移。
    　　 在HuRKO小鼠中观察到的TAM减少可能是由于与神经胶质瘤细胞的串扰改变所致。TAMs产生分泌因子，这些因子可调节神经胶质瘤细胞产生的趋化因子。例如，由GL261CM在PMG中强烈诱导的IL-1B刺激神经胶质瘤细胞产生CCL2，从而增强TAM的募集。HuR缺失的PMG中IL-1B表达的减弱可能会破坏前馈回路并减少TAM募集。除了数量变化外，HuRKO小鼠的TAM极化也朝着M1型表型转移。GB和其他肿瘤具有M1和M2样TAM的混合物，通常这些细胞具有两种表型的元素。通常，M2类TAM在响应诸如M-CSF等分泌因子时以GB的形式积累，从而促进免疫抑制和肿瘤进展。然而，M1样TAM对肿瘤具有细胞毒性，因此观察到的变化可能导致HuRKO小鼠的肿瘤生长减弱和存活时间延长。实际上，将TAM重新编程为M1样表型代表了GB治疗开发中正在寻求的一种治疗方法。除了数量增加外，HuRKOTAMs的总体MHCII表达也更高，这将促进其对CD4+T细胞的抗原呈递活性并增强抗肿瘤反应。这与GB特别相关，因为神经胶质瘤相关的TAM通常抑制MHCII表达。HuRKO肿瘤中的神经胶质瘤细胞显示出较高的MHCII表达，可以促进抗原呈递并使它们成为CD4+细胞毒性效应细胞的靶标。无论来源如何，肿瘤内的MHCII分子都是触发抗肿瘤免疫反应的关键。CD4+细胞毒性T细胞可从包括Tregs在内的多个子集发育而来。通过MHCII依赖性方式，CD4+细胞毒性T细胞可以直接排斥肿瘤。激活的效应细胞也可以拮抗Treg的免疫抑制作用，这可以减轻HuRKO小鼠中这些细胞的存在增加的影响。前馈回路也可能发挥作用，因为产生IFNγ的效应细胞的增加将进一步促进TAM的M1样极化。TAM中PD-L1的下调可能会进一步增强HuRKO肿瘤中的抗肿瘤T细胞活化。PD‐L1是一种跨膜蛋白，由肿瘤细胞和TAM表达，与T细胞上的PD‐1受体结合并抑制其活化和抗肿瘤免疫力。虽然PD‐L1作为免疫抑制来源的相对贡献因肿瘤类型而异，但TAM可以维持PD‐L1表达并提供扩展的免疫抑制作用。PD-L1在大多数人类GB肿瘤中被检测到，并与肿瘤的分级，增殖和血管生成的标志物以及预后较差相关。有趣的是，HuRKO小鼠中的TAMs表达的PD-L1水平要低得多，而PMG的体外测试表明，GL261CM对PD-L1的诱导被HuR缺失显着减弱了。PD-L1转录本在3'UTR中带有丰富的AU序列，它们是推测的HuR结合基序。致癌RAS信号传导通过阻断RNA不稳定剂TTP来上调PD-L1表达，TTP可以与3'UTR中的相似基序结合。出国看病网研究人员最近的发现支持了HuR的积极调节作用，即当使用HuR的小分子抑制剂MS-444处理神经胶质瘤异种素时，PD-L1mRNA减弱。
    　　 HuRKO小鼠中免疫细胞谱的改变可能与TAM分子标记的其他变化有关。有强烈的CXCL10诱导作用，可增强CD4+和CD8+细胞的募集和积累并使它们极化以增强抗肿瘤活性。CXCL10还可以直接抑制神经胶质瘤细胞增殖并促进细胞凋亡。另一方面，CCL5也增加了，并且这种细胞因子已经与包括胶质瘤在内的多种癌症的肿瘤进展有关。PMG中HuR的丧失对其他激活标记物有混合的影响，这些标记物通常与促炎或抗神经胶质瘤表型不符。例如，与替代激活相关的标记受HuR删除的影响不同。IL-10和AG1显着上调，而YM1和TGF-B1下调。另一方面，HuR缺失抑制了与M1型表型相关的经典标志物，包括IL-1，IL-6和TNF-α。这些细胞因子与神经胶质瘤的进展有关，它们的抑制作用可能导致HuRKO小鼠的增殖减弱和整体肿瘤生长减弱。此外，小胶质细胞产生的IL-6和TGF-B通过支持神经胶质瘤干细胞来促进神经胶质瘤的生长。VEGF，尽管不是经典的激活标记，但在胶质瘤细胞CM的HuRKOPMG中被抑制。TAM是神经胶质瘤细胞信号转导的肿瘤微环境中VEGF的来源，其通过HuR缺失而减弱将进一步导致HuRKO小鼠的肿瘤生长和增殖减少。有趣的是，已经与巨噬细胞的促炎状态相关的COX-2mRNA在神经胶质瘤CM治疗后减弱了，但并未受到HuR缺失的进一步影响。出国看病网研究人员先前证明了它在结肠癌中受到HuR的正调控，再次表明HuR对特定靶标表达的影响是细胞依赖性的，并且可能是依赖刺激的。另一方面，IL-10的上调是出乎意料的，原因是在其3'UTR中存在ARE，并且HuR作为正调节剂起着主要作用。IL-10在GB和其他癌症中具有多效性，可促进或抑制肿瘤进展，具体取决于肿瘤内的免疫细胞组成和环境中的细胞因子。HuR对与M1和M2样表型相关的调节标记物的混合作用强调了小胶质细胞激活是多维的，不能归类为这两个极化状态之间的线性光谱。HuRKOTAM中MHCII的同时上调和“经典”M1标记物的减少表达强调了这一概念。在恶性神经胶质瘤中，许多与经典M1型表型有关的分泌细胞因子实际上促进了肿瘤的进展，而MHCII的增加促进了抗肿瘤性。肿瘤免疫细胞活性。虽然出国看病网研究人员使用神经胶质瘤细胞中的CM来诱导PMG，但可能的警告是，体外条件不能完全概括肿瘤的微环境。但是，TAM中的分子反应与培养的PMG之间的一致性减轻了这种可能性。
    　　 可以增强抗肿瘤活性的HuRKO肿瘤内免疫细胞谱的另一个主要变化是PMN-MDSCs的减少。中性粒细胞增多症是GB患者的常见特征，PMN的肿瘤内浸润与神经胶质瘤等级相关。PMN‐MDSC主要通过免疫抑制T细胞功能促进肿瘤进展，其免疫耗竭抑制神经胶质瘤生长。出国看病网研究人员的数据提供了几种可能性来解释PMN-MDSC的减少。首先，CXCL1和CXCL2是这些细胞的主要癌症相关化学引诱剂，在体内HuRKOTAM和体外HuRKOPMG中显着减弱。在出国看病网研究人员之前的工作中发现使用LPS刺激的HuR沉默的PMG的条件培养基在体外对嗜中性白细胞的趋化性显着下降。在PMN人群中降低的HuR表达也可能影响其活动性或趋化性。M‐MDSC群体没有减少，但是单核细胞的HuR表达也有类似的减少。最后，降低的PMN渗透可能与HuRKOTAMs或胶质瘤细胞因肿瘤微环境改变而改变的其他一些化学吸引剂有关。总之，TAMs中的HuR基因敲除对恶性神经胶质瘤的肿瘤微环境有重要影响，从而导致肿瘤抑制和延长生存期。HuR缺失改变了TAM的分子标记，通过浸润性免疫细胞及其活性的改变和营养支持的丧失促进了TAM的抗肿瘤表型。先前出国看病网研究人员已经证明神经胶质瘤来源的HuR是肿瘤细胞存活和进展不可或缺的部分，并且本报告中的发现进一步强调了其重要性胶质瘤的进展和作为这种毁灭性疾病的治疗靶标的潜力。
 
出国看病概况

海外医疗在国外发展较为成熟，比如在欧美等医疗技术发达国家，很多医院都设有国际病人办公室并配备多语种医学专业翻译人员，就医流程和模式都已相对成熟。在国内，海外医疗虽然还属于新兴行业，但发展势头迅猛，发展潜力巨大，市场前景广阔。
　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
出国看病适应症
靶向药物
 

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