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替莫唑胺治疗神经胶质瘤
  • 　　胶质瘤是最常见的致死性颅内肿瘤，预后较差。迄今为止，手术切除是神经胶质瘤的主要治疗方法。胶质瘤通常具有高浸润性和广泛浸润的特征，在手术后易于复发。术后必须进行化学疗法。替莫唑胺是一种烷化剂，被用作神经胶质瘤的一线治疗药物。TMZ能够穿过血脑屏障到达病变处，在那里将DNA烷基化/甲基化并触发神经胶质瘤细胞的死亡。TMZ治疗可改善生活质量并延长神经胶质瘤的寿命患者。然而据信TMZ抗性的出现是神经胶质瘤化疗失败的原因。因此，为改善神经胶质瘤患者的预后，阐明对TMZ耐药的分子机制具有重要意义。环状RNA是一种新型的非编码RNA类型，通常来源于反向剪接。随着RNA深度测序技术的飞速发展，circRNA不再被视为“异常RNA剪接的产物”，而是一种在各种细胞过程中起着至关重要作用的功能性RNA。CircRNA的特征是带有共价的不带5'和3'尾巴的闭环，提供增强的稳定性并赋予对核酸外切酶介导的降解的抗性。显示出circRNA具有几个miRNA结合位点，这赋予了它们与MessengerRNA竞争microRNA反应元件的能力。这使得circRNA发挥miRNA海绵的作用，调节细胞功能。目前circRNA已经成为RNA领域的研究热点。circRNA在神经胶质瘤中异常表达，并被认为是化学抗药性的机制。因此，鉴定神经胶质瘤中circRNAs失调对于阐明化学抗性发展的分子机制具有重要意义，并为克服化学抗性提供了新的见解。已发现新型鉴定的circRNAcircRNACEP128在膀胱癌中被上调。但是，关于circCEP128在神经胶质瘤进展和化学耐药中的作用的研究相对较少。
    　　 miRNA是一组小的非编码RNA，代表了一种新的基因调控机制，并在各种生物学过程中起着强大的作用。miRNA能够通过与3'非翻译区结合来调节mRNA的翻译和稳定性。基于序列同源性，miRNA能够同时抑制多个靶标mRNA的表达，从而影响基因网络和细胞信号传导。最近越来越多的研究将miRNA的失调与肿瘤的发展联系起来。在神经胶质瘤中，发现miRNA在化学抗性中起着至关重要的作用。然而，尚未发现circCEP128是否在神经胶质瘤细胞的化学耐药机制中起miRNA海绵的作用。在研究中发现circCEP128在神经胶质瘤组织和细胞系以及TMZ耐药神经胶质瘤细胞中上调。在机械上，circCEP128的下调通过调节miR-145-5p抑制神经胶质瘤细胞的增殖，并增强神经胶质瘤细胞对TMZ的敏感性。这些结果发现，靶向circCEP128可能是克服脑胶质瘤对TMZ耐药的一种有前途的治疗策略。胶质瘤组织及其邻近的正常组织取自临床医学院外科手术的30例胶质瘤患者。获得临床医学院审查委员会的伦理批准，并获得所有参与者的书面知情同意。
    　　 正常人星形胶质细胞和神经胶质瘤细胞系在含有10％胎儿的Dulbecco改良的Eagle培养基中繁殖。牛血清和1％链霉素在5％二氧化碳和95％空气中，在37°C下。通过逐步将其亲本细胞暴露于递增剂量的TMZ中，建立了对TMZ耐药的神经胶质瘤细胞系。sh-circCEP128，sh阴性对照，miR-145-5p，抑制剂-NC，miR-145-5p抑制剂购自GenePharma。为了过量表达circCEP128，通过将circCEP128的完整序列引入pcDNA-3.1载体中来生产pcDNA-circCEP128构建体。按照制造商的说明使用Lipofectamine2000进行细胞转染。使用TRIzol试剂进行RNA分离。circCEP128和ATP结合盒超家族G成员2是使用一步TBGreenPrimeScript实时聚合酶链反应试剂盒通过以下引物测定的。使用引物进行TaqManmiRNA分析，用引物测定miR-145-5p的表达。所有分析均在ABI7900快速实时PCR系统上进行。circCEP128的相对表达，ABCG2使用2和miR-145-5p进行定量ΔΔCT方法，与用作内部对照B肌动蛋白和U6。使用RIPA裂解缓冲液提取组织和细胞中的总蛋白。蛋白质定量后，用12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离等量的蛋白质，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。用5％脱脂奶封闭聚偏二氟乙烯膜，并在4°C下过夜孵育ABCG2一抗和B-肌动蛋白免疫印迹。与合适的辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育1小时后，使用ECL试剂盒开发了来自二抗的信号，并使用ImageJ软件进行了定量。通过细胞计数试剂盒8分析和集落形成分析评估circCEP128敲低对神经胶质瘤细胞增殖和化学抗性的影响。
    　　 对于CCK-8分析，将U251，U87，U251/TMZ和U87/TMZ细胞悬浮并铺板在96孔板上。孵育24小时后，将细胞用sh-CEP128，miR-145-5p，pcDNA-CEP128或相匹配的对照转染，然后以递增剂量的TMZ孵育30分钟。48小时。随后，将细胞用CCK-8溶液在37°C处理1小时，并使用酶标仪测定450nm处的吸光度。为了进行集落形成测定，用sh-CEP128或sh-NC转染U251和U87细胞。转染后48小时，收集细胞并将其接种在6孔板上。细胞接种后第12天，将细胞用戊二醛固定15分钟，然后用0.5％结晶紫溶液染色20分钟。在显微镜下以100×放大倍数手动计数细胞数大于50的菌落数。将circCEP128的完整序列亚克隆到pGL-3载体中，以生成WT-CEP128构建体。同样将突变引入circCEP128序列内的miR-145-5p结合位点，然后融合到pGL-3载体中生成MUT-CEP128构建体。WT-CEP128序列被突变为MUT-CEP128。将这些萤光素酶报告载体与miR-145-5p，miR-145-5p抑制剂或匹配的对照一起转染到U251/TMZ细胞中。转染后48小时使用双重荧光素酶测定系统测量荧光素酶活性。数据表示为平均值±SEM，并使用SPSS20.0软件进行分析。使用Student'st检验或单因素方差分析进行组间比较，认为P小于0.05为显着。
    　　 首先，出国看病网研究人员尝试使用qRT-PCR评估circCEP128在神经胶质瘤中的表达。与邻近的正常组织相比，神经胶质瘤组织中的circCEP128被上调。同样，相对于正常人星形胶质细胞，在神经胶质瘤细胞系中发现了circCEP128的上调。为了探索circCEP128在TMZ耐药中的功能，建立了TMZ耐药细胞系，并使用qRT-PCR分析了circCEP128在TMZ耐药细胞中的表达。与它们的亲代细胞相比，在TMZ抗性细胞系中发现了高表达的circCEP128。另外通过qRT-PCR确定，与U251和U87细胞相比，在U251/TMZ和U87/TMZ细胞中ABCG2的表达被上调。同样，也通过western印迹证实了。为了进一步解决circCEP128的功能作用，用sh-CEP128转染了U251和U87细胞，并使用qRT-PCR分析了转染效率。相对于sh-NC组，在sh-CEP128组中circCEP128的表达明显降低）。circCEP128的下调抑制了增殖，并降低了U251和U87细胞的集落形成能力。
    　　 在TMZ处理后，U251和U87的存活率呈剂量依赖性降低，并且在circCEP128敲低后，这种作用可以增强。类似地，TMZ处理以剂量依赖的方式降低了U251/TMZ和U87/TMZ细胞的活力，而circCEP128的抑制作用增强了TMZ在U251/TMZ和U87/TMZ细胞中的细胞毒性功效。如通过蛋白质印迹所确定的，对circCEP128的抑制显着降低了U251/TMZ和U87/TMZ细胞中ABCG2的表达。鉴于miR-145-5p在癌症中的作用，研究miR-145-5p在神经胶质瘤细胞化学耐药性中的作用。使用qRT-PCR检测到U251，U251/TMZ，U87和U87/TMZ细胞中的miR-145-5p表达。结果表明，与U251和U87细胞相比，在U251/TMZ和U87/TMZ细胞中miR-145-5p的表达显着降低。将miR-145-5p抑制剂，sh-CEP128或匹配的对照转染到U251，U87和U251/TMZ细胞中，并使用qRT-PCR验证了转染效率。正如预期的那样，在用miR-145-5p转染的细胞中，miR-145-5p的表达显着增加，但在用miR-145-5p抑制剂转染的细胞中，表达显着下降。为了证实circCEP128与miR-145-5p之间的相互作用，进行了qRT-PCR，AGO2RNA免疫沉淀和荧光素酶报告基因检测。发现sh-CEP128敲除circCEP128明显提高了U251，U87和U251/TMZ细胞中miR-145-5p的表达。
    　　 正如生物信息学工具所预测的那样，出国看病网研究人员发现circCEP128序列包含miR-145-5p的假定结合位点。萤光素酶报道基因测定表明，WT-CEP128分子的萤光素酶活性被miR-145-5p抑制，但被miR-145-5p抑制剂增强。当将突变引入circCEP128序列的miR-145-5p结合位点时，miR-145-5p或miR-145-5p抑制剂的作用消失了。为了进一步验证CEP128-miR-145-5p轴如何调节神经胶质瘤细胞增殖和神经胶质瘤细胞对TMZ的化学敏感性，用miR-145-5p和pcDNA-CEP128转染U251/TMZ细胞。miR-145-5p的过表达抑制U251细胞的增殖，而circCEP128的过表达可阻止这种抑制。同时，miR-145-5p转染后，U251/TMZ细胞的活力显着降低，而circCEP128的过表达消除了该作用。除了miR-145-5p的过表达外，U251/TMZ细胞中ABCG2蛋白的表达也下调，而circCEP128过表达则使ABCG2蛋白的表达显着消失。
    　　 TMZ抗性的发展代表了治疗神经胶质瘤的主要障碍，但是其潜在的机制非常复杂并且仍然知之甚少。circRNA已在多种肿瘤中广泛讨论，被认为是神经胶质瘤的潜在治疗靶点。因此，特异性操纵circRNAs可能是改善神经胶质瘤患者预后的有效方法，这需要出国看病网研究人员探索circRNAs如何影响神经胶质瘤细胞的化学敏感性。尽管出国看病网研究人员对circRNA的了解在增加，但对其在化学抗性发展中的作用了解甚少。已经将circRNA的失调与化学抗性的发展联系起来。在骨肉瘤中，circPVT1的上调与预后不良有关，暗示了circPVT1的潜在诊断作用。此外，通过下调ATP结合盒亚家族B成员1的表达，circPVT1的下调增强了骨肉瘤细胞对阿霉素和顺铂的敏感性。具有条件circPAN3抑制作用的耐阿霉素的急性髓样白血病细胞系显示活力降低。随后的机理实验表明，circPAN3可以作为miR-153-3p/miR-183-5p的海绵，通过靶向X连锁的凋亡蛋白抑制剂来促进THP-1/ADM细胞的ADM抗性。
    　　 此外，在耐monastrol的乳腺癌细胞中发现了circRNA-MTO1的上调，并且circRNA-MTO1通过调节肿瘤坏死因子受体相关因子4/kinesin-5轴抑制了细胞活力并减弱了monastrol耐药性。Rybak在2015年首次描述的circCEP128位于第14号染色体上，并源自CEP128。据报道，circCEP128在膀胱癌中被上调。敲除circCEP128可以通过调节包含基因11轴的miR-145-5p/SRY-box抑制人膀胱癌细胞系和BIU-87的增殖并促进其凋亡。然而，没有关于circCEP128对神经胶质瘤中TMZ抗性的贡献的研究。发现在胶质瘤组织和细胞系中，circCEP128被上调。此外，在耐TMZ的神经胶质瘤中观察到circCEP128表达增加细胞系。机理研究表明，敲除circCEP128可抑制U251和U87的增殖，并降低U251/TMZ和U87/TMZ对TMZ的抗性。这些发现提示circCEP128作为神经胶质瘤耐药的治疗靶点具有潜在的作用。
    　　 为了确定circCEP128敲低增强胶质瘤细胞中TMZ的细胞毒性功效的机制，探索circCEP128下游的miRNA。根据预测，circCEP128带有miR-145-5p的结合位点，这是circCEP128的直接靶标。也有证据表明，miR-145-5p是化学抗性发展中的关键抑制因子。例如，与敏感的对照相比，在耐溴隐亭的催乳素瘤临床样品中miR-145-5p的表达不足。此外，miR-145-5p的过表达通过靶向翻译控制的肿瘤蛋白1来增强大鼠催乳素瘤细胞对溴隐亭的敏感性。前研究还表明，miR-145-5p位于lncRNAMACC1-AS1的下游，以促进胃细胞对5-氟尿嘧啶和奥沙利铂的敏感性。此外，后来在对多西他赛耐药的前列腺癌细胞系中的研究表明，miR-145-5p的上调抑制了细胞增殖和转移，并通过下调A激酶锚蛋白12降低了对多西紫杉醇的耐药性。发现表明miR-145在化学抗性中起作用。很大程度上未知circRNACEP128是否通过使miR-145变海绵来调节神经胶质瘤的化学耐药性。在目前的工作中，神经胶质瘤中发现了miR-145-5p的下调细胞。在耐TMZ的神经胶质瘤细胞中miR-145-5p的表达低于其亲本细胞。此外，通过荧光素酶报告基因测定证实了circCEP128和miR-145-5p之间的相互作用，这暗示着circCEP128充当神经胶质瘤中miR-145-5p的海绵。更重要的是，miR-145-5p的过表达抑制了U251/TMZ细胞的增殖并降低了ABCG2的表达，但circCEP128的过表达阻止了miR-145-5p的过表达诱导的这些变化，表明circCEP128调节细胞的增殖和通过海绵化miR-145-5p对神经胶质瘤中TMZ的耐药性。
    　　 众所周知，经典的与多药耐药性相关的基因ABCG2充当异种生物转运蛋白，并成为治疗药物耐药性的关键因素。ABCG2能够促进有毒异种物质的外排，从而削弱治疗药物的抗癌效果。因此，抑制ABCG2能够减弱神经胶质瘤细胞对TMZ的抗性。已发现许多miRNA可通过调节ABCG2的表达来充当癌症进展和化学耐药性的重要调节剂。例如，miR-495通过下调抗顺铂的非小细胞肺癌细胞中ABCG2的表达和切除修复交叉互补1来抑制细胞增殖，迁移和侵袭，并促进顺铂耐药性。证据表明，miR-145可以通过靶向ABCG2来抑制神经胶质瘤干细胞的迁移和侵袭。circCEP128/miR-145-5p轴是否通过ABCG2调节神经胶质瘤细胞对TMZ的抗性仍然定义不清。在这项研究中，在U251/TMZ和U87/TMZ细胞中发现了ABCG2的上调。敲除circCEP128抑制了ABCG2的表达，而过表达miR-145-5p的U251/TMZ细胞也产生了相似的结果。但是，circCEP128的过量表达可阻断miR-145-5p对ABCG2表达的抑制作用。发现表明，circCEP128/miR-145-5p轴部分地通过调节ABCG2来调节神经胶质瘤对TMZ的抗性。总之，发现敲低circCEP128可以通过上调miR-145-5p抑制胶质瘤细胞增殖并提高TMZ的细胞毒性。出国看病网研究人员的数据突显了胶质瘤中对TMZ耐药的新机制，并暗示靶向circCEP128可以用于开发克服TMZ耐药性并最终改善神经胶质瘤患者预后的策略。
 
出国看病概况

海外医疗在国外发展较为成熟，比如在欧美等医疗技术发达国家，很多医院都设有国际病人办公室并配备多语种医学专业翻译人员，就医流程和模式都已相对成熟。在国内，海外医疗虽然还属于新兴行业，但发展势头迅猛，发展潜力巨大，市场前景广阔。
　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
出国看病适应症
靶向药物
 

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