出国看病
 
靶向探针用于胶质瘤的分级诊断
  • 　　胶质瘤是常见的中枢神经系统恶性肿瘤，占原发性脑部恶性肿瘤的75％。根据组织学特征，WHO将神经胶质瘤分为I-IV级。其中，低度恶性肿瘤生长缓慢且浸润性较弱，而高度恶性肿瘤具有较强的浸润性和预后不良。目前，胶质瘤主要以手术治疗为主，辅以放疗和化疗，因此胶质瘤的早期分类对于治疗方案和预后至关重要。磁共振分子成像技术的发展可能为神经胶质瘤的早期分级诊断提供新的机会。脑肿瘤研究的一个研究热点是利用体内特定生物分子的磁共振成像来实现疾病的早期诊断和治疗监测。在本实验中，构建了以NRP-1为靶标的新型基于USPIONs的分子探针。研究旨在通过尾静脉将探针注射到荷瘤小鼠中，证实可用于MRI对NRP-1表达水平不同的胶质瘤的高低分级诊断。
    　　 人神经胶质瘤U87细胞系获自医学院细胞资源中心。人脑胶质瘤CHG-5细胞系购自生物公司。人星形胶质细胞系购自SciencellUSA。从公司购得16头裸鼠，雌性，体重4至6周，体重g，授权号SCXK2014-0004。USPIO-PEG由中国北京万德公司提供。将USPIO-PEG溶液放入2毫升EP管中。然后将1mg1-乙基-3-碳二亚胺，2.8mg磺基-N-羟基琥珀酰亚胺和100uLPBS合并。将溶液充分混合，然后在室温下迅速加入USPIO-PEG溶液。在振荡器上反应30分钟。然后将溶液进行超滤以从溶液中除去过量的EDC和NHS。多肽tLyP-1由上海吉尔生化公司合成，并通过高效液相色谱法纯化，得到纯度为98％的多肽。所获得的纯肽通过质谱鉴定一种。然后，向上述溶液中加入100uL的98％tLyP-1，并在37℃下进行2小时的偶联反应，并用PBS透析过夜。通过超滤将所得溶液浓缩至4mg每毫升，并置于4℃的冰箱中使用。通过DLS检测分子探针的水合粒径和稳定性，并通过TEM观察。
    　　 合成LV-NRP1-RNAi慢病毒和LV-NRP2-RNAi慢病毒，分别转染U87细胞，得到低NRP-1或NRP-2表达的U87细胞。实验分为3组，其中A组：对照组，B组：LV-NRP2-RNAi组，C组：LV-NRP1-RNAi组低表达）。在四孔板中培养了这三种类型的细胞，每个细胞密度为2.5×105每毫升。每个孔中包含1毫升培养基。将这些细胞置于培养箱中24小时。
    　　 用DMEM高葡萄糖培养基稀释溶液，溶液的终浓度为50ugFe每毫升。从培养箱中移出四孔板，弃去培养基。将浓度为50ugFe毫升添加到每个孔中，首先用PBS洗涤。然后，将四孔板置于培养箱中2h。将低熔点琼脂糖粉末添加到10毫升PBS中，以生成1％的低熔点琼脂糖凝胶。琼脂糖粉末溶液在微波炉中加热以获得均匀溶液。将1％低熔点琼脂糖溶液置于80°C水浴中。丢弃旧培养基后，将四孔板的每个孔用PBS洗涤2次，然后添加100uL胰蛋白酶消化液，并将板置于培养箱中5分钟。将细胞分解成单个细胞悬液，并转移至0.6毫升离心管。弃去上清液，加入200毫升低熔点琼脂糖溶液并均匀混合以悬浮细胞。移动24孔板，并为每个细胞建立6个孔。通过从24孔板的3.0TMRI扫描获得的弛豫时间T2的倒数计算R2值。将U87，CHG-5和HA细胞在含有10％胎牛血清，100U/毫升青霉素和0.1mg每毫升链霉素的DMEM中在细胞培养箱中于37°C和5％CO的条件下培养。每隔一天更换一次介质。当细胞覆盖培养瓶的80％到90％时，将其消化并用胰蛋白酶传代。用RIPA细胞裂解缓冲液提取总蛋白。通过BCA蛋白质测定试剂盒检测蛋白质浓度。通过SDS-PAGE电泳分离蛋白质样品，并转移到PVDF膜上，将其在5％脱脂牛奶中封闭2小时。最后，将NRP-1兔抗人单克隆抗体溶液添加到装有膜的密封袋中，在4°C下过夜。接下来，将膜用TBST洗涤5次，与HRP偶联的山羊抗兔二抗一起在室温下孵育1h，再用TBST洗涤5次，并与ECL开发人员一起开发。使用B-肌动蛋白作为内部参考记录图像，并使用ImageLab软件进行灰度分析。
    　　 所有实验动物程序均按照美国国家卫生研究院动物保护指南进行。16只裸鼠随机分为两组：U87荷瘤小鼠组和CHG-5荷瘤小鼠组。将U87和CHG-5细胞以3.0×1010/L的浓度接种到右基底神经节的裸鼠中。将裸鼠用0.8％戊巴比妥钠麻醉后，将头固定在体视仪上的俯卧位置。接种部位如前所述，然后使用带有5uL肿瘤细胞悬液的微型注射器垂直穿刺白质区域。完成后，将小鼠分组饲养。建模18天后，所有荷瘤小鼠均接受MRI。除CHG-5组中的一只小鼠外，所有小鼠均成功建模。从两组中选出五只肿瘤大小相似的荷瘤小鼠。处死另一只荷瘤小鼠，取肿瘤组织进行病理检查，使用标准程序进行。另外，对从每组中选择的5只荷瘤小鼠进行编号，并将3毫克每千克剂量的依次注射到每个尾静脉中。根据小鼠数目，用2％异氟烷麻醉荷瘤小鼠。将小鼠置于7.0T动物核磁共振仪上，并在注射探针后6小时，12小时和24小时对移植的肿瘤进行MRI横向扫描。扫描参数设置为T2WI序列。扫描后，通过分析软件分析获得的图像。测量肿瘤的松弛时间，并计算R2值。
    　　 通过颈脱位法处死荷瘤小鼠以分离肿瘤组织。从两组各取一部分肿瘤组织。将肿瘤固定在4％甲醛中，包埋在石蜡中，然后切片以产生3um厚的组织切片。样品用普鲁士蓝染色，并用中性胶密封。在显微镜下观察组织中蓝色铁颗粒的分布，并比较两组的颗粒数。将两组中其余的肿瘤组织固定在2.5％戊二醛溶液中，用酒精脱水并包埋在环氧树脂中切片。将超薄切片用乙酸铀酰和柠檬酸铅染色。使用SPSS22版软件进行统计分析。实验数据表示为平均值±SD。比较两组荷瘤小鼠在治疗前后不同时间点移植肿瘤的R2值，并采用重复测量的方差分析方法。通过t检验比较两组之间的R2值。使用F检验分析三组之间的差异。P小于0.05时，差异具有统计学意义。TEM显示，USPIO是圆形颗粒，具有均匀的分布和大小。探针的分子结构DLS结果表明，在25℃下USPIO-PEG的水合直径的峰值为34.72纳米，并且所述分子探针的水合直径的峰值在25°C下为44.77nm。探针与U87细胞合并后进行MRI。A组和B组细胞在T2加权图像中显示出较低的信号阴影，而C组细胞显示出较高的信号阴影。A组和B组之间的R2值没有显着差异，但A组和C组之间的R2值具有显着差异。7.64±3.02），B组和C。
    　　 Westernblot分析显示，U87和CHG-5细胞中NRP-1蛋白的表达高于HA细胞，而U87细胞中NRP-1蛋白的表达水平明显高于HA细胞。在CHG-5细胞中。注射后，在荷瘤小鼠中未观察到任何副作用或异常行为。MRI显示，两组的肿瘤组织在注射前具有高信号。注射探针后，两组肿瘤组织中均出现低信号阴影，低信号阴影随时间逐渐增加，在12h达到最大值。之后，低信号阴影开始减弱。此外，U87组的低信号强度显着高于CHG-5组。在注射分子探针前后肿瘤组织的R2值有明显差异，分子探针与注射时间之间存在相互作用，U87组的R2值高于CHG-5组。注射前两组之间的R2值无明显差异。但在注射后6h，12h和24h，两组肿瘤组织的R2值有显着差异。在U87组中，星形或梭形肿瘤细胞被密集排列并均匀分布。细胞核被深深地染色。病理性有丝分裂更为常见。CHG-5组的肿瘤细胞是多形的，具有不同大小的核，深核染色和罕见的有丝分裂图。肿瘤组织切片的普鲁士蓝染色在U87组中显示出扩散的铁颗粒沉积，而在CHG-5组中观察到了较少的沉积。在显微镜下观察两组中蓝色铁颗粒的数量。结果显示，U87组的蓝色铁颗粒明显多于CHG-5组的铁颗粒，两组之间的差异具有统计学意义。通过TEM，与CHG-5细胞相比，更多的USPIO颗粒被掺入U87细胞中。
    　　 由于神经胶质瘤具有较强的侵袭性和较高的复发率，因此在诊断和治疗方面面临很大的困难。尽管治疗在不断改善，但是患者的预后仍然不能令人满意。特别是多形性胶质母细胞瘤患者的中位生存期约为14.6个月。因此，胶质瘤的早期定性和分级诊断直接影响疾病的预后和患者的生活。磁共振分子成像可以在早期反映出体内特定生物分子的特征，并评估组织的微观结构变化。因此，这可能有助于实现对该疾病的早期定性和分级诊断。NRP-1是一种跨膜糖蛋白，在轴突的生长和引导中起关键作用。相关研究发现，NRP-1，血管通透性因子的共受体，可以参与肿瘤血管生成。阻断NRP-1信号传导途径是抗肿瘤治疗的有效方法。NRP-1在正常组织细胞中低表达，但在许多肿瘤细胞中高表达，例如乳腺癌，肝癌和非小细胞肺癌。更重要的是，NRP-1在神经胶质瘤中的表达特别高，其表达水平与神经胶质瘤的恶性程度呈正相关，这可能与恶性神经胶质瘤的丰富血管和强大的浸润能力有关。为该实验选择了三种细胞系：U87，CHG-5和HA。通过蛋白质印迹分析验证了这三种细胞系中NRP-1的表达。结果表明，NRP-1在HA细胞中低水平表达，在U87和CHG-5细胞中高表达。NRP-1在U87细胞中的表达水平明显高于CHG-5细胞，为下一步实验提供了理论依据。
    　　 超顺磁性氧化铁纳米粒子是新型MRI造影剂，可产生更强的MR信号对比度。合成分子探针常用的磁性纳米粒子是SPIONs和USPIONs，USPION具有较小的粒径和与肿瘤细胞良好的相容性的优势。检查了不同浓度的USPION标记的C6胶质瘤细胞，证实了通过MRI将USPION应用于胶质瘤的可行性。但是，单个USPION的稳定性较差，血浆半衰期较短，但是在用某些特异性抗体和配体修饰后，不仅增强了稳定性，而且还提高了靶向积累能力。重组人表皮生长因子和SPION-EGF的组合可通过MRI在C6胶质瘤原位模型中通过血脑屏障的肿瘤中蓄积，其成像效果比C6胶质瘤更显着。未绑定的SPION。聚乙二醇是具有高脂质溶解度的常用表面改性剂。用PEG修饰USPIONs不仅增强了USPIONs的稳定性，而且还提高了生物相容性并增强了氧化铁纳米探针的血脑屏障渗透性。tLyP-1肽是一种易于合成的线性多肽，可以特异性结合细胞表面的NRP-1。tLyP-1包含CendR元件，可以通过依赖NRP-1的CendR内化途径穿透组织。建立了双重靶向分子Lf-NP-tLyP-1，并证实了其良好的肿瘤靶向性和细胞内在化能力，使其成为靶向肿瘤NRP-1受体的理想配体。因此，在本实验中，使用碳二亚胺方法将特定的NRP-1配体tLyP-1与PEG修饰的USPION偶联，以生成。通过U87细胞实验，表明该探针可以特异性结合NRP-1。
    　　 为了评估这种新型探针在胶质瘤分类诊断中的成像效果，U87和CHG-5细胞系用于建立高，低度原位胶质瘤裸鼠模型。组织学图像证实，U87或CHG-5荷瘤小鼠的肿瘤组织分别符合高级别或低级别神经胶质瘤的病理特征。MRI显示，注入探针后，两组肿瘤组织的低信号阴影逐渐增加，在12h达到最大。然后，低信号阴影开始减少，这可能与体内分子探针的代谢有关。而且，U87组肿瘤组织的低信号强度明显高于CHG-5组。这表明与U87肿瘤组织的结合能力强于CHG-5肿瘤组织。由于R2值是T2弛豫时间的倒数，它与氧化铁颗粒具有良好的相关性，并且可以随着颗粒浓度的增加而增加。因此，在该实验中将R2值用作分析指标。U87组肿瘤组织的R2值明显高于CHG-5组。类似地，通过普鲁士蓝染色在肿瘤组织中发现了铁颗粒，但U87组的蓝色染色颗粒数目明显大于CHG-5组。总之，该实验结果表明，可以通过血脑屏障被肿瘤组织吸收，其与高表达NRP-1的U87胶质瘤细胞的结合能力为：明显高于NRP-1低表达的CHG-5细胞。该探针可以通过MRI对裸鼠中具有不同NRP-1表达水平的高，低度神经胶质瘤进行分级诊断。出国看病服务机构希望出国看病服务机构的发现可能为神经胶质瘤的早期定性和靶向治疗的诊断提供新的潜在方法，以供将来的研究之用。
 
出国看病概况

海外医疗在国外发展较为成熟，比如在欧美等医疗技术发达国家，很多医院都设有国际病人办公室并配备多语种医学专业翻译人员，就医流程和模式都已相对成熟。在国内，海外医疗虽然还属于新兴行业，但发展势头迅猛，发展潜力巨大，市场前景广阔。
　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
出国看病适应症
靶向药物
 

  • 联系出国看病服务机构网

  • 电话：13263277712
    北京办公室地址：北京市丰台区万丰路

出国看病服务机构网 版权所有 2012-2022 日本房产 海外医疗 BNCT 网站优化 卡马替尼 索托拉西布