出国看病
 
神经胶质瘤细胞坏死
  • 　　混合谱系激酶结构域样蛋白已被确定为坏死病的主要执行者，这是一种新型的程序性细胞死亡，其形态与坏死相似。募集到主要由受体相互作用的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶1和3组成的坏死复合物后，毫升KL在T357和S358被RIP3磷酸化，然后被激活。当活化的毫升KL形成均三聚体时，它会产生多种生物学效应，例如破坏细胞膜，诱导质膜中的阳离子通道以及触发NLRP3炎性体的形成。然而，尚不清楚激活的毫升KL是否会在尸检过程中导致其他生物学效应。DNA是真核细胞中最重要的分子之一，并且包含维持细胞生理功能所需的所有信息。色谱分解是指核DNA的酶促降解。适当降解DNA可以预防疾病的发生。但是过度降解会使细胞死亡程序不可逆，并促进细胞核的分解，因此被认为是导致细胞死亡的关键事件之一。在细胞凋亡的情况下，已经广泛地研究了色素分解。发现DNA被切割成大片段，然后被切割成核小体单位，最后被脱氧核糖核酸酶降解成寡核苷酸或较小的分子。虽然较少有人知道的因素或负责chromatinolysis在坏死的机制，积累的证据表明，细胞凋亡的核易位诱导线粒体和Y-H2AX的形成因子在有助于细胞necroptotic到chromatinolysis。
    　　 紫草素是从紫草紫薇中分离出来的萘醌。它通过激活坏死病途径对各种类型的癌症产生治疗作用。RIP1和RIP3均可导致紫草素诱导的神经胶质瘤细胞坏死，但其中毫升KL的作用仍然难以捉摸。在先前的研究中发现在透射电子显微镜下，经紫草素处理的神经胶质瘤细胞的核是电子可穿透的，表明染色质分解的诱导可能是shikonin触发神经胶质瘤细胞坏死的途径。因此在这项研究中调查毫升KL是否参与了紫草素诱导的神经胶质瘤细胞坏死及其在色素沉着调节中的作用。将紫草宁溶解于PBS中至50毫米ol每升的储存浓度。Ser227的抗RIP1，抗RIP3，抗磷酸RIP3，抗H2A抗体购自Abcam公司。抗磷酸化RIP1atSer166抗体来自细胞信号公司。SHG-44，U87和U251以及大鼠C6胶质瘤细胞均获自细胞生物学研究所。将它们在补充有10％胎牛血清，2毫米ol每升谷氨酰胺，青霉素和链霉素的DMEM中培养，并在潮湿环境中保持在37摄氏度和5％二氧化碳的条件下。
    　　 将细胞接种到96孔微孔板上并培养24小时。乳酸脱氢酶细胞毒性测定试剂盒用于测定细胞死亡率。样品：样品的吸光度值；对照：对照组的吸光度值；最大值：阳性组的吸光度值。收集SHG-44和U251胶质瘤细胞，使用AnnexinV-FITC检测试剂盒评估细胞死亡方式。收集的细胞用PBS洗涤两次，并重悬于400uL1×结合缓冲液中，然后转移至含有5uLAnnexinV-FITC和10uL碘化丙啶的5毫升培养管中。在室温下于黑暗中孵育15分钟后，向每个试管中加入1×结合缓冲液，并通过流式细胞仪分析染色的细胞。使用CELLquest软件分析细胞死亡速率。通过每管收集20,000个细胞进行数据采集，并针对每种实验条件确定活细胞和死细胞的数目。
    　　 收集SHG-44和U251神经胶质瘤细胞，并根据制造商的说明用JC-1染色。然后，通过流式细胞术分析细胞。通过使用MitoSOX红测定线粒体的过氧化物。将接种到96孔微孔板上的SHG-44细胞与2.0毫升MitoSOX试剂工作溶液在5umol每升下于37摄氏度在黑暗中孵育10分钟，然后用PBS洗涤。在510nm的激发波长和580nm的发射波长下测量红色荧光密度，并表示为与对照细胞中荧光的比率。如上所述处理另一组接种到直径为3cm的培养皿上的SHG-44神经胶质瘤细胞，并在荧光显微镜下观察。将SHG-44和U251细胞接种到直径为10cm的培养皿上。siRNA的转染通过使用Lipofectamine2000根据制造商的说明书进行。siRNA转染过夜后，将细胞与紫草素按指定剂量孵育，以用于后续实验。
    　　 将20只无胸腺裸鼠饲养在无特定病原体的环境中，光照12小时,免费获得食物和水，并在三天内适应周围环境。在每只小鼠的右腹皮下注射100uLPBS中总共1×10对数生长的C6细胞。当肿瘤达到约150毫米3时开始治疗实验7天后。小鼠被分配接受腹膜内注射媒介物，以相同的体积50uL体重2mg每公斤紫草素注射，四天两次。使用游标卡尺测量肿瘤大小，并使用下式计算肿瘤体积：0.5×A×B2，其中A为肿瘤的长度，B为宽度。在最后一次治疗的第二天，通过颈脱位使小鼠安乐死。切除并称重后，将肿瘤立即在液氮中冷冻以进行蛋白质印迹分析。
    　　 收集后通过刮刀离心收集的神经胶质瘤细胞，并将冷冻的异种神经胶质瘤组织在玻璃冰的Tris缓冲盐水中用玻璃Pyrex微均质器匀浆，在4摄氏度下以1000g离心10分钟，以获得上清液。使用Bio-Rad蛋白质测定试剂盒确定蛋白质含量。SDS电泳并转移至PVDF膜后，在室温下用TBS中的3％牛血清白蛋白封闭膜30分钟，然后与一抗在4摄氏度下孵育过夜。与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育后，洗涤印迹，在化学发光显影剂上观察免疫反应蛋白，然后使用ImageJ软件定量密度。并对蛋白质浓度进行标准化。用同型IgG对照抗体和琼脂糖预清除400ug蛋白质样品。将通过与50uL裂解缓冲液中的10uL一级抗体在4摄氏度下孵育过夜而制备的40uL蛋白琼脂糖添加到蛋白质样品中，然后在4摄氏度下孵育过夜。然后将混合物通过12000rpm的高速冷冻离心10s沉淀。为了除去非特异性结合的蛋白质，用裂解缓冲液将沉淀物洗涤3次。然后通过在上样缓冲液中使溶液变性来释放琼脂糖结合的免疫复合物，然后再进行蛋白质印迹分析。
    　　 将接种到直径为3cm的培养皿上的细胞固定在乙醇中，用PBS洗涤，并与百分之一TritonX-100孵育10分钟。在非特异性抗体结合位点被5％BSA阻断后，将细胞分别与抗AIF抗体的一抗或磷酸H2AX的丝氨酸139一起孵育。然后，将细胞与在Cy3偶联的山羊抗兔IgG中在室温下孵育1小时，然后与Heochst33258孵育30分钟。将另一组SHG-44细胞在37摄氏度下孵育30分钟，然后固定在乙醇中。阻断非特异性抗体结合位点后，将细胞与抗-磷酸化毫升KL的S358抗体，然后在Cy3偶联的山羊抗兔IgG中孵育1h，然后在室温下与Heochst33258孵育30分钟。最后，所有细胞在激光扫描共聚焦显微镜下可视化。用0.25％胰蛋白酶收集细胞，并以2000转每分钟的速度离心10分钟收集细胞。然后，将收集的细胞在55摄氏度下在200uLSDS裂解缓冲液中不断振摇孵育过夜，以提取基因组DNA。将相当于10ugDNA的每个样品体积与6×DNA上样染料混合，并在百分之一　琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳。凝胶上的DNA条带通过紫外线透射可见，并在GelDoc仪器上捕获凝胶图像。将细胞固定在PBS的冰冷2.5％戊二醛中，用PBS冲洗，后固定在含0.百分之一　铁氰化钾的百分之一　四氧化os中，通过一系列梯度的乙醇脱水并包埋在Epon树脂中。使用ReichartUltracut超薄切片机切割Semithin切片，用0.5％甲苯胺蓝染色并在光学显微镜下检查。将超薄切片用百分之一　乙酸铀酰酯和0.百分之一　柠檬酸铅染色，并使用JEM2000EX透射电子显微镜进行检查。
    　　 将细胞接种在6孔培养板的盖玻片上24小时，然后在37摄氏度下用紫草素处理2小时。用PBS洗涤两次后，将细胞与Hoechst33258染料在室温下孵育5分钟。用PBS最终洗涤后，在激光扫描共聚焦显微镜上以60倍的放大倍率观察样品。在不涉及此项研究的病理学家从每个样本中随机选择的五个视野中，对具有染色体分解功能的细胞进行了计数，并表示为总细胞的百分比。所有数据代表至少4个独立实验，并表示为平均值±SD。使用单向方差分析进行统计比较。小于0.05的P值被认为具有统计学意义。
    　　 在以前的研究中发现紫草素以浓度依赖的方式显着抑制SHG-44，U251，U87和C6胶质瘤细胞的活力，紫草素在3h时的IC50值分别为4umol每升。44个细胞，在C6细胞中为6umol每升，在U251细胞和U87细胞中为10umol每升。因此，这些剂量的紫草素也用于本研究中。出国看病网研究人员研究了紫草素是否可以诱导神经胶质瘤细胞中的染色体溶解。为了解决这个问题，使用透射电子显微镜检查了紫草素诱导的染色质变化。与在对照组细胞中平滑轮廓的，包含异染色质团块的核相比，用紫草素处理3h的细胞中的核尽管具有完整的核膜，但仍具有电子透明性。这表明紫草素可能在神经胶质瘤细胞中诱导染色质降解。激光扫描共聚焦显微镜显示，与对照细胞相比，在紫草素处理的细胞中，Hoechst33258检测到的核是空心的，常被用于染色核DNA，这种核是一种蓝色荧光染料，被空心化了。通过计数空心核，分析了紫草素诱导SHG-44和U251细胞核形态变化的动力学。发现将紫草素处理从1小时延长到3小时后，空心核在所有计数核中所占的百分比都得到了显着提高。考虑到shikonin不会诱导核膜破坏，并且核的体积很大，因此认为shikonin可能会诱导神经胶质瘤细胞的DNA降解。
    　　 为了证明shikonin可以诱导神经胶质瘤细胞中的染色体溶解，从U251，U87，SHG-44和C6神经胶质瘤细胞中提取核DNA，这些细胞用shikonin以指定的IC50剂量处理了指定的时间，并在琼脂糖凝胶上电泳。琼脂糖凝胶电泳经常被用来通过各种应力诱导单独的DNA片段化。在坏死的情况下，DNA在琼脂糖凝胶上显示出条带。当与对照组。此外，随着紫草素处理时间从15分钟延长到120分钟，涂片带变得更加明显。因此，这些数据进一步证实了紫草素诱导了核DNA的降解。累积的证据表明通过RIP1和RIP3活化该紫草素诱导的神经胶质瘤细胞坏死的，其中毫升KL的作用仍然是难以捉摸的。因此，蛋白质印迹被用于分析紫草素诱导的U251，U87，SHG-44和C6胶质瘤细胞中毫升KL的变化。当与对照组相比，毫升KL和磷酸毫升KL的蛋白水平都明显上调紫草素处理的细胞，以及它们的水平显着地时增加孵育时间从30分钟延长至120分钟。这表明紫草素以时间依赖性方式诱导毫升KL活化。
    　　 为了检查毫升KL激活在紫草素诱导的胶质瘤细胞死亡中的作用，将细胞用毫升KL抑制剂NSA以10umol每升的浓度处理1h，然后与指定浓度的紫草素一起孵育3h。用NSA进行预处理可显着防止以较低或较高剂量的紫草素诱导的神经胶质瘤细胞死亡。流式细胞术分析用膜联蛋白V-PI双染组合是从凋亡那些分化坏死细胞通常的方法。凋亡早期的细胞仅对膜联蛋白V呈阳性，相比之下，坏死细胞可用单独的PI或膜联蛋白V和PI染色。紫草素诱导PI或膜联蛋白V和PI阳性染色的细胞的时间依赖性改善。这表明紫草素诱导神经胶质瘤细胞坏死。然而，NSA预处理明显减少了紫草素诱导的神经胶质瘤细胞坏死。此外，蛋白质印迹分析表明，在NSA预处理的细胞中，紫草素诱导的毫升KL和磷酸化-毫升KL的改善均被阻止。因此，毫升KL调节了紫草素诱导的神经胶质瘤细胞坏死。为了进一步阐明毫升KL在紫草素诱导的胶质瘤细胞死亡中的作用，引入了小RNA干扰来敲低毫升KL。与用杂乱的siRNA转染的细胞相比，当用siRNA敲除毫升KL时，紫草素诱导的毫升KL磷酸化得到缓解。然后，流式细胞仪分析结合膜联蛋白V-PI双重染色表明，用siRNA敲低毫升KL可以显着防止紫草素诱导的神经胶质瘤细胞坏死。这证实了毫升KL促成紫草素诱导的神经胶质瘤细胞坏死。值得注意的是，在使用或不使用紫草素处理的细胞中提取的核DNA的琼脂糖凝胶电泳显示，在存在毫升KL抑制剂NSA或通过siRNA基因敲低毫升KL的情况下，由紫草素诱导的DNA的条带明显减轻。因此，这些数据表明毫升KL通过促进色解作用促进了紫草素诱导的神经胶质瘤细胞坏死。
    　　 为了阐明为什么毫升KL可以调节色分解，出国看病网研究人员研究了它在调节Y-H2AX形成中的作用，后者是DNA双链断裂的标志，被认为是导致色分解的关键步骤。如蛋白质印迹分析所示，在用紫草素处理3小时后，细胞中Y-H2AX的水平显着提高，并随着紫草素剂量的增加而增强。此外，通过激光扫描共聚焦显微镜，在紫草素处理过的细胞核中还观察到了许多Y-H2AX病灶。同时，在紫草素处理的细胞中，共济失调的毛细血管扩张突变和依赖DNA的蛋白激酶催化亚基的磷酸化水平均得到了改善。相比之下，用10umol每升的毫升KL抑制剂NSA预处理1h或用siRNA敲低毫升KL可以显着减轻紫草素诱导的磷酸ATM，磷酸DNAPKcs和Y-H2AX的上调。因此，这些数据表明毫升KL通过引起ATM或DNAPKcs的磷酸化促进了紫草素诱导的Y-H2AX形成。
    　　 鉴于ATM和DNAPKcs的激活均是DNADSB的继发，出国看病网研究人员通过使用专门设计用于检测DNADSB的中性彗星测定法研究了毫升KL在DNADSB调控中的作用。与对照组相比，用IC50值进行紫草素处理2h的细胞具有长彗星尾巴，这也得到了显示紫草素的统计分析数据的支持。处理不仅明显增加了彗尾的细胞，而且还提高了彗尾的DNA含量。但是，在NSA的存在下，紫草素诱导的彗尾细胞的增加和彗尾DNA含量的提高均受到抑制。这表明毫升KL参与了胶质瘤细胞中紫草素诱导的DNADSB的调控。考虑到ROS可能导致DNA双链断裂的DNA，出国看病网研究人员研究了激活毫升KL对ROS的紫草素诱导的生产过剩的效果。如荧光显微镜所揭示的，当与对照细胞比较时，由ROS探针DCFH-DA检测到的绿色荧光在用Shikonin孵育的IC50浓度为2h的细胞中变得更亮。绿色荧光强度的统计分析数据也证实了这一点。这表明紫草素诱导了神经胶质瘤细胞内ROS的改善。与此相反，预处理NSA10umol每升的1个小时显著防止绿色荧光紫草素诱导的增加，表明毫升KL促进了ROS。为了验证ROS在紫草素诱导的DNADSB中的作用，将细胞用抗氧化剂NAC在5毫米下预处理1h，然后与紫草素在IC50值下孵育2h。发现NAC不仅阻止了紫草素诱导的ROS过量产生，而且还抑制了紫草素诱导的彗尾细胞中的增加，彗尾DNA含量的改善，Y-H2AX的形成和抑制。胶质瘤细胞死亡。这表明ROS促成紫草素诱导的DNADSB。提取的核DNA的琼脂糖凝胶电泳显示，在NAC的存在下，由紫草素处理引起的DNA涂片带得到缓解。这些结果表明毫升KL通过促进ROS产生而加剧了紫草素诱导的色分解。
    　　 由于AIF从线粒体到核的易位促进了凋亡和坏死性的染色体溶解，因此研究了紫草素是否可以诱导AIF的核易位。如蛋白质印迹分析所示，线粒体AIF在用紫草素处理2小时的SHG-44和U251细胞中均明显降低，但其胞质和细胞核水平均得到改善。这表明紫草素诱导线粒体释放AIF，并促进AIF易位进入细胞核。然后，将紫草素处理从15分钟延长至120分钟后，SHG-44，U251，U87和C6细胞中线粒体AIF的减少和核AIF的增加都变得更加明显。与对照细胞相比，激光扫描共聚焦显微镜还显示了在用紫草素处理过的细胞的细胞核中积累了AIF。这表明紫草素诱导线粒体释放AIF并在细胞核中积累。为了解决核素AIF在经紫草素处理的神经胶质瘤细胞中的作用，出国看病网研究人员引入了siRNA来敲低AIF。与用加扰的siRNA转染的细胞相比，当用siRNA敲除AIF时，紫草素诱导的核AIF的改善明显受到抑制。此外，LDH释放测定表明，AIF的敲低阻止了紫草素诱导的神经胶质瘤细胞死亡。核DNA的琼脂糖凝胶电泳表明，在AIF基因敲低的情况下，紫草素处理后的DNA涂片条带明显减轻了。这表明AIF促成紫草素诱导的色氨酸溶解和神经胶质瘤细胞死亡。然后，出国看病网研究人员通过蛋白质印迹分析检查了活化的毫升KL是否可以调节AIF的核易位，发现用NSA抑制毫升KL或用siRNA抑制毫升KL可以有效地抑制紫草素诱导的核AIF的改善。这表明活化的毫升KL加重了紫草素诱导的AIF的核易位。
    　　 考虑到线粒体是AIF的正常位置，线粒体的AIF释放是由线粒体膜电位控制的，通过JC-1染色检查了紫草素处理是否可能导致线粒体去极化。JC-1在线粒体中积累后呈现高红色荧光，但是当线粒体膜电位耗尽并发出绿色荧光时，JC-1存在于细胞质中。荧光显微镜和流式细胞仪分析均表明，以IC50值剂量的紫草素处理2h导致线粒体膜电位显着降低。考虑到过量产生的线粒体超氧化物是导致线粒体膜电位耗尽的因素，通过使用线粒体红检测了紫草素诱导的线粒体超氧化物水平的变化。荧光显微镜检查显示，用紫草素处理的细胞中，Mitosox红检测到的红色荧光比对照细胞中的要亮得多。红色荧光密度的统计分析表明，紫草素可诱导线粒体超氧化物的过量生成。相比之下，以40umol每升的线粒体超氧化物抑制剂MnTBAP预处理1h可以显着阻止紫草素诱导的线粒体超氧化物的产生和线粒体去极化。此外，在MnTBAP的存在下，紫草素诱导的细胞内ROS异常增加，AIF的核易位和Y-H2AX的上调均被抑制。这表明线粒体超氧化物参与了紫草素诱导的AIF核易位和Y-H2AX形成的调节。
    　　 用NSA进行的预处理还阻止了紫草素诱导的线粒体超氧化物的产生和线粒体去极化。此外，用siRNA敲低毫升KL不仅阻止了紫草素诱导的细胞内ROS的改善，而且减轻了紫草素引起的线粒体超氧化物的异常增加。因此，使用差速离心分离线粒体，并通过蛋白质印迹分析检查了线粒体中毫升KL的蛋白水平及其活性形式磷酸-毫升KL。当与对照细胞中的那些相比时，紫草素以时间依赖性方式改善了毫升KL和磷酸化毫升KL的线粒体水平。一致地，激光扫描共聚焦显微镜显示，紫草素诱导了线粒体上磷酸-毫升KL的积累。这表明激活的毫升KL干扰了线粒体功能，导致线粒体超氧化物的过量生成。为了测试紫草素是否可以在体内诱导毫升KL活化和色分解，将C6胶质瘤细胞皮下异种移植到裸鼠的侧面。在两天一次以2mg每公斤的剂量给予紫草素治疗后，第8天异种移植神经胶质瘤的体积明显小于对照组。肿瘤体积的统计分析也证明，紫草素治疗显着抑制异种移植的神经胶质瘤的生长。然后，出国看病网研究人员处死小鼠，并对从去除的神经胶质瘤中提取的核DNA进行琼脂糖凝胶电泳。发现从紫草素处理的神经胶质瘤中提取的基因组DNA在琼脂糖凝胶上也呈条带状，表明紫草素诱导的体内染色体溶解。此外，使用差速离心机分离了细胞质，细胞核和线粒体级分，并分析了不同级分中靶蛋白的水平。如蛋白质印迹分析所示，紫草素不仅在细胞质中而且在线粒体中也诱导磷酸-毫升KL上调。这表明紫草素诱导了毫升KL活化并激活了线粒体中积累的毫升KL。紫草素治疗导致线粒体AIF降低，但改善了AIF的细胞质和细胞核水平。此外，在紫草素治疗的神经胶质瘤中，Y-H2AX，磷酸-ATM和磷酸-DNAPKcs的核水平均被上调。因此，这些表明紫草素在体内诱导了神经胶质瘤细胞中AIF和Y-H2AX形成的核易位。
    　　 鉴于紫草素能性坏死过程中诱导RIP3的活化和活化的RIP3占毫升KL磷酸化，将细胞分别转染乱序的siRNA和RIP3的siRNA，然后在IC50值的3剂量与紫草素孵育H。如通过蛋白质印迹分析所揭示的，用siRNA敲低RIP3不仅阻止了紫草素诱导的RIP3的磷酸化，而且减轻了毫升KL的磷酸化水平。然后，使用免疫共沉淀法检测在紫草素存在下毫升KL是否募集到RIP3。当RIP3与其抗体免疫沉淀时，毫升KL也被共免疫沉淀。此外，当紫草素的剂量从2umol每升增加到4umol每升时，RIP3和共免疫沉淀毫升KL的水平均得到改善。因此，这些表明RIP3调节了紫草素诱导的毫升KL的活化。出国看病网研究人员测试了激活的毫升KL是否可以反向调节其上游信号RIP3。如蛋白质印迹分析所揭示的那样，用毫升KL抑制剂NSA预处理的SHG-44和U251细胞均以10umol每升的抑制作用1h进行了紫草素诱导的RIP3和磷酸化RIP3的表达上调。当用siRNA敲低毫升KL时，可以发现类似的结果。为了阐明为什么毫升KL可以反向调节RIP3的激活，研究了磷酸化RIP1和CYLD的蛋白水平，因为RIP3可以被RIP1激活，而CYLD可以通过去泛素化来促进RIP1的激活。在NSA存在下或当siRNA敲低毫升KL时，shikonin诱导的RIP1，磷酸RIP1和CYLD的上调水平均被阻止。这表明激活的毫升KL可以反向促进RIP1的激活。考虑到ROS可以促进RIP1和RIP3的激活，SHG-44和U251细胞用抗氧化剂NAC5毫米ol每升预处理1h，然后与Shikonin一起以IC50值孵育3h。正如Westernblot分析所揭示的，发现在NAC的存在下，紫草素诱导的CYLD，磷酸化RIP1和磷酸化RIP3蛋白质水平的改善都被阻止了。此外，共同免疫沉淀分析证明，在NAC预处理的细胞中，紫草素诱导的RIP3和毫升KL之间的相互作用受到抑制。这表明ROS增强了紫草素诱导的RIP1和RIP3的激活。考虑到毫升KL可以促进紫草素诱导的细胞内ROS积累，出国看病网研究人员认为毫升KL通过改善ROS生成来反向调节其上游信号RIP1和RIP3的激活。
    　　 总而言之，在这项研究中发现，紫草素在体外和体内均可诱导神经胶质瘤细胞中毫升KL的活化和色分解，并伴有AIF的核易位和Y-H2AX的形成。体外研究表明，用其特异性抑制剂NSA抑制毫升KL或用siRNA抑制毫升KL可以消除紫草素诱导的神经胶质瘤细胞死亡以及色分解。从机制上讲，激活的毫升KL靶向线粒体并触发线粒体超氧化物的过量生成，从而通过改善线粒体内的ROS积累引起线粒体去极化和Y-H2AX形成，从而促进AIF易位到核中。相比之下，通过用SiRNA敲低AIF来抑制AIF的核水平，或通过用抗氧化剂NAC抑制ROS来减轻Y-H2AX的形成，均有效地防止了紫草素诱导的色谱分解。然后，发现在紫草素诱导的神经胶质瘤细胞坏死过程中，RIP3与毫升KL相互作用并被激活。值得注意的是，发现活化的毫升KL通过改善细胞内ROS水平逆向上调CYLD的蛋白水平并促进RIP1和RIP3的激活。毫升KL通过调节色素分解作用促进了紫草素诱导的神经胶质瘤细胞坏死，而紫草素诱导了毫升KL及其上游信号RIP1和RIP3之间的正反馈，RIP3与毫升KL相互作用并被激活。值得注意的是，发现活化的毫升KL通过改善细胞内ROS水平逆向上调CYLD的蛋白水平并促进RIP1和RIP3的激活。
    　　 在凋亡诱导剂应激的细胞中，DNA被激活的内切核酸酶和内切核酸酶切割成大约180-200bp的片段。然而，坏死细胞中的层析作用很快，DNA随机裂解。这解释了为什么从凋亡细胞中提取的核DNA在琼脂糖凝胶上电泳后呈现梯形条带，而从坏死细胞中提取的DNA却显示出连续的涂片模式。在这项研究中，在透射电镜下用紫草素处理过的细胞中未观察到在对照细胞中出现的染色质团块。此外，紫草素诱导琼脂糖凝胶上涂片DNA条带的时间依赖性增强。相反，在存在毫升K抑制剂NSA或通过siRNA基因敲低毫升KL的情况下，既可防止Shikonin诱导的DNA的随机切割又可防止胶质瘤细胞死亡。这表明毫升KL通过促进色氨酸分解促进了紫草素诱导的神经胶质瘤细胞死亡。虽然负责坏死chromatinolysis的机制仍难以捉摸，几个核酸内切酶如DNA酶1和DNaseY调节坏死chromatinolysis。然而，在尸检过程中，AIF和YH2AX形成的核易位在促进染色体分解中起着重要作用。作为通常包含在线粒体膜间空间中的黄素蛋白，AIF在被截断并重新分布到细胞核中后起核酸内切酶的作用，降解DNA。内核，AIF是由YH2AX招募，然后用亲环素A合作以形成DNA降解复合物。巨噬细胞迁移抑制因子的核募集也需要AIF，MIF是一种新发现的核酸酶，可以将基因组DNA切割成大片段。因此，AIF在调节色素分解中起着重要作用。紫草素诱导了AIF和YH2AX形成的时间依赖性核易位。尽管在细胞凋亡的情况下，AIF可以大规模切割DNA，但是当ATP的生成受到抑制时，AIF也可以随机切割DNA。紫草素可能抑制PKM2和神经胶质瘤细胞中通过诱导糖酵解造成的功能障碍ATP显著下降。这也许可以解释为什么从紫草素处理过的细胞中提取的DNA电泳后在琼脂糖凝胶上显示出条带。特别是在这项研究中发现，当用siRNA敲除AIF时，可以防止紫草素诱导的DNA随机切割，这表明AIF有助于紫草素诱导的染色体溶解。
    　　 以ROS在细胞内积累为特征的氧化应激可以促进色分解，因为ROS可以导致YH2AX的形成和AIF的核易位。据发现，通过使用鱼藤酮的改善线粒体超代导致在PC12细胞中线粒体去极化。此外，在神经胶质瘤细胞中，ROS是ROS的一分子，过氧化氢使神经胶质瘤细胞从线粒体转运到细胞核。紫草素治疗可能导致神经胶质瘤细胞中时间依赖性的ROS过度产生。紫草素诱导线粒体超氧化物的异常产生，而用MnTBAP抑制线粒体超氧化物则抑制了线粒体的去极化和AIF的核积累。另外，ROS可以攻击DNA以产生DNADSB，从而导致ATM和DNAPKcs活化，然后形成YH2AX。当抗氧化剂NAC抑制细胞内ROS水平时，紫草素诱导DNADSB，YH2AX的形成以及ATM和DNAPKcs的活化都被废除。琼脂糖凝胶电泳证明在NAC的存在下紫草素诱导的色谱分解也受到抑制。简而言之，氧化应激促进了紫草素诱导的色谱分解。
    　　 紫草素可通过多种途径改善神经胶质瘤细胞的细胞内ROS。活化的毫升KL加重了紫草素诱导的氧化应激，因为NSA对活化的毫升KL的抑制作用明显减轻了紫草素诱导的细胞内ROS的积累。一致地，先前的研究也表明活化的毫升KL参与了细胞内ROS水平的提高。毫升TNF是大肠癌HT-29细胞中TNF诱导的坏死过程中ROS生成所必需的。敲低毫升KL可以减少人FADD缺陷Jurkat细胞中诱导的ROS生成。虽然毫升KL如何调节ROS产生仍然是难以捉摸的，激活毫升KL可以与线粒体心磷脂，其是线粒体内膜的一个重要组成部分，并支持组件和线粒体呼吸链复合物和supercomplexes相互作用结合。发现紫草素诱导的激活的毫升KL重新定位于线粒体上。NSA对毫升KL的抑制作用明显抑制了紫草素诱导的线粒体超氧化物的过量生成，而MnTBAP减轻线粒体超氧化物的生成阻止了细胞内ROS的增加。因此，活化的毫升KL可能通过干扰神经胶质瘤细胞中的线粒体呼吸链来促进紫草素诱导的ROS生成。
    　　 毫升KL被激活进入由RIP1和RIP3组成的坏死复合体后，其激活主要受上游信号RIP3调控。毫升KL通过共免疫沉淀与RIP3结合，而用siRNA敲低RIP3则显着抑制了紫草素诱导的毫升KL磷酸化。紫草素经由RIP1和RIP3活化诱导的神经胶质瘤，骨肉瘤和胰腺癌坏死的。毫升KL是紫草素诱导的神经胶质瘤细胞坏死病中RIP1和RIP3的下游信号。NSA抑制毫升KL激活或siRNA抑制毫升KL显着减弱了紫草素诱导的RIP1和RIP3的磷酸化以及CYLD的表达上调。用siRNA敲低毫升KL可以抑制因缺氧葡萄糖加半胱天冬酶抑制剂z-VAD处理而引起的皮质神经元的坏死组装。因此，这些提示毫升KL可以逆向调节紫胶素诱导的胶质瘤细胞中RIP1和RIP3的激活。
    　　 尽管尚不清楚影响毫升KL对RIP1和RIP3激活的调节作用的因素，但最近的研究表明ROS可以调节坏死病的进程。过氧化氢通过激活RIP1和RIP3途径诱导大鼠髓核细胞坏死。ROS增强了缺氧挑战的结直肠癌细胞中RIP1和RIP3之间的相互作用。因此，ROS在促进坏死复合物的形成以及RIP1和RIP3的激活中起着重要作用。用抗氧化剂NAC减轻ROS可以显着阻止紫草素诱导的RIP1和RIP3磷酸化以及CYLD的表达上调。考虑到激活的毫升KL可能会增加细胞内ROS的水平，认为激活的毫升KL通过改善细胞内ROS逆转了紫草素诱导的RIP1和RIP3的激活以及CYLD的表达上调。因此，出国看病网研究人员认为shikonin在胶质瘤细胞中诱导了毫升KL及其上游信号RIP1和RIP3之间的正反馈。总之，出国看病网研究人员证明了在这项研究中，紫草素以时间依赖性的方式诱导毫升KL的激活，而活化的毫升KL通过促进AIF核易位和Y-H2AX形成的触发色解作用而促进神经胶质瘤细胞坏死。此外，毫升KL通过干扰线粒体功能改善细胞内ROS，增强了紫草素诱导的上游信号RIP1和RIP3的活化。
 
出国看病概况

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　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
出国看病适应症
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