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神经胶质瘤细胞的增殖和侵袭
  • 　　神经胶质瘤是成人中最常见的颅内恶性脑肿瘤，其特征是生长迅速，早期转移和高致死率。胶质瘤的流行病学和分子病理学。尽管在神经胶质瘤的治疗方面取得了许多成就，但预后仍然不理想，已经进行了许多研究来检测与神经胶质瘤相关的分子，但只有少数发现垂死的神经胶质瘤细胞通过caspase3依赖性机制建立促血管生成微环境。多形性胶质母细胞瘤：通过临床表现和治疗对其流行病学和发病机制进行综述。因此，迫切需要发现治疗神经胶质瘤患者的新型分子靶标。
    　　 长的非编码RNA由一组RNA分子组成，这些RNA分子的长度超过200个核苷酸，具有有限的蛋白质编码潜力。癌症病因和进展的表观遗传调节剂，调节剂和介体。越来越多的证据表明，lncRNA在基因转录，翻译和广泛的调控子中可能起重要作用深入了解功能。长非编码RNA在人类癌症中的功能作用。LncRNA失调导致多种癌症的进展。表明在透明细胞肾细胞癌中，MALAT1的高表达与肿瘤的进展和预后不良有关。长期非编码RNAMALAT1的上调与透明细胞肾细胞癌的肿瘤进展和不良预后有关。lncRNAGHET1通过EMT过程促进食管鳞状细胞癌细胞的增殖和侵袭。lncRNAHNF1A-AS1通过调节miR-17-5p表达促进肺癌细胞的增殖和侵袭长非编码RNAHNF1A-AS1通过调节miR-17-5p在非小细胞肺癌中促进细胞增殖和侵袭。
    　　 LINC00473是一种基因间长非编码RNA，据报道在几种恶性肿瘤中异常表达。表明LINC00473可以作为LKB1灭活的肺癌的治疗靶标发现LINC00473是一种致癌基因，可通过miR轴促进Wilms肿瘤生长LINC拮抗抑癌药miR-195，通过IKK介导肿瘤的发病机制。提示LINC00473通过miR-34a途径促进宫颈癌的进展较长的非编码RNALINC00473是microRNA34a的靶标，可通过抑制宫颈癌中的ILF2降解来促进肿瘤发生。但是，LINC00473在神经胶质瘤中的表达和生物学功能仍然知之甚少。LINC00473表达在神经胶质瘤组织和细胞系中显着增加。LINC00473高表达与晚期临床特征和不良预后相关。在机制上发现LINC00473通过充当miR-637的ceRNA来调节CDK6表达来促进神经胶质瘤细胞的增殖，侵袭和EMT过程。两者合计建议CDK6轴可能充当神经胶质瘤治疗的潜在治疗靶点。分别获取31份神经胶质瘤标本和14份正常脑组织。诊断基于病理证据，收集的组织样本立即在液氮中速冻，并保存在-80°C直至使用。所有患者术前均未接受术前治疗。
    　　 人神经胶质瘤细胞系和正常人星形胶质细胞均在37％含5％CO2的潮湿环境中于含10％胎牛血清的Dulbecco's改良Eagle's培养基中培养。使用TRIzol试剂从组织样品或培养的细胞中提取总RNA。第一步，用Prime-ScriptTM的逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。ABI7500系统和SYBRGreenPCRMasterMix试剂盒进行qRT-PCR。标准化为内源性对照GAPDH或U6后，每个实验至少重复三次。使用RIPA分析法从细胞中提取总蛋白，然后上电电泳。在300mA的PVDF膜上转移100分钟后，将膜在5％脱脂奶中封闭2h，并与一抗在4°C下孵育过夜。然后将膜用辣根过氧化物酶偶联的第二抗体处理2小时。使用ECL检测系统检测到这些条带。简而言之，将转染的细胞接种到96孔板中，并培养24h，48h，72或96h。然后将转染的细胞与20uLMTT溶液温育，然后将其添加到每个孔中，并在37°C孵育另外4h。在490nm的波长处测量吸光度。为了进行集落形成测定，将转染的细胞接种到6孔板中，在37℃下孵育2周。随后用PBS洗涤菌落，用甲醇固定，然后用结晶紫染色。将库尔特计数器用于计数细胞集落。Transwell入侵测定法根据说明和先前的研究进行处理长期非编码RNAMALAT1的上调与透明细胞肾细胞癌的肿瘤进展和不良预后有关。
    　　 通过位点突变法合成了具有LINC00473的野生型和突变型3'UTR，通过PCR扩增，然后插入pmirGLO。然后将Wt-LINC00473或Mut-LINC00473构建体与miR-637模拟物或miR-NC一起转染到细胞中，该过程在24孔板内进行。48小时后，使用Dual-LuciferaseReporterAssay系统检测到萤光素酶活性。海肾荧光素酶活性用于标准化。使用EZ-MagnaRIP试剂盒对细胞进行RIP分析。在完全的RNA裂解缓冲液中裂解细胞，然后使用RIP缓冲液孵育，该缓冲液包含与人抗体或阴性对照小鼠IgG偶联的磁珠。用蛋白酶K消化该蛋白质，并分离出免疫沉淀的RNA。对纯化的RNA进行qRT-PCR分析。
    　　 裸鼠无胸腺小鼠，为了进行肿瘤发生测定，将经sh-NC或sh-LINC00473转染的U251细胞皮下注射到裸鼠的腹侧，然后使用以下公式以7天为间隔测量肿瘤体积。注射后7周，处死小鼠，收获肿瘤，用于测定肿瘤质量以及IHC分析Ki-67的表达水平。整个数据分析采用SPSS17.0软件。使用均值±标准差的格式表示结果。将两尾学生t检验或方差的单向分析用于统计分析。p小于.05被认为具有统计学显着性差异。
    　　 qRT-PCR用于检测LINC00473在31个配对的神经胶质瘤组织和正常脑组织中的表达。QRT-PCR显示在神经胶质瘤组织中LINC00473表达增加。LINC00473的高表达与WHO分级高，KPS分数低有关。显示LINC00473高表达的患者导致总体生存率和无病生存期差。此外，与NHA细胞相比，LINC00473在神经胶质瘤细胞中的表达明显上调。这些数据表明LINC00473可能在神经胶质瘤的进展中起关键作用。LINC00473在神经胶质瘤中被上调。LINC00473在神经胶质瘤组织中的表达高于正常组织。LINC00473在具有高WHO水平和低KPS评分的神经胶质瘤患者中上调。在神经胶质瘤患者中，高LINC00473表达与OS和DFS差有关。与NHA细胞相比，LINC00473在神经胶质瘤细胞系中高度表达。
    　　 为了研究LINC00473在肿瘤进展中的作用，将神经胶质瘤细胞用si-LINC00473或si-NC转染。QRT-PCR显示，si-LINC00473显着降低了LN18和U251细胞中的LINC00473表达，特别是在si-LINC0073-1中。MTT和集落形成试验表明，LINC00473抑制显着降低了LN18和U251细胞的活力。Transwell分析表明，LINC00473抑制作用会降低LN18和U251细胞的侵袭能力。为了进一步确定潜在的机制，使用qRT-PCR和Western印迹测定来确定神经胶质瘤细胞中的MMP9，E-cadherin和N-cadherin表达。结果表明，LINC00473抑制可显着降低MMP9和N-钙粘蛋白的表达，同时增加E-钙粘蛋白在mRNA和蛋白质水平上的表达。
    　　 越来越多的证据表明，胞质lncRNA可以充当活性miRNA池的汇，在功能上释放mRNA以介导多种生物学过程。通过lncLocator探索了LINC00473的分布绝大多数位于细胞质中，并且通过qRT-PCR进一步证实了结果。随后，使用DIANA预测LINC00473的靶标，结果表明LINC00473可以靶向miR-637。萤光素酶报道基因测定显示，miR-637过表达显着降低了Wt-LINC00473而不是Mut-LINC00473的萤光素酶活性。RIP分析显示LINC00473和miR-637均富含免疫沉淀。QRT-PCR显示，与si-NC组相比，si-LINC00473显着增加了LN18和U251中的miR-637表达。LINC00473充当神经胶质瘤细胞中miR-637的海绵。lncLocator和qRT-PCR显示LINC00473位于细胞质中。LINC00473信息以及miR-637和LINC00473之间的结合位点。miR-637模拟物降低了Wt-LINC00473组的萤光素酶活性。RIP测定揭示了LINC00473和miR-637表达都在免疫沉淀中富集。LINC00473抑制增加了LN18和U251细胞中miR-637的表达。神经胶质瘤组织中的miR-637降低。miR-637的低表达与WHO等级高和KPS分数低有关。在胶质瘤组织中，高LINC00473表达与miR-637表达负相关。研究表明，miRNA可以通过直接结合其靶基因的3'UTR来调控基因表达。TargetScan显示CDK6具有miR-637的潜在结合位点。探索了神经胶质瘤中CDK6的表达，结果表明CDK6在神经胶质瘤中显着增加这与TCGA数据库结果一致。KaplanMeier分析表明，高表达CDK6与神经胶质瘤患者的OS和DFS差有关。萤光素酶报告基因检测结果表明，miR-637模拟物降低了Wt-CDK6而不是Mut-CDK6组的萤光素酶活性。miR-637的异位表达降低了LN18和U251细胞mRNA和蛋白水平的CDK6表达。此外，CDK6表达与神经胶质瘤组织中的miR-637表达负相关。
    　　 miR-637和CDK6之间的预测结合位点。CDK6在神经胶质瘤组织中的mRNA和蛋白水平均上调。TCGA数据库显示神经胶质瘤组织中CDK6表达上调。KaplanMeier分析表明，CDK6高表达与神经胶质瘤患者的OS和DFS差有关。miR-637模拟物降低了Wt-CDK6组的萤光素酶活性。MiR-637在mRNA和蛋白质水平上均能降低CDK6的表达。CDK6表达与神经胶质瘤组织中的miR-637表达负相关。LINC00473是否可以通过竞争性结合神经胶质瘤中的miR-637来调控cdk6中的ceRNA。QRT-PCR和蛋白质印迹显示LINC00473抑制LN18细胞可降低CDK6表达，而miR-637抑制剂可逆转该降低。在胶质瘤组织中，LINC00473表达与CDK6表达呈正相关。此外，救援试验表明，miR-637抑制剂可以消除LINC00473抑制对神经胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响。qRT-PCR和Western印迹结果表明miR-637抑制作用可以逆转LINC00473抑制作用对LN18细胞中N-钙粘蛋白，MMP9和E-钙粘蛋白表达的影响。这些数据表明LINC00473可通过调节CDK6轴促进神经胶质瘤细胞的进展。
    　　 胶质瘤进展中的CDK6轴。LN18细胞中的miR-637抑制剂可以逆转LINC00473抑制CDK6的作用。LINC00473表达与神经胶质瘤组织中的CDK6表达正相关。可以通过miR-637抑制剂挽救LINC00473对LN18细胞增殖和侵袭的抑制作用。LINC00473抑制对E-钙粘蛋白，N-钙粘蛋白和MMP9表达的影响可以通过miR-637抑制剂挽救LN18细胞。为了探索LINC00473在体内的作用，使用了异种移植小鼠模型。结果显示，与sh-NC组相比，sh-LINC00473组的肿瘤生长和体重得到了显着抑制。Ki67测定表明LINC00473抑制降低了肿瘤细胞的增殖。探索了异种移植组织中的CDK6轴表达，结果表明LINC00473和CDK6的表达显着降低，而miR-637的表达在sh-LINC0047中得到上调。因此，认为LINC00473可以通过损害CDK6轴来促进神经胶质瘤的进展。LINC00473抑制作用降低了体内肿瘤的生长。LINC00473下调减少了体内肿瘤的生长和重量。通过IHC测定异种移植组织中的Ki67表达。通过qRT-PCR确定LINC00473，miR-637和CDK6在异种移植组织中的相对表达。通过Western印迹测定异种移植组织中的CDK6表达。
    　　 神经胶质瘤由于其快速的增殖和浸润性生长，导致侵袭到正常的脑组织中，并导致不完全切除和复发而对神经外科医师具有挑战性。成人半球低度神经胶质瘤切除术后的复发和恶性变性。最近，越来越多的证据表明lncRNAs促进了神经胶质瘤的发生和发展。发现lncRNACASC7通过调节Wnt/B-catenin途径抑制神经胶质瘤的增殖和侵袭CASC7通过调节Wnt信号通路抑制神经胶质瘤的进展。提示lncRNAMEG3可通过调控Sirt7和PI3K途径来减少神经胶质瘤细胞的增殖和迁移。发现lncRNA通过靶向CCND2轴促进了胶质瘤的发生较长的非编码RN通过靶向CCND2轴来促进神经胶质瘤恶性肿瘤和肿瘤发生。在本研究中，研究人员确定了LINC00473在神经胶质瘤中的作用。QRT-PCR显示在胶质瘤组织和细胞系中LINC00473表达上调。LINC00473高表达与WHO分级高，KPS低有关。显示LINC00473高表达的患者导致OS和DFS差。LINC00473抑制在体外抑制神经胶质瘤细胞的增殖，侵袭和EMT过程，并在体内降低肿瘤的生长。这些数据表明LINC00473可以作为神经胶质瘤肿瘤发生中的致癌lncRNA。
    　　 胞质lncRNA在癌变过程中主要起ceRNA或分子海绵的作用长的非编码RNAMEG3通过充当miR-19a的竞争性内源RNA抑制神经胶质瘤细胞的增殖，迁移和侵袭。lncRNAHOTAIR通过充当miR-126-5p的分子海绵来促进神经胶质瘤的进展。较长的非编码RNAHOTAIR作为竞争性内源RNA，通过使miR‐126‐5p海绵化来促进神经胶质瘤的进展。miR-130a海绵通过靶向E2F8来调节神经胶质瘤的发展。因此推测LINC00473可能是神经胶质瘤进展中的ceRNA。在当前的研究中，表明LINC00473的大部分位于细胞质中，生物信息学分析表明miR-637可以与LINC00473结合。LINC00473和miR-637之间的相关性已通过双荧光素酶报告基因和RIP分析进一步证实。救援测定表明，miR-637抑制剂可以消除LINC00473抑制对神经胶质瘤细胞进展的影响。此外，在神经胶质瘤组织中，miR-637表达与LINC00473表达负相关。因此提示LINC00473至少部分地通过调节miR-637的表达在神经胶质瘤的发展中发挥其致癌作用。CDK6是蛋白激酶复合物的激酶催化亚基，参与G1进程和过渡。最近的研究表明，CDK6可能在肿瘤进展中起关键作用。发现miR-218通过CDK6轴抑制了胃癌细胞周期的进展。miR-218通过反馈回路中的CDK6轴抑制胃癌细胞的循环进程。发现lncRNANNT-AS1通过CDK6轴促进了肝细胞癌的转移。长的非编码通过CDK6轴促进肝癌的进展和转移。神经胶质瘤中CDK6表达显着增加，并且与OS和DFS差有关。证实CDK6是神经胶质瘤细胞中miR-637的靶基因。LINC00473抑制可降低CDK6表达，而miR-637抑制剂可部分消除这种作用。在胶质瘤组织中LINC00473表达与CDK6表达正相关。LINC00473通过使miR-637变海绵和上调CDK6来促进神经胶质瘤的增殖和侵袭。出国看病网研究人员的研究表明，高表达LINC00473通过调节CDK6轴促进神经胶质瘤细胞的增殖和侵袭，这为神经胶质瘤的治疗提供了潜在的靶点。
 
出国看病概况

海外医疗在国外发展较为成熟，比如在欧美等医疗技术发达国家，很多医院都设有国际病人办公室并配备多语种医学专业翻译人员，就医流程和模式都已相对成熟。在国内，海外医疗虽然还属于新兴行业，但发展势头迅猛，发展潜力巨大，市场前景广阔。
　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
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