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如何抑制胶质母细胞瘤的侵袭
  • 　　胶质母细胞瘤的侵袭性扩散与硫酸软骨素蛋白聚糖相关的硫酸化糖胺聚糖的变化有关，而这些变化在肿瘤微环境中选择性上调。出国看病网研究人员假设抑制TME中的CS-GAG信号传导将阻止GBM入侵。与单硫酸化和未硫酸化的大鼠F98GBM细胞相比，CS-A和CS-E4-和4,6-硫酸化的CS-GAG基质的过硫酸化3维复合材料具有增强的优先细胞侵袭能力基于微流体的选择测定中的透明质酸基质，这很可能受到GAG受体结合特异性差异的影响。F98和人类患者来源的神经胶质瘤干细胞均表现出GSC标记CD133和CSPG的高度共定位。小分子硫酸化GAG拮抗剂减少了封装在COMP基质中的F98细胞的侵袭和黏附，并阻断了CD133和硫酸软骨素抗体的检测F98细胞和人GSC中的各种抗原。经Surfen处理的F98细胞下调了CSPG结合受体的转录本和蛋白质，以及总的和活化的ERK和蛋白激酶B。最后，用额叶肿瘤诱导并用瘤内单一剂量的surfen治疗的大鼠显示出减轻的肿瘤负担和与未经处理的对照相比传播。这些结果首次证明了surfen作为硫酸化GAG信号抑制剂可阻止GBM入侵的证据。
    　　 胶质母细胞瘤的致死性在于其对护理标准治疗产生抵抗力并迅速侵袭功能性大脑区域的能力。外科肿瘤切除与术后放射化学疗法及其他辅助疗法的结合对患者生存的影响微乎其微，其中大多数患者在诊断和治疗后10至14个月内死于该疾病。在过去30年中，GBM治疗范例没有取得重大突破，GBM患者的预后仍然很差。GBM入侵的驱动程序未知。原发性神经胶质瘤很少在中枢神经系统外转移，提示肿瘤微环境可能在介导脑肿瘤的维持和进展中起重要作用。中枢神经系统外转移的缺乏可以通过GBM细胞与肿瘤血管周围小生境中脑细胞外基质成分的专门相互作用来进一步解释。在健康的大脑组织的神经源壁中，神经干细胞通常位于脉管系统周围以及富含内源利基因子和促进细胞增殖和自我更新的信号分子的区域。TMEECM的成分类似于NSC的利基成分，并支持肿瘤的生长，侵袭和治疗耐药性，GBM细胞表面受体及其配体在肿瘤周围的表达增强证明了这一点。已知侵袭性神经胶质瘤干细胞具有治疗抗性，与GSC相关的CD133和CD44与细胞增殖和表型稳定性密切相关。TME中ECM蛋白，碳水化合物和细胞表面受体的显着过表达与GBM患者的恶性肿瘤和预后恶化直接相关。因此，有必要了解ECM修饰在GBM进展中的作用，以开发靶向治疗，以阻止GBM的侵入性扩散并增强细胞毒剂的疗效。
    　　 硫酸软骨素蛋白聚糖及其相关的硫酸化糖胺聚糖侧链是大脑ECM的主要组成部分，也是神经元生长，生长因子保留和ECM组织的重要调节剂。在人GBM中高表达，并且预后不良。CS-GAG硫酸盐和TME在高侵袭性脑肿瘤周围的异常修饰涉及编码磺基转移酶的转录本的上调，该转录本催化将6-O硫酸盐添加到4-硫酸化CS-GAG模板中，从而产生相应的二硫酸4,6-硫酸软骨素产品。CXCR4受体在GBM细胞中高度表达，在封装于二硫化CS-E基质中的细胞中其表达进一步增强。沿着白质束发现的趋化因子配体12可促进GBM沿脑白质的侵袭，从而在大脑其他部位形成新的肿瘤灶。在这些研究中证明，封装在含CS-E的水凝胶基质中的U87MG人GBM细胞迁移速度更快，表达的CXCR4和CSPG结合白细胞常见抗原相关受体明显更多，与CXCL12介导的触觉增强相比，与其他单和未硫化的GAG基质中的细胞。尽管尚不清楚这些CS-GAG修饰在促进神经胶质瘤恶性肿瘤中的确切作用，但GBMTME中过度硫酸化CS-GAG和磺基转移酶的存在增加提示生长因子信号转导和肿瘤侵袭增强，并暗示了其独特和必要的作用。TME中的硫酸化CS-GAG。
    　　 单独的细胞毒性疗法在抵抗GBM的侵入性传播方面还没有成功。局部浸润是实体瘤的标志，但靶向浸润的药物类别仍基本上未纳入治疗方案。抑制癌细胞通过脑ECM侵袭的药物可以通过延迟肿瘤复发并改善肿瘤切除程序和护理标准疗法的疗效来提高生存率。surfen是一种小分子硫酸化GAG拮抗剂，以前已证明它与所有硫酸化GAG都具有高亲和力并以电荷密度依赖性方式结合。GBM中的ERK和蛋白激酶B激活与增强的肿瘤增殖和侵袭性相关，而surfen先前已有报道抑制ERK磷酸化和碱性成纤维细胞生长因子的结合和信号传导。这些特性使surfen成为用于GBM的入侵阻止策略的有吸引力的候选对象。在研究中调查了迄今尚未报道的surfen介导的抑制GBM细胞与细胞外硫酸化CS-GAG相互作用。进行细胞迁移分析，以评估F98GBM细胞对差异硫酸化CS-GAG水凝胶环境的偏好，以及surfen介导的抑制作用对细胞侵袭和信号传导的影响。使用蛋白质印迹分析评估了经Surfen处理的细胞的CSPG受体以及细胞内ERK和Akt信号传导的变化。使用水凝胶结合测定法检查细胞膜受体与CS-GAG的结合，并通过实时定量PCR定量基因表达。出国看病网研究人员使用同种异体F98细胞诱导了成年大鼠的额叶肿瘤，
    　　 将大鼠F98GBM细胞在含有10％胎牛血清和1％青霉素的DMEM–F-12组成的培养基中培养-链霉素。GSC从人类原发性GBM组织中分离出来，进行分子鉴定，并根据Emory大学机构审查委员会协议45796批准的程序在培养物中建立。GSCs在NeurobasalA培养基中保存，该培养基含有1％青霉素-链霉素和0.5％1-谷氨酰胺，补充有1％N-2补充剂，2％B-27补充剂，bFGF，人表皮生长因子和0.4％肝素。将细胞在37°C与5％CO2孵育和95％的相对湿度。每两天给细胞补充培养基一次，除非传代或提取用于体外和体内试验。用于评估细胞侵入2种成分不同的水凝胶中的选择。合成了CS-GAG和透明质酸水凝胶。通过在DMEM–F-12中用0.05％Irgacure-2959重建甲基丙烯酸CS-GAG来创建用于迁移测定的水凝胶交联混合物。水凝胶基质选择包括3％四硫酸软骨素或3％CS-A和15％硫酸盐组成的水凝胶基质选择将CS-A的区域选择性磺化衍生的CS-E接种到设备的2个外部通道井中的一个中，用轻柔的吸力填充通道。一旦外部2个通道充满未交联的水凝胶混合物，则将设备暴露于365nm的光，持续20s，以启动基质交联和水凝胶形成。随后，通过轻轻抽吸将1×104F98GBM细胞接种到中心通道中，以通过中心通道将培养基中的细胞拉出，而不会干扰包含交联水凝胶的侧通道。随后将设备放入培养箱中培养6小时，然后进行固定和成像。
    　　 在单独的GAG抑制试验中，细胞带有或不带有20uMsurfen的水凝胶。所有细胞均预先用Hoechst-33342和亲脂性膜染料标记，以标记细胞核和细胞膜，然后播种到微流控设备中。将器件在5％CO2下于37°C孵育6小时在使用倒置荧光偏振显微镜进行宽场落射荧光成像之前，应先在95％的湿度和95％的湿度下进行。使用Volocity6.3分析了低倍率平铺图像，以量化细胞向水凝胶通道的迁移。成像后立即用含4％多聚甲醛和0.4M蔗糖的1xPBS固定设备。在6孔14毫米玻璃底细胞培养皿中进行水凝胶封装细胞的细胞活力和免疫细胞化学分析。如上所述培养细胞并用Hoechst标记，然后封装在0.5％甲基丙烯酸HA或3％COMP基质中。在二维表面上培养的细胞用作对照。将F98细胞封装在200ul的每种水凝胶交联混合物和UV交联物中。交联后，将1ml补充培养基分配到每个孔中，并按照前述方法孵育48小时。所有测定均重复三次。
    　　 根据制造商的说明，使用钙黄绿素AM评估细胞活力。使用LeicaDMIRBE显微镜获取每种水凝胶类型和2D对照至少4张图像，并使用钙黄绿素绿色荧光和Hoechst蓝荧光的共定位测量对细胞活力进行定量。所有测定均一式三份进行，每个技术重复3次。在6孔，14毫米玻璃底细胞培养皿上进行F98细胞培养，surfen处理的细胞和未经处理的对照的染色和成像。将细胞以每孔3×104个细胞的浓度播种24h，然后用含20uMsurfen的基础培养基处理24h。用PFA固定细胞，并用ActinGreen488和碘化丙锭染色。使用LeicaDMIRBE显微镜获取细胞图像。使用同种型匹配的针对神经元核的一抗对CD133进行阴性对照抗体染色，并使用抗小鼠IgG1AlexaFluor488仅对二抗进行染色。在使用含有4％PFA和0.4M蔗糖的1xPBS固定后，使用针对粘着斑激酶和纽蛋白的两部分抗体染色标记水凝胶通道中的迁移细胞。每个水凝胶类型至少从5个图像中获取至少5张图像，并按上述方法进行共定位测量分析。使用配备有Zen软件的蔡司LSM710显微镜获取代表性图像。
    　　 这些实验使用已提取并在干冰上速冻的成年大鼠脑组织。使用低温恒温器在带电载玻片上收集五十微米的冠状切片，并保存在零下20度直至使用。将F98细胞封装在2ul0.5％HA或3％COMP水凝胶混合物中，并接种到1个半球的call体腹侧组织中。确认水凝胶交联和细胞包封后，将切片培养物上铺有切片培养基，其中含有24％胎牛血清，1％青霉素链霉素和10mMd-葡萄糖-并在37°C，5％CO2下孵育，并在95％的湿度下保持96小时。随后使用含有4％PFA和0.4M蔗糖的1xPBS固定切片培养物，并对CD133和硫酸软骨素抗体进行免疫组织化学染色。在水凝胶接种区域边界之外检测到的CD133+细胞总数白色圆圈代表0.157-mm3计算在脑组织内同侧和接种区域对侧的同侧区域，以检测细胞渗入水凝胶接种区域以外的组织的程度。计算穿过中线并在对侧半球中检测到的所有细胞，并绘制细胞总数。绘制总细胞数，并提供CD133+独立表示在同侧和对侧半球的水凝胶接种区域之外检测到细胞。所有测定均一式四份进行，每组包括3个技术重复。使用LeicaDMIRBE显微镜获取低倍率平铺图像，并使用配备Zen软件的ZeissLSM710共聚焦显微镜获取代表性的高倍率图像。
    　　 将F98细胞封装在0.5％HA或3％COMP水凝胶混合物的20ul内，并按照前述方法放入微流体装置中，并在37°C，5％CO2和95％湿度下培养24小时。使用微流体装置为水凝胶中细胞的活细胞成像提供受限的尺寸。将设备从孵育中移出，并放入温度和湿度可控的台式成像室中，每10分钟对活细胞迁移成像6小时。使用已建立的协议处理获取的图像，并绘制水凝胶包封的细胞的细胞位移和跟踪速度。48小时后收集在有或没有含20uMsurfen的培养基中培养的F98细胞，并在含有RocheCompleteUltraProteaseInhibitorCocktail的1xM-PER哺乳动物蛋白提取缓冲液中裂解。提取的总蛋白使用二辛可宁酸测定法进行定量，每条泳道中4-20％梯度凝胶中分离出约5ug总蛋白，然后转移到硝酸纤维素膜上。在含0.1％Tween-20和3％牛血清白蛋白的Tris缓冲盐水中将印迹封闭1h，并在4°C与相应的一抗孵育过夜，然后用含0.1％Tween-20的TBS洗涤，并与适当匹配的荧光二抗在含0.1％Tween-20和3％BSA的TBS中室温孵育1小时。然后将膜用1xTBS洗涤并保持在1xTBS中，直到使用ChemiDocMPSystem成像。
    　　 对于水凝胶结合测定，在96孔微孔板中制备50ulHA，CS-A或CS-E水凝胶，每个水凝胶有12孔，并用蒸馏水冲洗，并冻干过夜。用结合缓冲液中的5％BSA预处理微孔板，以减少非特异性蛋白结合。将凝胶在结合缓冲液中以1：1比例稀释的100ug蛋白裂解物中重新水化，然后在4°C的摇摆平台上放置过夜。分别封闭的凝胶接受含有100uMsurfen的结合缓冲液，并在蛋白质裂解物温育之前，在摇动平台上于4°C放置过夜。随后用200ul结合缓冲液洗涤凝胶，并用200ul含2MNaCl的结合缓冲液洗涤两次洗脱结合蛋白，以洗脱结合蛋白。随后浓缩洗脱的蛋白质，并在进行蛋白质印迹之前，使用30-KMW截止浓度的浓缩器将缓冲液更换为PBS。在4–20％的梯度凝胶上，每个重复样品可洗脱5微克蛋白质，然后转移至纯硝酸纤维素膜。使用具有相同同种型和荧光染料的单标记样品进行适当的颜色补偿，以消除所需通道中的假阳性荧光。使用Amnis图像数据探索和分析软件通过以下选通策略对每次采集进行分析。首先，使用明场图像识别聚焦的单个细胞，然后使用事件的粒度和面积消除碎片和双峰。最后，荧光强度用于鉴定阳性或阴性细胞。
    　　 使用RNeasyPlusMiniKit从未经或经过48小时surfen处理的细胞中分离出总RNA。消除基因组DNA后，使用RTFirstStrandKit合成cDNA。每次处理，在25ul实时qPCR反应中均使用了9000纳克的cDNA模板总RNA效物，以及SybrGreen染料和预先验证的引物。使用以下循环条件对每个样品一式三份进行目标和内源对照测试：95°C10分钟，95°C40s循环15s和60°C1分钟，然后使用QuantStudio进行熔解曲线分析6Flex实时PCR系统，使用参考文献中先前所述的条件。一式三份进行测定。使用ΔΔ测定靶基因的相对定量基因表达方法。在针对每个处理标准化后，针对内对照，计算靶基因表达水平，然后以相对单位表示。与仅培养基的对照相比，靶基因的表达增加了2倍以上。
    　　 所有动物研究均获得乔治亚大学动物保护与使用委员会的批准，并且所有实验方案均按照《实验动物的护理和使用指南》进行。将八周大的雄性Sprague-Dawley大鼠分为对照组或治疗组。第4或5代F98细胞用VybrantDiO细胞标记溶液并准备好浓度为5×104在手术前以5ulDMEM–F-12的体积加入。手术前，每只大鼠均用4％的异氟烷气体麻醉，并将头脱毛以暴露皮肤。将动物放在加热的垫子上以将核心体温维持在37°C，并将头部固定在立体定位框架中，将鼻子固定在提供维护工作的鼻锥中在整个过程中以2％麻醉。使用交替洗必泰和乙醇拭子对手术部位进行三次消毒，然后沿切口部位施用0.2ml利多卡因。进行纵向切口，以露出中线和前reg缝线，在前reg前1mm和中线侧2mm处有一个直径约1mm的毛刺孔，作为产生额叶肿瘤的穿刺点。将装有5ulF98细胞或含有20uMsurfen的培养基中的细胞并装有26g针的汉密尔顿注射器降低至薄壁组织3mm，并以1的流速分配使用微量注射泵以微升/分钟计。完成后，将注射器再降低0.5毫米，然后缓慢缩回，以防止注射体积的任何回流。随后，将毛刺孔完全用一薄层牙科用胶粘剂密封并进行紫外线固化。将皮瓣缝合在一起以闭合伤口，在缝合的皮肤上铺上三层抗生素乳膏。皮下注射丁丙诺啡，然后将动物从麻醉中移出，并置于加热灯下新的干净笼子中进行恢复。恢复后将动物放回其家笼中。
    　　 所有协议均使用35×35mm的视场和1mm的切片厚度。在每个时间点确定切片数以确保完全覆盖肿瘤体积。在第二和第三方案之间，给动物腹膜内注射300ulcontrast造影剂。第三个协议在注射后7分钟开始，第四个协议在注射后15分钟开始。在整个过程中，使用2-3％的异氟烷气体对动物进行麻醉和维持，通过通讯座中的循环水加热垫。在整个成像过程中监测呼吸。在第28天的时间点，用5％的异氟烷气体麻醉动物，并用250ml缓冲盐水冲洗进行心脏灌注，然后加入250mlPBS中的4％PFA。灌注完成后约30分钟提取大脑，将每只大脑在液氮中新鲜冷冻并保存在-80°C下。使用低温恒温器将提取的大脑切成15um的厚度，每只动物收集至少15张载玻片，每张载玻片4个切片。使用一级抗体对冷冻切片机切片的脑切片进行免疫组织化学染色。还用标准苏木精和曙红方法对切片进行染色。每张幻灯片的4个切片中每个切片的五个目标区域成像，每个处理使用4只动物进行免疫组织化学分析。共定位测量是使用Volocity软件并根据出国看病网研究人员之前发布的方法进行的。
    　　 使用了改良的3通道微流体平台以研究surfen介导的CS-GAG基质选择的抑制对播种后GBM细胞侵袭的影响。在F98细胞侵袭比较分成不同的硫酸化和未硫酸化的GAG矩阵分析中，出国看病网研究人员检测到的显著，当与单硫酸CS-GAG比较F98细胞的更大的侵入过硫酸COMP矩阵。这些分析结果表明，与不使用surfen的人相比，F98细胞对含20uMsurfen的COMP水凝胶的侵袭显着降低。Surfen未负面如通过在用20个uMsurfen处理过的细胞中观察到细胞存活力的高百分比确定细胞存活力影响。对粘着斑衔接蛋白蛋白vinulin和FAK的免疫组织化学分析表明，surfen的添加破坏了粘着斑复合物，这从二维细胞培养和COMP基质包裹的粘着斑复合蛋白的共定位显着降低可以明显看出与未处理的对照组。与GAPDH上样对照相比，有或没有surfen处理的F98裂解物的相应Western印迹显示可检测到的纽蛋白减少。
    　　 为了研究surfen对CSPG和GSC特异性硫酸化糖蛋白检测的影响，在正常生长培养基或含有surfen的培养基中培养了F98细胞48小时，随后进行标记和鉴定，以鉴定CD133+和CS-56+细胞使用成像细胞仪。与未处理的F98细胞相反，surfen处理似乎显着阻断了CD133和CSPG的检测。还标记了封装在对照和surfen处理的COMP基质中的F98细胞，以及在对照未处理和surfen处理的培养基中培养的F98细胞和患者来源的GSC。surfen在2D和3维COMP基质包裹的F98细胞以及2D患者自体培养的GSC中显着阻止了抗体与跨膜糖蛋白CD133和细胞外CSPG的结合。但是，surfen不会对源自患者的GSC中抗体与转录因子SOX1的结合产生负面影响。由于surfen的最大发射波长为485nm，最大激发波长为360nm，因此可以通过荧光显微镜检测surfen的细胞定位。对照和经surfen处理的F98细胞的Z堆栈成像表明surfen。
    　　 为了证明3DECM微环境对细胞迁移的影响，将F98细胞封装在HA或COMP水凝胶中，并接种在微流体装置的2个外部尺寸受约束的通道中。使用落射荧光显微镜对细胞迁移进行成像，并量化6小时内的速度和位移。与HA水凝胶中的细胞相比，COM水凝胶中的F98细胞在6h内显示出明显的速度增加和移动距离，表明平均速度为0.00188±0.000804um/s，行进距离为1.861±1.256um。为了在不存在灌注流的情况下评估F98细胞对基质组成和浸润速率的偏好，设计了切片培养物侵袭试验。在该测定中，将封装在HA或COMP水凝胶中的F98细胞接种到50um未固定大鼠脑组织冠状切片的纹状体中，并在体外培养96h，以进行固定和成像。免疫组织化学染色和迁移的CD133+和CS-56+F98细胞的分析使用落射荧光和共聚焦显微镜成像并定量。最初接种在COMP水凝胶中的F98细胞表现出显着增加的组织浸润细胞数量，与最初植入HA中的细胞相比，该细胞穿过中线进入对侧半球并进入脑切片的脑室下区域矩阵。
    　　 为了研究F98细胞裂解物中CS-A和COMP基质与CSPG结合受体的差异结合特异性，进行了F98细胞裂解物与CS-A和COMP水凝胶的水凝胶结合测定，并用抗体探测了与水凝胶结合的蛋白质参考文献中先前报道的针对CS-GAG和CSPG受体的抗NG1，NG3，LAR和RAGE。洗脱的F98细胞裂解物的Western印迹显示，与从单硫酸化CS-A基质洗脱的裂解物相比，在含二硫化CS-E的COMP水凝胶基质中CSPG受体存在的明显趋势增加。将F98裂解物引入预先用100uMsurfen处理的水凝胶基质中时，CS-GAG水凝胶基质中的CSPG受体结合被完全阻断。进行了蛋白质印迹分析以研究surfen处理对GBM细胞增殖和侵袭所必需的ERK和Akt活化的影响。Surfen处理诱导的显著，与未处理对照相比，F98细胞内总的和磷酸化ERK和Akt蛋白的下调。对GAPDH上样对照进行标准化后，对谱带强度进行定量并绘制光密度单位。
    　　 单独用同种异体F98细胞或在含有20uMsurfen的培养基中用F98细胞诱导大鼠前脑肿瘤，并在接种后使用MRI监测肿瘤的进展。通过可控制的实质内注射递送的F98细胞诱导了健壮的额叶GBM肿瘤，surfen治疗显着减少了接种后肿瘤体积。肿瘤组织中顺磁性铁和离子的存在会导致局部磁场不均匀，从而导致更快的信号衰减，从而缩短值。对照组和用surfen处理的动物在肿瘤诱导后观察到T2*总体分布的显着差异。在对照肿瘤周围低T2值的不规则肿瘤边界类似于坏死脑组织和血液和流体积聚。在接受surfen处理的动物中，第14天和第21天的肿瘤体积均值降低了，尽管在后两个时间点均未观察到组间的统计学意义。定性观察表明，与对照肿瘤相比，接受surfen治疗的大鼠表现出明确的肿瘤边界，较高的T2值表明与周围健康的脑组织相似。观察到9只对照动物中的3只显示出在28天时间点过去之前需要人道终点的症状，而经surfen处理的动物均未在28天前显示任何明显的不良症状。在第28天对动物实施安乐死，以观察对照和治疗动物的组织水平变化。在用surfen处理的动物中，H＆E染色显示与对照肿瘤组织相比，在相应的MRI中观察到的边界受限，并且在肿瘤坏死核心周围的假性盘状坏死区域减少了。
    　　 由于surfen可以减少抗体的结合以及CSPG和CD133的检测，因此研究这些标志物与GSC标志物SOX1的免疫组织化学染色在从surfen处理过的动物的肿瘤组织切片中是否同样受到抑制。未经治疗的动物的肿瘤中硫酸化CSPG的含量显着增加，其特征是整个肿瘤块中的CS-56+染色，并在假pal状骨和肿瘤边界周围特别沉积与用surfen处理的动物。与对照组相比，经surfen处理的动物的肿瘤所含CD133和SOX1+细胞明显减少，但在增殖细胞数量上没有显示任何显着差异。GSC标记CD133和CSPG标记CS-56的共定位显示，与对照肿瘤相比，surfen治疗后CD133+细胞与细胞外CS的结合显着降低。出国看病网研究人员对趋化因子CXCL12及其受体CXCR4和VEGFa及其受体VEGFR1进行了免疫组织化学染色，因为硫酸化的GAG在趋化因子和血管生成因子的结合和信号传导中起着重要作用。如通过共定位测量确定，在整个肿瘤块中，血管生成标记物VEGFa和VEGFR1的存在显着相关，但在接种后28d的肿瘤中，VEGFa和VEGFR1的检测均显着降低。在经过surfen治疗和对照的未治疗肿瘤之间检测VEGFa和VEGFR1的相关性分析表明，治疗与未治疗的肿瘤之间无显着差异。在大量组织评估中，出国看病网研究人员观察到用surfen治疗的肿瘤中CXCL12+和趋化因子受体CXCR4+细胞显着减少与未经处理的对照。与未经治疗的对照组相比，经surfen治疗的肿瘤组织中CXCL12和CXCR4的共定位显着降低。
    　　 无法阻止肿瘤浸润困扰着GBM治疗范例，而传统疗法最终在预后或生存方面均无明显改善。在研究中调查TME特异性CS-GAG在GBM侵袭中的作用以及硫酸化GAG拮抗剂surfen的潜在抗侵袭特性。假设surfen介导的细胞外CS-GAG信号传导阻滞将在体外减少大鼠F98细胞的侵袭并在体内消除肿瘤的进展。surfen治疗可显着减少GBM细胞的增殖和迁移，并抑制肿瘤外硫酸化CS-GAG阻止细胞信号传导，从而阻止肿瘤的侵袭。GBM肿瘤外微环境在硫酸化CS-GAG成分中表现出明显的变化。编码磺基转移酶的N-乙酰半乳糖胺4-硫酸盐6-O-磺基转移酶转录物的发生率升高，该转录物催化将硫酸盐残基添加到4-硫酸化N-乙酰半乳糖胺残基的第六个碳原子上，从而在30星形细胞肿瘤患者。出国看病网研究人员先前还报道了与单硫酸盐和未硫酸盐GAG基质相比，在含3DCS-E的基质中人类U87MGGBM细胞迁移和触觉增强。神经胶质抗原2或CSPG4蛋白聚糖与化学和放射治疗耐药性相关，是GBM患者生存不良的预后指标。这种抗原在GBM患者的46个样本中有31个高表达，在46个样本中的15个中有15个低表达，异质性有限。这项研究还报道了通过CSPG4嵌合抗原受体的T细胞靶向显著减毒GBM神经的生长在体外和体内。这以及其他证据表明，随着肿瘤ECM相关CS-GAG的酶促降解作用增强，化疗效果更好，暗示了CSPG及其相关的CS-GAG在GBM入侵中的致病作用。
    　　 硫酸化GAG拮抗剂surfen于1938年首次被描述为用于人类受试者的胰岛素赋形剂。此后，它已被广泛表征，并证明通过其带正电荷的氨基喹啉部分以电荷密度依赖性的方式与所有硫酸化的GAG结合。surfen介导的肝素硫酸盐与bFGF相互作用的破坏抑制小鼠胚胎干细胞的分化，并通过减弱bFGF信号传导来维持其多能性。但是，尽管有证据表明GBM周围的硫酸化CS-GAG表达增强了，目前尚无任何有关Surfen可能用于阻止肿瘤外硫酸化GAG活性和干肿瘤侵袭的报道。与CS-A和HA基质相比，包含在CS-E的水凝胶基质中封装的人U87MGGBM细胞表现出胶质瘤浸润的标志，例如粘着斑蛋白的迁移和共定位增加。由于这些硫酸化的CS-GAG基质不含粘附肽，因此在这些3D微环境中观察到的增强的GBM细胞入侵不仅是由细胞粘附介导的，而且可能取决于其他机制，例如CS受体结合和增强的细胞触觉感。与人U87MG细胞相似，大鼠F98GBM细胞表现出对富含硫酸化CS-GAG的环境的偏爱。鉴于新蛋白在头和尾部区域中通过多功能结合位点相互作用来调节粘着斑稳定和生长的重要作用，观察到在经surfen处理的F98细胞中纽蛋白的下调证实了缺乏粘着斑形成和运动性。出国看病网研究人员进一步证明surfen显着抑制GBM细胞与细胞外CS-GAG基质的相互作用，从而导致粘着斑复合物形成减少，细胞迁移和侵袭减少。
    　　 CD133已被广泛接受为GSC生物标志物，并且在分化为神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力方面与NSC具有共同点。CD133是高度致癌的GBM相关细胞，与治疗性和低氧抵抗性诱导的GBM侵袭性生长相关。免疫细胞化学染色的结果表明CD133+细胞在大鼠GBMF98细胞培养物和人患者来源的GSC培养物都占优势在体外和在与F98肿瘤诱导的肿瘤诱导后28天的大鼠的脑肿瘤半影体内。观察到在大鼠和人类患者衍生的GSC中，CD133与CSPG在体外的高度共定位和体内肿瘤半影。还检测到对细胞进行surfen处理后，CD133和CSPGs的细胞检测量显着降低，这表明surfen介导的a-CD133和a-CSPG抗原结合的抑制作用，导致检测的总体降低这些测定中的这些生物标志物。尽管对CD133的聚糖组成知之甚少，氯酸钠诱导的CD133表位阻断和抗磺基酪氨酸抗体结合。表明CD133上的聚糖结构可能被硫酸化。表达CD133的GSC的肿瘤形成潜力存在一定程度的争议，AC133+和AC133-GSC能够形成肿瘤。但是，这些发现主要归因于AC133表位的变化，而不是CD133蛋白的丢失，仍被认为是GSC生物标志物的原型，可指示体内GBM的进展。出国看病网研究人员的研究结果表明，surfen介导的CD133和CSPG的阻断可能对减少GBM进程具有重要意义，需要进一步研究。
    　　 GBM细胞在血管和富含GAG的白质物质中迁移的能力类似于NSC。播种在灰质和白质上的人类神经胶质瘤细胞悬浮液表明，胶质瘤细胞与白质束的附着延迟但优先。原代人GBM细胞克服了白质髓磷脂的细胞粘附阻滞属性，优先粘附在这些表面上。因为脑白质由独特的GAG组成，包括未硫酸化的HA以及与CSPG相连的硫酸化CS-GAG，例如Neurocan，versican，大型CS蛋白聚糖pgT1和神经胶质透明质酸结合蛋白，研究了切片培养法中过度硫酸化CS-GAG微环境在促进F98GBM细胞侵袭中的作用。研究表明，底物的刚性，孔径和组成会影响GBM细胞在体外侵袭试验中的迁移速度，胶质瘤周围的GAG浓度升高与细胞粘附和运动性增加有关。与未硫酸化HA基质中的细胞相比，封装在COMP基质中的细胞在6小时内显示出更高的迁移速度，这证实了先前关于COMP基质中迁移和细胞触觉增强的发现。F98细胞在COMP水凝胶封装中的移动速度和距离反映了以前的3D有机型培养系统在出国看病网研究人员实验室之外和出国看病网研究人员的切片培养测定法中观察到的神经胶质瘤细胞的快速迁移。包裹在COMP水凝胶液滴中并在腹侧接种至call体的F98细胞与周围的脑组织相比，侵袭性显着增加，并且与白质束介导的向脑组织切片对侧半球的迁移相比，白质介导的迁移增强F98细胞接种在HA水凝胶小滴内。由于这些测定是在不存在任何灌注流的情况下进行的，因此在这些测定中观察到的细胞粘附和迁移动力学可归因于硫酸化的CS-GAG微环境和下面的底物。
    　　 弥漫性肿瘤浸润与GBM患者的治疗耐药性相关，并且大量研究表明，受体蛋白酪氨酸磷酸酶可调节细胞与其他细胞和ECM组分之间的粘附力，从而促进侵袭。CSPG结合的LAR转录子的过表达和LAR蛋白在CS-A和COMP基质中封装的人U87MG细胞中的稳定表达。硫酸化CS-GAG的独特化学结构促进了它们的多种生物学功能，包括介导细胞表面受体与配体之间的相互作用。先前使用表面等离振子共振和微孔板ELISA的报告表明CSPG受体确实在硫酸化CS-GAG之间表现出改变的结合特异性。结合研究表明，不同的硫酸化CS-GAG可能优先与某些配体和受体相互作用，但是在恶性神经胶质瘤的背景下，它们的交叉反应性和多价相互作用尚需进一步研究。Surfen及其衍生物先前已被证明可拮抗硫酸肝素与蛋白质的相互作用，包括可溶性RAGE与HS的结合。RAGE与CS-E结合，证明抗RAGE抗体可防止肿瘤细胞的肺转移。细胞表面受体NG1和NG3也直接与特定的CS-GAG相互作用，证明CS-E竞争NG1和NG3的结合。NG3的过度表达与其他癌症的预后不良和转移增加有关。用surfen处理F98细胞会显着降低多种CSPG受体蛋白的表达。凝胶结合试验的结果证实了出国看病网研究人员先前的发现，与用surfen处理的对照组相比，从含CS-A和CS-E的水凝胶中分离出的下拉组分中检测到，进一步加强了LAR受体与硫酸化CS-GAG的结合。与CS-A基质相比，COMP中CSPG受体蛋白结合的趋势有所增加，这表明CS-GAG硫酸化的程度确实会影响F98受体的结合。如本文报道的，F98细胞膜受体与不同硫酸化CS-GAG水凝胶结合的明显变化，
    　　 先前已描述了具有类似于surfen的结构和功能属性的各种带正电荷的氨基喹啉与DNA相互作用，并通过在G2相中阻滞细胞周期，抑制微管蛋白聚合，抑制酪氨酸激酶和抑制作用来显示抗癌活性拓扑异构酶。除了与硫酸化的GAG静电结合外，surfen和其他4-氨基喹啉衍生物还与DNA内富含GC的结构域结合。尽管DNA碱基对之间surfen插入的程度仍有待测量，但DNA结合以及随后对细胞内正常转录和翻译活性的抑制作用可能导致F98细胞内观察到的基因转录物和蛋白质表达的广泛下调这项研究。Surfen处理下调了编码CHST11，CHST12和CHST15磺基转移酶的转录本的表达，其翻译产物分别催化CS-A和CS-E的硫酸化。另外，surfen处理48小时导致的显著下调表达LAR-，RAGE-和NG3编码的转录本和总蛋白。特异性改变TME中GAG硫酸化酶和细胞表面受体表达的能力是一种强大的工具，GBM可以通过它调节ECM组成和细胞信号传导，从而进一步促进其侵入性扩散。surfen对这些细胞内和细胞外相互作用的阻断可能对阻止GBM的传播具有潜在的帮助。
    　　 在大多数GBM中，特别是在GSC中，ERK信号转导途径的活性被发现升高。Surfen处理已显示可通过抑制bFGF与硫酸化GAG的结合来防止小鼠胚胎干细胞分化，并且已证明可减弱仓鼠卵巢和小鼠胚胎干细胞中的ERK磷酸化。ERK和Akt激活与GBM的增殖增加，致瘤性，干性和侵袭性增强相关。对GBM细胞的过分处理可显着抑制总Akt和磷酸化的Akt和ERK，这表明硫酸化CS-GAG信号传导的阻断可能会抑制对肿瘤发生，侵袭和GSC增殖重要的细胞内信号传导途径。与非干神经胶质瘤细胞相比，CD133的磷酸化导致GSC中Akt途径的激活。Surfen处理的细胞中观察到的ERK和Akt的总形式和磷酸化形式均减少，这表明CD133连接的信号通路发生了变化，需要进一步研究。体内研究的结果支持体外发现。与对照动物相比，经Surfen处理的动物表现出较小的肿瘤，明显减少了血液积聚和坏死，并且出现了终点症状。尽管surfen治疗在诱导后最初的7d后并未降低总的肿瘤体积，但它对肿瘤形态具有持久的影响，包括在T2直方图中观察到明确的肿瘤边界的出现以及减少的坏死和组织不均匀性。Surfen治疗显着影响GSC的存在以及GSC与硫酸化CSPG的缔合，并且治疗的肿瘤显示出显着降低的血管生成和GBM细胞的侵袭潜能。GBM的病理特征包括假性pseudo状突。在肿瘤块的坏死核心周围，标志性假栅栏与CSPG相关，并且与从surfen处理过的动物获得的组织相比，在H＆E染色组织的对照肿瘤中越来越普遍。这些侵入性前沿不仅显示出CSPG的存在增加，而且与GSC显着相关，在surfen治疗的肿瘤中其外观显着降低。CSPG和GSC在对照肿瘤迁徙前线中的存在和关联的增加进一步证明了TME中CSPG与GSC侵袭之间的关系。
    　　 CSPG及其结构改变导致细胞对生长因子及其相关受体的反应不同，包括介导VEGF结合的能力。GSC分泌VEGFa并在重塑肿瘤块周围的局部脉管系统中发挥积极作用。经表面处理的肿瘤组织显示出降低的VEGFa和CXCL12保留。硫酸化的GAG链可以通过生长因子结合和信号传导来调节细胞的触觉和入侵。除了减少肿瘤组织内CXCL12的沉积外，surfen处理的肿瘤组织中趋化因子受体CXCR4+细胞的存在减少也表明肿瘤浸润的可能性降低。Surfen治疗在急性推注治疗后很长时间也导致了肿瘤块和单个细胞的持久变化。该研究中的所有动物在诱导后第28天都表现出严重症状。然而，与用surfen处理的动物相比，大量未处理的动物需要终点安乐死。surfen作为胰岛素赋形剂在人体中的全身递送是安全的，并且颅内给予surfen治疗不会对周围的脑组织产生负面影响。结果为硫酸盐化的基于GAG的信号传导在促进GBM细胞侵袭方面提供了有力的证据，并有希望在治疗方面阻止这些信号传导方法。最初的研究证明了推注surfen的治疗效果，但未来的实验应结合侵袭动力学评估常规surfen治疗对肿瘤血管生成，血流和坏死变化的影响。要确保surfen到达颅内腔而不会脱离靶标，则需要将其包裹并在适当的载体中递送，这将成为未来表征和生物分布研究的主题。当前的化学和放射疗法在延长GBM患者的存活方面无效。出国看病网研究人员的临床前啮齿动物研究详细介绍了surfen的抗侵袭特性，并强调了其与细胞毒性抗癌疗法结合以增强临床效果的潜在用途。CS-聚糖和ECM成分在促进GBM侵入的作用的进一步鉴定将推动出国看病网研究人员的神经胶质瘤的认识，并有助于新的治疗干预措施的设计，这种顽固性疾病。
 
出国看病概况

海外医疗在国外发展较为成熟，比如在欧美等医疗技术发达国家，很多医院都设有国际病人办公室并配备多语种医学专业翻译人员，就医流程和模式都已相对成熟。在国内，海外医疗虽然还属于新兴行业，但发展势头迅猛，发展潜力巨大，市场前景广阔。
　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
出国看病适应症
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