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人胶质母细胞瘤临床前模型
  • 　　尽管在血液系统恶性肿瘤的治疗中取得了显著成功，但实体瘤的CART细胞疗法却步履维艰，这在很大程度上是由于局部免疫抑制以及长期刺激导致T细胞功能障碍和衰竭所致。胶质瘤和其他癌症可以阻碍CART细胞的一种机制是通过抑制性配体的表面表达，例如程序性细胞死亡配体1。使用CRIPSR-Cas9系统，出国看病网研究人员通过内源性T细胞受体，B-2微球蛋白和PD-1的多重基因破坏，创建了对PD-1抑制具有抗性的通用CART细胞。三联基因编辑的CART细胞在临床前神经胶质瘤模型中显示出增强的活性。脑内注射后颅内肿瘤小鼠的存活时间延长，但静脉内注射未达到。Cas9基因编辑不仅提供同种异体通用供体细胞的潜在来源，而且还可以同时破坏检查点信号传导，否则会阻碍最大的抗肿瘤功能。
    　　 胶质母细胞瘤是最常见的原发性恶性脑肿瘤，也是最具侵略性的。尽管采用了标准的多模式治疗方法，但仍有超过70％的GBM患者在诊断后2年内死亡。T细胞免疫疗法代表了传统疗法的一种新兴替代方法，并且已被证明可以成功治疗脑部实体瘤，即使在大体积和浸润性疾病的情况下。嵌合抗原受体是最有前途的T细胞平台之一，它在2017年获得美国食品药品监督管理局的首批批准，彻底改变了血液系统恶性肿瘤的治疗和管理。然而，迄今为止，CART细胞的功效尚未成功转化为GBM的设置。对此的一种解释包括在GBM患者中观察到的深刻的局部和全身免疫抑制作用。此外，自体CART细胞的生产仍然昂贵且费时，并且在制造GBM患者的T细胞时控制其疾病进展可能具有挑战性。为此，对局部免疫抑制有抗性的现成的CART细胞可能具有有意义的益处。
    　　 在针对GBM患者中靶向表皮生长因子受体肿瘤特异性突变的静脉CART细胞的临床研究中，观察到EGFRvIIICART细胞定位于脑内肿瘤并成功降低了表达EGFRvIII的癌症细胞。但是，这也与治疗的神经胶质瘤内程序性细胞死亡配体1表达的上调相关，最终导致免疫抑制，CART细胞功能障碍和随后的疾病进展。此外，在17名受试者中有4名因疾病进展迅速而未接受CART细胞治疗，这突出显示了“现成”的即用型产品的潜在益处，这些产品无需定制即可生产。CRIPSR-Cas9技术已经成为一种简单有效的基因编辑CARs方法，有望解决这些治疗障碍。这包括通过靶向破坏内源性T细胞受体和B-2微球蛋白而设计的通用CART细胞，这些材料具有降低潜在的引发移植物抗宿主病和引发供体T细胞排斥的潜力。CRISPR-Cas9的使用还为修饰GBM肿瘤微环境中抑制T细胞功能的其他相关基因的表达提供了机会。在当前的研究中，应用了CRISPR-Cas9来产生TCR和B2M缺失的同种异体EGFRvIIICART细胞产物。还同时破坏了内源性PD-1，从而避免了在临床试验中观察到的神经胶质瘤治疗后PD-L1上调的潜在影响。在这里证明TRAC，B2M和PDCD1的多重基因编辑可以在CAR转导之前在原代人T细胞中有效地进行。此外，出国看病网研究人员观察到基因编辑EGFRvIII的CART细胞的抗肿瘤效力是通过在GBM的临床前模型中的PD-1的靶向破坏增强。
    　　 在目前的研究中，采用基于包含4-1BB和CD3胞内信号传导结构域的第二代主链中的EGFRvIII的CART细胞构建体，但是这一次克隆到AAV6载体骨架而不是慢病毒载体，前者允许将CAR序列整合到特定基因座中，而不是依赖于随机基因组整合。简而言之，多重基因编辑的策略包括体外刺激原代人T细胞，然后分别用Cas9核糖核蛋白进行电穿孔，随后进行腺相关病毒介导的CAR转导。使用RNP电的CRISPR-Cas9基因编辑TRAC和B2M基因位点是有效的，产生大于80％的人群双敲除通过流式细胞术。在一个单独的实验组中，除了TRAC和B2M之外，还对RNP电穿孔进行了多重处理，以生成也针对PDCD1编辑的T细胞。其次AAV6转导，其导致CART细胞与内源性或删除PD-1。用表达EGFRvIII的神经胶质瘤刺激后，证明了对照和CART-EGFRvIII细胞和B2M通过流式细胞仪检测表面PD-1呈阳性。与此相反，PD-1并没有CART-EGFRvIIIΔPD-1细胞的表面上检测到，确认有效的敲除在表面蛋白表达在整个人口。
    　　 接下来，试图评估常用脑肿瘤细胞系上PD-L1表达的水平。重要的是，PD-L1已显示出在GBM的表面上经常发现，并在用EGFRvIIICART细胞治疗的患者中上调。为了证明概念验证，出国看病网研究人员选择了特征明确的EGFRvIII阳性神经胶质瘤细胞系U87vIII作为出国看病网研究人员研究的典型靶细胞。与它的亲本系U87和另一个常用的神经胶质瘤细胞系U251相比，证明了U87vIII自然表达PD-L1。然而，通过流式细胞术分析，这似乎相对于U87和U251有所降低。然后进行评估PDCD1基因座的CRISPR-Cas9基因编辑对EGFRvIII特异的CART细胞的影响。已知CART细胞以各种分化状态存在，其分化程度较低的干细胞记忆或中央记忆亚型优于分化良好的效应记忆细胞，特别是在诸如扩张等特性方面，持久性和自我更新的能力。而且，PD-1的丢失已显示出会在其他设置下改变记忆T细胞的内容和产生。在基线时既CART-EGFRvIII的和CART-EGFRvIIIΔPD-1表现出与对照相比，T细胞也一直基因编辑类似的T细胞分化图案TRAC和B2M，除了经受与AAV6。相比之下，长期刺激CART-EGFRvIIIΔPD-1导致TCM选择性富集，而表达天然PD-1的CART-EGFRvIII细胞似乎在分化更强的TEM隔室中富集。
    　　 接下来，将注意力转向基因编辑的CART细胞在介导体外抗肿瘤免疫反应中的功能能力。在使用原代人T细胞的实验中，与表达内源性CART细胞相比，与表达EGFRvIII的神经胶质瘤培养时，发现CART-EGFRvIIIΔPD-1细胞产生大量的Th1促炎细胞因子。还比较每种构建体启动和维持T细胞增殖的能力。在用照射的靶细胞连续刺激后，通过EGFRvIII反复进行抗原刺激可维持CART-EGFRvIII细胞和CART-EGFRvIIIΔPD-1细胞增殖超过1个月。然后将基于阻抗的微电子平台用于捕获抗肿瘤细胞毒性的实时动力学，如通过靶细胞指数所测量的。使用该系统，出国看病网研究人员发现，CART-EGFRvIIIΔPD-1细胞显著更有效对抗U87vIII比那些表达PD-1，但是这是在延长的时间周期。
    　　 基于体外观察，继续评估了CART-EGFRvIIIΔPD-1在人脑胶质瘤动物模型中的功能。首先植入的肿瘤立体定向援助进入NSG的大脑小鼠。随后通过尾静脉静脉内注入对照，CART-EGFRvIII或CART-EGFRvIIIΔPD-1细胞。结果未证明与对照组相比，全身用EGFRvIII特异性CART细胞治疗的小鼠的存活时间显着延长。因为施用CART细胞时颅内-特别入脑室系统在脑肿瘤中的设定印象深刻的结果已经观察到，出国看病网研究人员推断这可能也代表用于递送的理想路线CART-EGFRvIIIΔPD-1个单元格。事实上以下脑室输注中，与导致显著延长生存小鼠与EGFRvIII的表达神经胶质瘤，包括在所选择的小鼠耐用，完全固化。没有长期幸存者出现异基因GVHD的临床体征。在这项研究中，试图将CRISPR-Cas9技术应用于EGFRvIIICART细胞，以解决现存的障碍，以实现GBM患者的最大治疗效果。具体而言，创建了具有针对性的PD-1缺失的EGFRvIII特异性CART细胞，以使其对通过该途径的免疫检查点信号转导具有抗性。此外，出国看病网研究人员使用这种方法同时破坏与内源性T细胞受体和B-2微球蛋白的基因相对应的基因座。使用几种临床前建模系统来测试出国看病网研究人员的假设，包括体外和体内平台。这些包括表型和功能测定。测试针对被转导表达EGFRvIII的人神经胶质瘤细胞系靶标的直接抗肿瘤活性。在这份手稿中如在试验环境中所使用的，使用来自单个健康供体批量制剂的T细胞。基因操作后未纯化细胞。从与体内使用的相同的T细胞扩增中分离出体外使用的CART细胞。实验进行了多次并显示了代表性数据。
    　　 免疫受损的NSG小鼠最初是从杰克逊实验室购买的，并根据机构动物护理和使用委员会批准的协议在无病原体的条件下进行繁殖。人神经胶质瘤细胞系U87和U251从美国典型培养物保藏中心获得，并在供应商规定的条件下培养。通过慢病毒转导产生U87vIII细胞系。合成CART细胞构建体，并将其克隆到AAV6质粒主链中。所有构建体均包括一个串联的CD8跨膜结构域以及一个细胞内4-1BB共刺激和CD3信号结构域。使用标准技术进行基因编辑和细胞制备，详情见其他地方。简而言之将人外周血单核细胞融化，并在含有人血清，IL-2和IL-7的T细胞培养基中用偶联的CD3/CD28激动剂激活T细胞3天。激活后，T细胞用Cas9蛋白和靶向TRAC和B2M基因座或TRAC，B2M和PDCD1的sgRNA电穿孔位点，然后用含有供体模板DNA的重组AAV6载体转导，该供体模板DNA用于插入EGFRvIIICAR构建体，典型转导效率为35％。电穿孔和转导后，将CART细胞在含有人血清，IL-2和IL-7的T细胞培养基中扩增7天。随后在测定之前将这些细胞转移到液氮中储存。
    　　 有关活性，增殖和细胞毒性的T细胞测定已在其他地方进行了详细介绍。简而言之，在共培养实验中，将T细胞与辐照过的U87vIII靶细胞以1：1的E：T孵育一段所述的时间。还使用Luminex阵列根据制造商的说明分析细胞的无细胞上清液的细胞因子表达。表面标记的表达在基线或共培养一段时间后获取，然后进行流式细胞仪分析。使用以下用于流式细胞术的抗体克隆对抗原染色：CCR7;CD45RO，PD-1。对于增殖测定，用辐照的靶细胞以1：1的E：T刺激细胞。每7天对细胞计数，并以7天的间隔再次铺板。在实验中，针对U87vIII测量实时细胞毒性时，根据制造商的说明，使用xCELLigenceRTCASP仪器记录了细胞指数，作为细胞阻抗的量度。可以使用以下公式从这些数据中计算出特异性裂解百分比：％=/UTD的细胞指数）×100。在对数生长期收获肿瘤细胞，计数并装入带有25号针头的50uL注射器中。将小鼠麻醉并置于立体定向框架中以协助肿瘤植入。将肿瘤细胞植入距前颅骨右侧2mm处，距颅骨表面4mm的深度，总体积为5uL。然后通过尾静脉输注以总体积为100uL全身性注入效应细胞，或以总体积为30uL进行脑室内给药。脑室内分娩在距颅骨表面3mm处的前reg左侧2mm处，在前0.3前方0.3mm处。将效应细胞群体标准化为包含1×106所有实验每次输注一次细胞。腹腔内荧光素注射后，使用AmiHT光学成像系统通过生物发光发射评估肿瘤随时间的进展。存活率是由盲人的技术人员在预定的人道终点发现已经死亡或以其他方式杀死的小鼠确定的。
    　　 CARs已在GBM患者的临床试验中显示出早期潜力。然而治疗与胶质瘤组织中PD-L1的明显上调有关，这可能会对抗肿瘤免疫产生深远的反作用。先前的研究表明，CRISPR-Cas9技术可用于破坏人类原代T细胞中PD-1的信号传导，并通过同时在TRAC和B2M位点进行编辑来创建潜在的“现成的”同种异体CART细胞产物。在当前的研究中已经应用这些方法来产生针对PD-L1检查点抑制的抗EGFRvIII的通用CART细胞。另外，已经证明了这些CART细胞在人GBM的鼠模型中的功效。出国看病网研究人员的发现也有助于获得越来越多的数据，表明给药途径可能在实现针对脑部肿瘤的最佳CART细胞活性方面发挥关键作用。
    　　 最近的工作强调了通过PD-1/PD-L1调节免疫检查点是GBM中有希望的治疗靶点。除了基因编辑技术外，针对该途径的一种流行方法是使用单克隆抗体的免疫检查点封锁。尽管ICB可能潜在地复发胶质瘤受益的患者某些子集，PD-1的随机III期研究/PD-L1轴线抑制为GBM没有证明延长总体存活。对此的可能解释包括伴随的化学疗法诱导的淋巴细胞减少以及与血脑屏障相关的结构考虑，这可能会阻止全身施用的抗体与浸润性T细胞或脑内肿瘤组织之间的相互作用。不像抗体疗法，CART细胞具有利用深刻淋巴细胞减少来提高过继转移入替莫唑胺处理，lymphodepleted主机抗肿瘤活性的能力。已经提出了工程化CART细胞以在靶向位点分泌PD-1阻断抗体片段的方法。但是，也有人提出，在这些情况下，ICB可以不加选择地起作用，并且可能由于对抑制性PD-1+调节性T细胞亚群的意外影响而导致疾病的过度进展。在研究中发现CART细胞中PD-1的缺失对功效的影响很小，在CART细胞中只有CART细胞具有直接的细胞毒性潜力。这些数据共同表明，GBM将需要其他技术来增强T细胞免疫的治疗效果。局部免疫疗法是中枢神经系统肿瘤的一种特别有吸引力的分娩途径，据认为该肿瘤在某种程度上通过专门的血脑屏障与外周循环隔离。确实研究支持将CART细胞直接输注到脑室系统以获得最佳抗肿瘤活性可能是必要的，在一种情况下，需要这种方法来介导大体积，多灶性颅内疾病的消退。脑室内向脑脊液腔内给药的好处包括增加进入整个中枢神经系统部位的能力，以及达到足够的效应子与靶标比的能力，这代表了细胞治疗实体瘤的持续挑战。
    　　 在这项研究中，出国看病网研究人员将CRISPR-Cas9作为一种工具来实现人类CART细胞的多重基因编辑。破坏T细胞中基因表达的其他方法包括使用锌指核酸酶和TAL效应子核酸酶，尽管这些技术的使用在同时靶向多个基因方面受到相对限制。研究表明CRISPR也可用于实现伴随的基因整合和缺失。这方面的一个例子是先前将CD19CAR构建体直接递送至TRAC位点的报道，该构建体也将转基因置于内源性启动子的控制之下。重要的是凭借这些潜在的机制，CRISPR具有一定的脱靶诱变风险。现在已经开展了一些临床研究来评估这种特定方法在原代人T细胞中的安全性；这些试验的数据尚未报道。当前，缺乏精确再现在临床环境中会遇到的完整免疫力和抗原表达的动物模型。出国看病网研究人员选择了NSG小鼠模型来测试EGFRvIIICART细胞，因为它可以评估可翻译的人类细胞疗法以及人类神经胶质瘤细胞系的使用。这种方法的一个缺点是它不适用于试图直接确定TCR和B2M缺失分别对GVHD或供体T细胞排斥的功效的实验。最终，临床试验可能是确定这些细胞产品在人体中安全性的唯一合适方法。据出国看病网研究人员所知，这是首次在实体瘤模型中测试的CART细胞中TRAC，B2M和PDCD1三重缺失的报道。用CART-EGFRvIIIΔPD-1获得的结果直接解决了出国看病网研究人员在针对EGFRvIII的CAR的临床试验中注意到的缺点，因此有必要对GBM患者进行进一步的研究。
 
出国看病概况

海外医疗在国外发展较为成熟，比如在欧美等医疗技术发达国家，很多医院都设有国际病人办公室并配备多语种医学专业翻译人员，就医流程和模式都已相对成熟。在国内，海外医疗虽然还属于新兴行业，但发展势头迅猛，发展潜力巨大，市场前景广阔。
　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
出国看病适应症
靶向药物
 

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