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小胶质细胞的侵染性
  • 　　大鼠是毒理学和药理学研究的主要模型生物，也是许多行为，免疫学和肿瘤生物学研究的首选生物。尽管小鼠模型很受欢迎，但将大鼠作为模型生物仍然非常稳定，与小鼠相当，并且比任何其他模型生物都要高几倍。选择人类和小鼠作为ENCODE财团的两种模式生物，集中精力在这两个物种上。但是，在其他模型生物中，尤其是大鼠中，也正在生成有价值的转录组学数据。要充分利用此类数据来阐明基因调控机制，需要将转录组数据与实验确定的顺式调控区域进行匹配，可以通过多种方法进行鉴定，包括鉴定DNaseI-。带有DNase-seq的超敏。小胶质细胞是驻留在大脑中的先天免疫系统细胞，在健康中发挥有益作用，在脑病理中起有害作用。正如PíodelRío-Hortega最初对它们的描述一样，这些细胞被发现有助于塑造大脑的可塑性，发育和病理机制，包括在突触剥离和轴突中起作用。小胶质细胞的活性在年轻大脑的早期重新布线中起着重要作用。源自卵黄袋的小胶质细胞与外周巨噬细胞的个体发育不同，并显示出与其他巨噬细胞群体不同的转录组特征。实验和临床证据表明，恶性神经胶质瘤中小胶质细胞和周围巨噬细胞的积累是常见的致命原发性脑肿瘤。胶质瘤分泌因子可诱导小胶质细胞的侵袭性和免疫抑制活化，其中这些细胞可促进肿瘤生长。
    　　 多项研究已经证明了胶质瘤相关的小胶质细胞体外和体内极化的分子事件。最近，研究人员对神经胶质瘤诱导的小胶质细胞转录组的变化进行了表征。然而，神经胶质瘤在大鼠小胶质细胞中诱导的转录变化的基因调控机制尚不清楚，至少部分原因是缺乏实验确定的顺式调控区域。已经在小鼠中彻底研究了外周巨噬细胞中活性调节区的景观及其与基因表达的关系。与当前工作直接相对应的是，ATAC-seq已在小鼠的肿瘤相关巨噬细胞和小胶质细胞中研究了开放的染色质区域。在神经胶质瘤研究中，大鼠表现出优于小鼠的优势，允许实验程序和干预措施受到小鼠大脑较小的大小以及跨物种比较的限制。各种大脑病理的大鼠模型显示出与人类病理的良好临床相关性。例如，用Affymetrix芯片对大鼠C6胶质瘤进行转录组分析表明，基因表达谱与胶质母细胞瘤的间充质亚型相似。另外，C6神经胶质瘤的组织病理学特征，例如假性伞状坏死，新血管生成和高含量的癌症干细胞的存在，与人类神经胶质瘤非常相似。此外，大鼠神经胶质瘤中的免疫浸润与人类胶质母细胞瘤更相似，小胶质细胞和髓样来源的抑制细胞普遍存在，而在小鼠神经胶质瘤中则主要是外周巨噬细胞。对于神经病理条件下的小胶质细胞，研究人员已经注意到，中风的大鼠模型比鼠模型更类似于人类病理。大鼠和小鼠中风后的免疫浸润存在差异，包括小鼠中骨髓巨噬细胞的大量浸润。
    　　 在这里，出国看病网研究人员报告了在对照条件下以及在使用神经胶质瘤条件培养基诱导前侵性极化或脂多糖治疗后6小时内，原代大鼠小胶质细胞中DNaseI超敏性开放染色质区域的鉴定和分析。从1日龄的Wistar大鼠幼崽制备小胶质细胞培养物。脑皮质机械解离并通过胰蛋白酶消化，并在3×10的密度接种细胞5 个细胞每平方厘米于聚升在Dulbecco改良的Eagle培养基。将细胞在5％CO2的潮湿气氛中保持在37摄氏度。3天后更换培养基，然后每周更换两次。2周后，通过轻轻摇动并离心从融合培养物中回收小胶质细胞。通过锥虫蓝排除法测定细胞活力。将细胞悬浮在培养基中，以2–3×105细胞每平方厘米的密度接种到培养皿中，以使细胞在悬浮液中生长，并在实验前孵育48小时。用来自肠炎沙门氏菌的100ng每毫升LPS刺激小胶质细胞或大鼠C6胶质瘤培养物的条件培养基。C6胶质瘤细胞在含有10％FBS和抗生素的DMEM中生长。每3-4天更换一次培养基。将1×106C6细胞接种到100-毫米培养皿中后，将标准培养基换成8毫升含Glutamax的10％FBS高葡萄糖DMEM，并在24小时后从85％到90％的融合培养物中收获条件培养基，并于300g，持续10分钟，以去除细胞碎片。
    　　 鉴定了由GCM或LPS在大鼠小胶质细胞中诱导的基因，以及特定功能表型的获得。在当前的研究中，使用相同的实验设置，在刺激后的相同时间点，收集了材料以确定开放的染色质模式。通过诱导相应的极化标志物证实了侵入性和炎性极化。对于每种情况构建了DNaseI-seq库的两个副本：UNTR，GCM处理和LPS处理；从独立的小胶质细胞培养物中获得重复，每种培养物源自10至15只大鼠幼崽。对于每个重复，使用Hotspot程序独立确定了开放的染色质区域。为了以统计可信度定量分析处理引起的开放度变化，需要一个通用的区域参考集，以便随后在所有重复项和条件下应用。为了构造该集合，选择了在至少一个条件下可重复打开的所有片段的并集。从技术上讲，该组是由第一交叉热点区域从两个复制对于给定的条件，然后通过从整个全部条件。这种结合产生了参考的126,640个开放染色质区域。
    　　 使用区域坐标的参考集，可以定量地比较它们在重复项和条件下的开放度。区域的开放度在相同条件下的复制品之间具有很高的可复制性，而在不同条件下则存在显着差异，LPS的变化大于与未治疗的情况相比，GCM。原始序列文件和处理后的数据已保存在NCBI的GeneExpressionOmnibus中，可通过GEO系列登录号GSE123328访问。为了确定开放染色质区域的核心特征，对单个重复的热点区域进行了多相交分析。使用此结果，很容易过滤仅在一个条件，两个条件或三个条件下可重复打开的基因组序列段。在所有三个条件下均开放的节段的结合可被视为大鼠小胶质细胞的核心开放染色质曲线。此核心的累积大小为27.7MB，相当于出国看病网研究人员127K开放染色质区域的参考集中总碱基对的45％。
    　　 为了直接比较老鼠和老鼠的染色质开放态，出国看病网研究人员将出国看病网研究人员的参考区域通过liftOver转换为老鼠，并将其与已发表研究的ATAC-seq数据进行比较。结果表明研究中检测到的大鼠开放染色质区域与小鼠小胶质细胞的开放染色质景观相当相似。老鼠与老鼠之间的相似性在老鼠的体外和离体区域是可比的，而在老鼠核心的开放染色质区域则更大。但是，当比较核心区域和所有区域与39个以太坊哺乳动物的受约束元素进行平行比较时，相交处的大小分别为2.97MB和5.8MB，分别相当于核心区域的10.72％和所有区域的9.34％，表明岩心内部和外部的深度保护水平相似。将每个区域映射到其最近的基因。因此，将127K区域定位到19,359个基因，其中受LPS显着调控的12,357个区域被映射至6,755个基因，而受GCM显着调控的2,303个区域被映射至1,682个基因。受两种处理影响的802个区域被定位到689个基因。它们与每个分析特征的分数重叠，在三种治疗条件中的每种条件下的开放度值，在每种条件下的FDR分数，它们的最近基因以及相应的已发表微阵列表达值。比较了整个基因组和基因相关基因组特征的开放染色质区域中碱基对的分布。碱基对在开放染色质区域的分布通常遵循基因组中所有碱基的分布，大多数开放染色质位于内含子，远端区域，区域上游10kb，区域下游10kb。两种分布显着不同，开放染色质的碱基在所有基因特征中都过分表达，在启动子中表现最强，其次是下游10kb区域，然后是内含子，而在远端区域中代表性不足。在国土安全部地区中，9.2％跨越外显子-内含子边界。出国看病网研究人员询问在用GCM或LPS刺激后，开放染色质区域的分布是否显示出显着变化的开放度，是否与所有开放染色质区域的分布相同。GCM和LPS调节区域的分布均不同于所有开放染色质区域的分布。在启动子中和下游10kb的区域中，通过任一种处理调节的开放染色质区域均不足以代表，而在远端区域中则过高。最后，相对于所分析的特征，由GCM和LPS处理调节的区域表现出明显的定位偏好。GCM调控区域的碱基对更常位于远端区域，而LPS调控区域的碱基对更常位于内含子和下游10kb区域。
    　　 染色质开放性的变化是按基因聚集的，这是定位到特定基因的所有区域上任一处理的平均Log2FC值。当这些值在代表过多的KEGG途径的图表中显示时，很明显两种处理都影响这些途径中大部分基因的开放性，向上的模式两种疗法的下调相似，但有一些明显的例外。这些异常在与神经元分化和功能有关的两种途径中更为常见，即轴突引导和谷氨酸能突触途径，而不是其余已检查的途径，例如癌症中的途径。具体而言，在轴突导向通路，7个基因，NTN1和DCC，PTPN11，Robo1，Robo2，Rac1和BMPR1B，显示出在相反方向上以下两种治疗在其聚集的开放性变化。在谷氨酸能突触途径中，三个基因Kcnj3，Grm1和Grm3，显示在GCM和LPS处理后，其聚集的开放度向相反方向变化。两种处理均使该途径中的大多数基因的开放性下调。出国看病网研究人员之前曾发表过在相同实验设置下获得的微阵列基因表达数据。利用Affymetrix微阵列技术，出国看病网研究人员可靠地测量了8,667个基因的绝对表达，其中7,632个基因被定位到开放的染色质区域。因此，在当前工作中映射到开放染色质区域的19,359个基因中，以前的微阵列实验中未检测到19,359–7,632=11,727个基因，其中2,989个基因在微阵列上有代表，但不能以微阵列技术无法可靠检测到的低水平表达，而其余8,738个基因未在微阵列上显示。与FANTOM5表达数据的比较证实了与检测到的基因相比，未检测到的基因的表达较低。
    　　 试图研究检测到的和未检测到的基因的染色质开放度或变异之间是否存在差异。出国看病网研究人员汇总了映射到特定基因的所有区域的每个基因的开放度及其log2变化。检测到的基因组与其余基因之间的开放性存在明显差异。检测到的基因的聚集开放度高于未检测到的基因。但是，在检测到的基因组内，发现映射到该基因的所有区域的聚合开放度与其绝对表达等级之间几乎没有或没有依赖性，这由检测到的基因的平坦移动中位数图表示，而只有40％的未检测到的情况如此基因。
    　　 出国看病网研究人员使用希尔伯特图来可视化一组127K开放染色质区域的基因组定位以及在小胶质细胞中检测到有转录活性的8,667个基因或全部大鼠基因。大多数检测到的基因位于包含开放染色质区域的染色体片段内，而许多未检测到的基因位于无开放染色质区域的染色体片段内。先前在人类和小鼠中进行的研究表明，启动子处的开放染色质峰的形状与基因的表达特异性之间存在相关性。根据一组小鼠原代细胞的表达特异性将基因分层，分为三个表达特异性区：高，中和低。注意，这种高特异性可以针对任何细胞类型，而不必是小胶质细胞。分层后，针对检测到的基因和未检测到的基因分别执行，比较了基因起始位点附近平均DNaseI切割图的形状。观察到了基因起始位点周围的平均DNaseI切割图谱形状的差异，高特异性基因呈现最高峰，低特异性基因呈现最低峰和较宽峰。这些差异很明显，因为它们很显着p每种培养条件和一对特异性箱。对于未检测到的基因，特异性区间之间的差异较小。CpG和非CpG启动子在检测到的基因中观察到的差异相似。下的每个培养条件，低特异性组中的基因表现出在大鼠小胶质细胞的最高平均表达，而高特异性组中的基因表现出最低表达。但是，一些高特异性基因在小胶质细胞中高表达，在LPS处理后，它们在最高表达区中的比例增加。从功能上讲，低特异性组在管家基因中代表过多。
    　　 最后，为了确定LPS刺激的和GCM刺激的小胶质细胞之间的潜在主要差异，出国看病网研究人员决定检查映射到免疫检查点基因的单个区域的开放性变化。开放染色质区域的开放度变化模式，开放度显着改变，经过任一处理，这些处理均映射到免疫检查点基因，聚类以揭示相似性。使用了来自该主题的两个最新评论中的免疫检查点蛋白的三个列表，该评论描述了涉及向T细胞呈递抗原的蛋白或参与特定于小胶质细胞免疫检查点机制下或者生理或病理情况。从这些数据可以得出一些有用的观察结果：开放模式在映射到不同基因的区域之间共享；映射到同一基因的单个区域显示出不同的开放度变化模式；GCM治疗通常会增加涉及抗原呈递的几个基因的开放性和在生理条件下在小胶质细胞中运作的免疫检查点基因，映射到Ptprc和Mef2c的几个区域的开放度在GCM处理后特异性增加;仅LPS和不GCM诱导免疫检查点基因在病理条件下。
    　　 大鼠小胶质细胞具有12.7万个开放的染色质区域，其中2％和10％的GCM或LPS处理后显示开放度的变化。研究了脂多糖的巨噬细胞激活，观察到启动子的开放性在这种处理后和GCM刺激后基本上保持不变。有趣的是，LPS诱导了开放性的变化，优先选择内含子或位于转录末端位点下游10kb以内的区域。这些发现与最近的染色质蛋白质组学研究结果一致，该研究确定了参与炎症基因表达的内含子增强子的亚群。相反，GCM处理优先诱导远离基因主体的染色质开放区域的开放性变化。如前所述，出国看病网研究人员观察到附近开放的染色质区域的存在与基因表达的事实之间存在明显的依赖性。虽然记录了染色质开放性广泛而复杂的变化，有一个基因及其表达靠近打开的染色质区域的聚集开放之间没有直接的关系，用最低的开放基因的异常行列，始终与需要一个开放的发起人。证明了巨噬细胞对激活的转录反应是在广泛可获得的染色质的背景下调节的，但它们与涉及核受体的其他一些系统的结果形成了对比。染色质开放性和基因表达之间的简单依赖可能不会发生。相反，染色质开放度反映了单个开放染色质区域的变化状态，这以不仅仅与区域开放度成正比的方式影响基因表达。
    　　 出国看病网研究人员鉴定了许多包含开放染色质区域的lincRNA基因，包括在治疗后受到调节的区域，例如Myc-Pvt1基因座。在出国看病网研究人员先前的转录组学研究中，证明了LPS处理而非GCM处理可显着增加分配给GO术语免疫应答和防御应答的基因的表达。这些发现被出国看病网研究人员当前关于开放染色质区域的结果所证实，因为相同的两个GO类别在定位到响应LPS的开放性显着变化的区域的基因中被过度代表，但没有显示因应GCM而改变开放度。为了进一步表征LPS和GCM小胶质细胞之间的差异，详细检查了涉及免疫检查点机制的基因的染色质开放性变化模式。GCM增加了已知在生理条件下在小胶质细胞中运作或参与抗原呈递的免疫检查点基因的开放性，而只有LPS诱导了已知在体内运行的免疫检查点基因的开放性变化。病理条件下的小胶质细胞。
    　　 两种治疗差异影响功能性KEGG通路内基因附近区域的开放性，这些通路与小胶质细胞和神经元之间的相互作用以及小胶质细胞的免疫功能有关。小胶质细胞接触神经突触的突触和港湾受体，包括谷氨酸。响应GCM或LPS刺激，小胶质细胞在染色质开放水平上调节两个基因，这些基因编码谷氨酸能突触机器的成分，即Grm1和Grm3丙氨酸谷氨酸受体，两者均在小胶质细胞上表达。对于TLR信号转导和轴突引导的功能途径，在GCM和LPS组之间的开放性变化模式上存在最大差异，这表明小胶质细胞中的这两种途径被神经胶质瘤“劫持”在小胶质细胞的侵入性极化期间。TLR通路在小胶质细胞与神经胶质瘤相互作用中的重要性已得到充分确立。在该途径中的差异调控基因中，已知Ccl5会促进小胶质细胞的迁移。Chuk编码IKK复合物中的一种成分，该成分对小胶质细胞中的NFKB有负调节作用。
    　　 虽然已知小胶质细胞可以影响轴突的导向，但据推测它们是通过表达导向提示并作用于细胞外基质来实现的。响应刺激小胶质细胞在染色质开放水平上调节许多基因，这些基因编码参与轴突引导的蛋白质。特别是，培养的小胶质细胞不仅调节编码轴突引导线索的基因的染色质开放性，而且还调节轴索侧先前描述的其受体的基因，包括Dcc，Robo和Bmpr1b，以及它们的下游效应子，包括Ptpn11和Rac1，其中Bmpr1b先前显示在小胶质细胞上表达。因此，动态的染色质开放数据表明，小胶质细胞调节基因，这些基因编码由不断增长的轴突使用的引导机制的组成部分。推测这种机制由小胶质细胞表达，并用于导航其动态突起和小胶质细胞运动。在体内，小胶质细胞形成可移动的突起物，这些突起物连续扫描神经纤维，生长，分支和收缩。此外，突起形成的过程与小胶质细胞在发育过程中侵入皮层时的运动能力密切相关，这就是所谓的盐化迁移模式，其中小胶质细胞反复“发出一个或一个”。多个过程，并在其中一个突起的方向上移动它们的躯体，而使其他突起缩回”。胶质瘤分泌因子在体内刺激小胶质细胞会引起深刻的形态学变化，确定为类eb骨形状并增加活动性。两种治疗差异影响基因编码轴突指导途径，TLR途径和小胶质细胞迁移之间的分子联系。Tlr7以Rac1为效应子来调节小胶质细胞趋化性。在小胶质细胞极化的情况下，Rac1也被表征为Tlr4靶标。因此，出国看病网研究人员的DNaseI-seq数据反映了正常大脑中小胶质细胞的多方面功能，并提示神经胶质瘤如何重新利用这些程序，使小胶质细胞支持侵袭性神经胶质瘤的生长。
 
出国看病概况

海外医疗在国外发展较为成熟，比如在欧美等医疗技术发达国家，很多医院都设有国际病人办公室并配备多语种医学专业翻译人员，就医流程和模式都已相对成熟。在国内，海外医疗虽然还属于新兴行业，但发展势头迅猛，发展潜力巨大，市场前景广阔。
　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
出国看病适应症
靶向药物
 

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