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星形胶质细胞培养模型
  • 　　由于在培养中分离了这些细胞，因此促进了星形胶质细胞知识的许多重要进步。原代星形胶质细胞培养能够在基础和神经毒性条件下研究这些细胞。尽管该模型可能受到孤立系统的限制，但最近已证明在标准方案下，与新鲜分离的星形胶质细胞相比，它具有相似的基因表达特征。星形胶质细胞培养是研究在良好控制条件下的机械特征的有效工具，例如钙信号传导，神经胶质递质的释放和摄取以及形态和生化变化。该模型也可能有助于开发用于神经退行性疾病的新药。即使存在这些优点，从时间消耗和高维护成本方面来说，原代星形胶质细胞培养物的分离也是费力的过程。由于星形胶质细胞是高度异质的细胞，它产生可变的结果，因此很难在不同研究组之间比较结果。一种替代方法是使用细胞系，例如C6胶质瘤细胞，这是一种非常常用的模型。这些细胞是从大鼠脑部肿瘤中分离出来的，由于某些星形胶质细胞标记物的表达增加，在高传代中被用作星形胶质细胞样细胞系。GFAP），S100B，谷氨酰胺合成酶和谷氨酸转运蛋白。在培养物中研究星形胶质细胞的另一个模型是永生化的星形胶质细胞，具有较高增殖率的遗传转化细胞。这些细胞具有源自原代星形胶质细胞培养而不是肿瘤的优势。与源自克隆的原代星形胶质细胞培养相比，两种转化细胞均可以提供更均一的特征。此外，一旦可以储存和解冻，就比原始文化更快更易于操作。
    　　 尽管有这些设施，但由于它们的神经胶质瘤特征和与原代培养物的某些不同特征，在细胞系中的使用仍受到文献质疑，这质疑了这些细胞系模型的有效性。文献中没有数据显示与永生化星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞系相比，对原代星形胶质细胞培养的完整和综合评估。在这里展示了这三种模型在相同生长条件下的形态和功能特征的比较分析。出国看病网研究人员显示星形胶质细胞，如GFAP，S100B，醛脱氢酶1家族，成员L1，水通道蛋白4和钾通道4的细胞形态和蛋白质表达特征的差异。此外，通过谷氨酸吸收，其转运蛋白的蛋白质表达，谷氨酰胺合成酶活性和谷胱甘肽含量来评估谷氨酸代谢。还使用H3评估了葡萄糖的代谢-葡萄糖摄取及其转运蛋白含量。还通过间隙连接评估了这些细胞的通讯，检查了Cx43的表达及其耦合。此外展示这些细胞模型在毒性刺激下的反应能力，通过GFAP含量和S100B分泌，谷氨酸和葡萄糖代谢以及炎性细胞因子评估星形细胞的活化。这项研究有助于评估星形胶质细胞培养的不同模型，优化该领域知识的研究，并更好地了解星形胶质细胞的生理。
    　　 聚-L-赖氨酸，甲基噻唑基二苯基溴化四唑，中性红，谷胱甘肽标准品，邻苯二甲醛，大肠杆菌055：B5的脂多糖，L-谷氨酸，邻苯二胺，y-谷氨酰基异羟肟酸，N-甲基-d-葡糖胺和氨基胍半硫酸盐购自Sigma。Lipofectamine，胎牛血清，Dulbecco改良的Eagle培养基和其他用于细胞培养的材料购自Gibco。1-[2,3-3H]谷氨酸盐购自AmershamInternational和脱氧-d-葡萄糖2-[3H]购自AmericanRadiolabeledChemicals，Inc.。LuciferYellow购自Invitrogen，生命技术公司。从Sigma：抗S100B和抗GFAP。来自Calbiochem的人GFAP。从圣克鲁斯生物技术获得的抗体：多克隆抗RAGE，抗谷氨酰胺合成酶，多克隆抗Kir4.1，抗BDNF，抗GLUT1和抗山羊IgG-R。从Chemicon获得的抗体：多克隆抗AQP-4抗体和抗conexin-43。单克隆抗醛脱氢酶家族的1元成员L1获自Neuromab。多克隆抗S100B和抗兔过氧化物酶分别购自DAKO和GE。
    　　 如先前由来自Wistar大鼠的原代星形胶质细胞培养物。程序按照《NIH实验动物的护理和使用指南》进行，并得到当地政府的批准。将新生Wistar大鼠的大脑皮层移出并在不含Ca2+和Mg2+平衡盐溶液pH7.4：137NaCl中机械分解。5.36氯化钾;0.27Na2HPO4；1.1KH2PO4和6.1葡萄糖。清除皮质的脑膜，并通过依次通过巴斯德吸管进行机械分离。300×g离心后5分钟，将片状沉淀物悬浮于DMEM补充有8.39毫米的HEPES，23.8毫摩尔的NaHCO3，0.1％的两性霉素B，0.032％庆大霉素和10％胎牛血清。将细胞接种到用聚-L-赖氨酸预处理的12或24孔板上。将培养物保持在37°C含5％二氧化碳/95％空气的，含10％FCS的DMEM中。每3-4天更换一次培养基。使细胞生长到融合并在体外21天使用。用预融合细胞进行免疫细胞化学，体外培养大约10天，播种在盖有聚L-赖氨酸的盖玻片上。通过免疫细胞化学评估，星形胶质细胞原代细胞培养物的纯度超过95％。出国看病网研究人员无法分别使用抗NeuN或抗Iba-1标记神经元或小胶质细胞。
    　　 C6胶质瘤细胞系获自美国典型培养物保藏中心。将晚期传代细胞接种在25cm2烧瓶中，并在DMEM10％FCS中培养。使用0.05％胰蛋白酶/乙二胺四乙酸从培养瓶中分离出指数生长的细胞，并接种在12或24孔板上的盖玻片上。使细胞生长到融合并在体外使用3天。永生化的星形胶质细胞由SorayaSoubhiSmaili教授捐赠。体外培养11天的星形胶质细胞原代培养用3ugpSV3-neo质粒和10uglipofectamine的混合物在5h内转染cDNA。质粒pSV3包含大SV40T抗原的基因，该基因干扰肿瘤抑制蛋白的表达。作为对照还用GFP质粒转染细胞。转染四天后添加抗体G418用于选择新霉素抗性菌落。每3-4天更换一次培养基，G418的浓度从200ug每毫升逐渐增加。3周后，选择分离的菌落并接种在24孔板中，并在75cm2逐渐扩增烧瓶。将转染的细胞保持在含有10％FCS，1％青霉素/链霉素和200ug每毫升G418的DMEM中。在这些实验中使用了10到30代的永生化星形胶质细胞。
    　　 免疫细胞化学按照进行了一些修改。简而言之，将细胞培养物用4％多聚甲醛/4％蔗糖固定10分钟，并用0.1％TritonX-100的PBS溶液在室温下透化20分钟。用2％白蛋白牛封闭1小时后，将细胞与抗GFAP，抗S100B或抗肌动蛋白孵育过夜。对于PC，将抗体以1：1000的浓度进行孵育，对于IA和C6，将抗体以1：250的温度进行孵育。用PBS进行3阶段洗涤后，将与AlexaFluor488或568缀合的特异性二抗在室温下孵育1小时。对于所有免疫染色阴性对照，通过省略一抗进行反应。当排除一抗时，未观察到反应性。细胞核用0.2千克每毫升的49染色，69-二mid基-2苯基吲哚。用尼康倒置显微镜将细胞可视化，并将图像转移至具有数码相机的计算机。通过ELISA测量S100B。将50ul样品和50ultris缓冲液50mM在预先用单克隆抗S100B包被过夜的微量滴定板上孵育2h，然后用鸡蛋中的2％白蛋白封闭1h。将多克隆抗S100孵育30分钟，然后再添加过氧化物酶偶联的抗兔抗体30分钟。在每个步骤之间，用洗涤溶液将微量滴定板冲洗三遍。加入邻苯二胺30分钟，并在492nm处测定比色反应。S100B标准曲线的范围是0.002至1ng每毫升。
    　　 进行GFAP的ELISA。将预先在TBS或标准人GFAP中稀释的细胞培养物的均质物稀释在0.1至5ng之间，在微量滴定板中于4°C孵育24h。在室温下用5％牛奶-TBS封闭2小时后，将兔多克隆抗GFAP孵育1小时。然后，将与过氧化物酶缀合的二抗在室温下孵育1小时。在每个步骤之间，用洗涤溶液将微量滴定板冲洗三遍。加入邻苯二胺30分钟，并在492nm处测定比色反应。谷氨酰胺合成酶的酶活性法确定进行修改。将在50mM咪唑中稀释的均质样品与：50咪唑，50羟胺，100L-谷氨酰胺，25砷酸二氢七水合物，0.2ADP，2氯化锰，pH6.2在37°C孵育15分钟。将反应物通过加入0.2毫升为0.37m的FeCl的停止200mM的三氯乙酸，和0.67的1MHCl。离心后在540nm处测量上清液的吸光度，并将其与在与样品相同的溶液中稀释的标准量的y-谷氨酰异羟肟酸产生的吸光度进行比较。谷氨酰胺合成酶活性表示为umol/h/mg蛋白。如先前所述确定减少的谷胱甘肽含量。简而言之，将样品在含有5mMEDTA的磷酸钠缓冲液中匀浆，并用1.7％的偏磷酸沉淀蛋白质。在室温下用邻苯二甲醛测定上清液15分钟。分别使用350和420nm的激发和发射波长测量荧光。使用标准GSH溶液使用校准曲线。
    　　 测量谷氨酸的摄取进行了一些修改。细胞培养物在37℃下，在Hank平衡盐溶液包含温育。通过移出培养基并用冰冷的HBSS冲洗细胞3次，对于PC7分钟，对于IA和C6细胞10分钟后，停止培养。然后将细胞在0.5MNaOH溶液中溶解。使用N-甲基-D-葡糖胺代替NaCl测定了钠依赖性吸收。通过从总摄取量中减去非特异性摄取量以获得非特异性摄取量来获得钠依赖性谷氨酸盐摄取量。在闪烁计数器中测量放射性。结果表示为nmol/mg蛋白质/分钟。如先前所述，对葡萄糖的摄取进行了修改。用HBSS冲洗细胞培养物。随后，将细胞在HBSS中于35°C孵育。通过添加0.1uCi/孔脱氧-d-葡萄糖2-[3H]启动分析。15分钟后，通过除去培养基并用冰冷的HBSS冲洗切片3次来终止孵育。然后将细胞在含有0.5MNaOH的溶液中溶解。通过从总摄取中减去通过使用葡萄糖转运蛋白抑制剂细胞松弛素B获得的非特异性摄取来计算葡萄糖摄取，以获得特异性摄取。使用闪烁计数器测量放射性。结果表示为nmol/mg蛋白质/分钟。使用商购的ELISA比色试剂盒在细胞培养物的上清液中按照制造商的说明测量TNF-α。
    　　 将细胞培养物在样品缓冲液，然后煮沸并离心。在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中对等量的总蛋白进行电泳。将分离的蛋白质印迹到硝酸纤维素膜上。将膜在含有2％牛白蛋白的TBS-T中孵育1小时。随后，将膜与适当的一抗以1：5000的稀释度在4°C下孵育过夜。然后将膜用TBS-T冲洗，并在4°C下与辣根过氧化物酶连接的抗IgG抗体暴露1h。用抗肌动蛋白确认每个样品的等量负载。使用来自Amersham的ECL试剂盒检测化学发光信号，并在发光图像分析仪中进行评估。使用ImageJ软件分析发光信号差异。进行刮板装载/染料转移。处理后，除去并保存条件培养液。将培养物在不含Ca+2HBSS中快速仔细清洗，以防止由于高Ca2+水平而导致细胞解偶联。用手术刀刀片在Ca+2中进行两次平行刮擦室温下含0.1％路西法黄的免费HBSS。细胞膜的破坏使染料渗透到细胞中并通过GJ通道扩散到周围的细胞中。1分钟后，将染料用HBSS冲洗掉。重新引入条件温育培养基，并将培养物放置7分钟。之后，用尼康倒置显微镜观察细胞，并用数码相机将图像转移到计算机上。所有图像是至少三次重复进行的至少三个实验的代表场。在37°C孵育的最后30分钟内，将细胞与50ug每毫升甲基噻唑基二苯基-四唑溴化物孵育。之后，除去介质，将MTT晶体溶解在DMSO中。在560和650nm处测量吸光度值。将MTT的减少计算为-，并表示为基础的百分比。蛋白质含量通过以牛血清白蛋白为标准品改良的Lowry方法测量。参数数据报告为平均值±标准误差，并使用SPSS-16.0通过t检验或方差单向分析进行分析，然后进行Tukey事后分析。图例中指定了测试，显着性水平设置为p小于0.05。
    　　 用肌动蛋白，GFAP和S100B蛋白的标记评估细胞星形胶质细胞的形态。PC和IA显示相似的多边形形状，几乎没有细胞过程。肌动蛋白标记揭示了两种细胞类型中有序的细丝。相比之下C6胶质瘤细胞呈细长体，具有弥漫性肌动蛋白纤维。与IA相反PC和C6表现出福斯科林10uM刺激诱导的形态学改变。PC显示出星状特征形状，C6显示出细胞体收缩且过程较薄。发育过程中GFAP/波形蛋白比例的增加与星形胶质细胞的分化有关。在研究中IA和C6显示与PC相同的GFAP/波形蛋白比，表明相似的分化状态。关于星形细胞标记物，C6和IA为阳性，但与PC相比，GFAP，S100B，ALDHL1和AQP4的水平降低。Kir4.1在所有测试的细胞模型中均显示相似的水平。通过测量谷氨酰胺合成酶和谷氨酸转运蛋白含量以及GS活性和谷氨酸吸收来评估谷氨酸代谢。所有这些测量在IA和C6细胞中均降低。GSH含量是星形胶质细胞中的主要抗氧化剂，其生物合成也取决于谷氨酸含量，它是由PC，IA和C6等量产生的。通过测量葡萄糖转运蛋白和摄取来评估葡萄糖代谢。在分析中C6胶质瘤细胞显示出比PC和IA更高的葡萄糖摄取率。尽管有这些数据，但与PC相比，IA和C6的葡萄糖转运蛋白含量较低。星形细胞通讯对其许多功能至关重要。通过分析星形胶质细胞培养物中表达最丰富的连接蛋白锥体素43的含量，并通过使用路西法黄染料进行的废料含量测定，评估了这种交流。与PC相比，两项分析均显示IA和C6细胞中的间隙连接通讯受损。
    　　 考虑到星形胶质细胞的三种模型在基础蛋白谱上表现出差异们想知道它们在相同的刺激下是否会有不同的反应。出国看病网研究人员使用良好描述的刺激来干扰星形胶质细胞功能。相对于葡萄糖和谷氨酸的摄取以及TNFα的分泌，三种细胞模型在刺激下以相似的方式反应。然而，与PC和C6具有相似的反应相反，IA不受S100B分泌，GS活性和GSH含量刺激的影响。在IA和C6中均未显示在PC中观察到的LPS刺激下GFAP的增加。根据MTT减少试验，在所有刺激下细胞的生存力均未受到损害。星形胶质细胞的形态和可塑性在调节细胞外微环境和突触活性中可能至关重要。在研究中基础条件下的形态评估显示PC和IA之间具有相似的多边形形状。相反C6细胞显示出梭形或三角形细胞体和不规则的肌动蛋白网络，这先前与神经胶质瘤的侵袭性有关。尽管在出国看病网研究人员的工作中C6已被大量使用，但这些细胞起源于肿瘤，可能保留了转化细胞的某些特征。
    　　 在经典地诱导cAMP的细胞内含量增加的福斯高林刺激下，PC表现出细胞体收缩和突出的长过程，如预期的那样。在相同条件下C6表现出细胞体收缩，但过程比PC稀疏和稀薄。尽管IA在形态上与PC相似，但它们不受毛喉素刺激的影响。有趣的是，原代星形胶质细胞培养物在传代培养后会失去进程，这可能解释了部分IA无反应性。与出国看病网研究人员的结果相似，二丁酰-cAMP不会像C6和PC一样诱导永生化细胞系中GFAP的上调。此外，星形胶质细胞肥大高度依赖于GFAP含量，GFAP含量已在谱系细胞中降低，并已被这项研究证实。总之结果表明，IA中形态可塑性可能会受到损害，从而使该细胞系成为该评估的不利模型。星形胶质细胞是功能性和分子异质性细胞。但是，它们具有一些蛋白质标记，例如S100B和GFAP。C6和IA对两种标记物均为阳性，尽管数量明显少于PC。先前在其他工作中也观察到了类似的结果。除这些标记外，出国看病网研究人员还评估了ALDH1L1蛋白，该蛋白已被用作一种新的星形胶质标记。尽管该蛋白参与叶酸代谢，但干扰细胞分裂和生长，与PC相比，IA和C6细胞的ALDH1L1水平降低。在星形胶质细胞膜中广泛表达的AQP4水平也观察到了相同的结果。
    　　 IA和C6细胞中重要的星形细胞标记物水平降低可能是由于它们的高增殖特性所致。从这个意义上讲，这两种细胞系可能会更多地投资于与细胞增殖相关的蛋白质的合成，而不是特定的星形细胞标记。已知细胞内任何特定蛋白质的水平都是动态的。基因表达可以根据细胞密度或细胞周期转变时间而变化。例如，预计融合细胞中增殖相关基因的减少，或与细胞分化相关的基因的上调。增殖能力的减弱可以使细胞经历更分化的状态。因此，在该分析以及使用这些细胞模型的任何其他研究中，保持融合模式以达到基因表达稳定性都是重要的。Kir4.1通道也是一种神经胶质特异性蛋白，在所有测试的细胞类型中均显示相似的含量。然而，已经证明由于胶质瘤的局部细胞核而不是细胞膜，钾电导受到损害。因此，类似的蛋白质表达不一定代表Kir4.1功能。
    　　 如神经退行性疾病中所见，星形胶质细胞中谷氨酸代谢的受损可能会损害谷氨酸-谷氨酰胺循环和许多大脑功能。最近显示，星形胶质细胞谷氨酸的摄取取决于GS活性，这确保了EAAT捕获的谷氨酸的有效清除。因此，而不是仅观察到早期研究中所见的表达，分析评估了这种清除机制的功能。发现与PC相比IA和C6细胞的谷氨酸代谢降低。尽管谷氨酸转运蛋白在细胞系中的基础表达与PC差别不大，但其功能极低，这表明EAAT1和EAAT2在这些细胞的质膜中可能定位较差。重要的是要注意，其他研究尚未在谱系细胞中检测到谷氨酸转运蛋白，但是在传代培养至少100次的C6低代中进行了分析，这与细胞相反。C6从神经胶质瘤转换为分化的星形胶质细胞模型的机制原因仍然未知。有趣的是，在谷氨酸刺激下，EAAT2的过度表达可降低C6细胞的增殖速率，表明谷氨酸转运蛋白与细胞增殖之间呈负相关。GSH的产生使星形胶质细胞具有高的大脑氧化防御能力，所有测试的细胞类型均显示相似的GSH含量。众所周知，谷胱甘肽的产生取决于谷氨酸含量。考虑到IA和C6细胞中谷氨酸的摄取和GS活性低于PC，可以假设谷氨酸主要是针对这些细胞系中GSH的产生。在PC，IA和C6细胞中，这些途径可能受到不同的控制。与正常的星形胶质细胞相比，Xc-半胱氨酸/谷氨酸反转运蛋白系统在神经胶质瘤细胞中过表达，这有助于它们的生长，存活和扩增。此外，高GSH的产生可能保护神经胶质瘤细胞免于在增殖细胞中观察到的高氧化代谢。
    　　 星形胶质细胞代表脑能量稳态的关键因素。星形胶质细胞捕获的大多数葡萄糖被驱动到糖原存储或转化为乳酸以用于神经元输出。尽管与PC相比，星形胶质细胞中的主要葡萄糖转运蛋白在IA和C6中表达不足，但在C6细胞中葡萄糖摄取更为明显。肿瘤衍生细胞具有Warburg效应，也就是说，糖酵解是能量衍生的主要方法。因此，它们比正常细胞使用更多的葡萄糖。因此先前的研究表明，C6胶质瘤细胞比正常星形胶质细胞利用更多的葡萄糖，产生更少的乳酸。有人建议将葡萄糖用于另一种途径，例如戊糖磷酸分流，这会增加谷胱甘肽还原酶活性产生的NADPH和GSH含量。在增殖细胞中能量代谢增加是常见的。代谢性底物可以穿过星形胶质细胞间隙连接，这种交流与增殖速率成反比关系。肿瘤细胞系通常没有间隙连接，其存在被促进肿瘤的分子所抑制。实际上，已知C6具有低水平的细胞通讯，这与在出国看病网研究人员的结果和先前的研究中看到的Cx43的低表达是一致的。间隙连接通讯的增加降低了C6细胞的葡萄糖摄取和增殖率。同时，内皮素对间隙连接的抑制刺激了星形胶质细胞中GLUT-1从细胞内池到质膜的移位和上调。因此，除了沃伯格效应外，间隙连接在增殖细胞中的葡萄糖摄取调节中也可能起重要作用。
    　　 当将不同模型的星形胶质细胞培养物用于同一处理时，在文献中发现了一些矛盾的结果。这些变化的结果使分析变得困难，并对模型的有效性提出怀疑。因此测试了三种不同的星形胶质细胞培养模型对相同的治疗有何反应。为此使用了文献中已知的刺激来引起原代培养的功能改变。重要的是要提到培养反应的变化也可能受到培养过程差异的影响，例如培养基组成，培养板包被和培养天数。这些差异可能会干扰基因表达和形态变异。实际上，最近显示细胞外基质的组成决定了星形胶质细胞对机械刺激和炎性刺激的反应。在这项工作中，出国看病网研究人员将相同的程序应用于所有三个培养的模型，以确保观察到的治疗效果是由于生物细胞变异所引起的。总的来说结果表明PC和C6细胞对相同的刺激反应相似，特别是在S100B分泌，GSH含量，谷氨酰胺合成酶活性，葡萄糖和谷氨酸摄取以及TNFα分泌方面。因此尽管它们经常在蛋白质的基础量上表现出差异，但是这些途径的激活似乎是相似的，至少对于测试的刺激而言是如此。相反IA显示较少的反应性，表明该转染的克隆不是用于研究某些星形胶质细胞特征的良好模型。最近发现，p53亚型以不同的途径表达，调节星形胶质细胞介导的神经保护和神经退行性变。因此，具有p53抑制作用的IA可能具有受损的功能。重要的是要注意，IA保留了对谷氨酸和葡萄糖摄取以及TNFα分泌的反应。
    　　 根据出国看病网研究人员的数据，尽管PC是一项耗时且昂贵的技术，但无疑将其用作星形胶质细胞研究的生殖模型。然而，C6细胞系尽管存在某些局限性，但似乎以显着方式繁殖星形胶质细胞。总而言之，这项工作确定了每种培养物的局限性和优势，提供了星形胶质细胞功能的完整综合比较，并优化了该知识领域的研究。此外，它强调了在无法使用PC时，针对每种感兴趣的刺激验证细胞培养模型的重要性，以便选择合适的细胞模型。
 
出国看病概况

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　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
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