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脑胶质瘤干细胞的增殖和分化
  • 　　脑神经胶质瘤是颅内肿瘤中最常见的原发性恶性肿瘤，约占所有颅内肿瘤的45％。脑胶质瘤患者的预后一般较差，并且与恶性肿瘤的增加，预后越差。研究结果表明，IV级胶质母细胞瘤多形式患者的中位生存时间仅为1年，而5年生存率不到5％，是人类死亡率最高的恶性肿瘤之一。手术治疗是治疗脑胶质瘤最有效的方法。随着分子靶向治疗的发展，脑胶质瘤患者的生存得到有效改善，但总体治疗效果仍不理想，脑胶质瘤的发生和发展机制尚不清楚。因此，继续研究脑胶质瘤分子水平的变化，为临床治疗脑胶质瘤寻找新的治疗靶点非常重要。miR-124可通过影响CDK6促进脑胶质瘤干细胞的分化来抑制多种形式的胶质母细胞瘤的增殖。因此，miR-124调节脑胶质瘤干细胞分化的机制尚不完全清楚，其作用尚未得到进一步证实。Nogo家族具有Nogo-A，Nogo-B和Nogo-C三种亚型，它们可以抑制中枢神经系统疾病中突触的生长和重新连接。Nogo-A是最长的异构体，富含CNS，而NgR是Nogo的受体。Nogo信号通路与脑损伤有关，抑制其活化可以减少小胶质细胞的死亡。本研究分析了miR-124对U87胶质瘤干细胞增殖和分化的影响及其对Nogo信号通路的影响，以探讨其作用机理。
    　　 脑神经胶质瘤细胞U87MG-Luc2购自ATCC，以下简称U87细胞，并已通过STR分析进行了鉴定。将细胞在37℃，5％CO2和95％相对湿度的培养条件下在含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基中培养。当U87的细胞贴壁生长密度达到90％时，用0.25％的胰蛋白酶消化细胞。将U87细胞转移到DMEM培养基中，并在37℃，5％CO2培养箱中培养，然后在显微镜下观察突触回缩。收集培养物以用于第三代。每两天更换一次培养基，在更换之前在4°C下以800×g离心5分钟，然后更换一半的培养基。3周后，按照上述方法收集悬浮细胞并传代。
    　　 miR-124表达载体的构建和转染。miR-124模拟物，miR-124抑制剂和miR对照表达载体是由上海基因制药技术有限公司设计和生产的。转染前用胰蛋白酶消化细胞24小时，当转染后将U87干细胞转染。细胞融合至大约80％，将细胞在37℃，5％CO2培养箱中培养48小时，并且每6小时更换一次培养基。通过RT-qPCR检测转染结果。将细胞悬液的浓度调节至1×10，并通过以3：1加入悬浮液和TRIzol裂解液提取总RNA。提取后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳分析RNA的完整性，用微量核酸分析仪检测提取RNA的纯度。A260值在1.8到2.0之间被认为可以满足实验要求。RNA提取完成后，进行RT-qPCR反应。
    　　 通过蛋白质印迹分析检测Nogo-A和NgR蛋白的表达。用RIPA总蛋白裂解物从细胞中提取总蛋白，并用BCA测定提取蛋白的浓度，并从Beyotime生物技术研究所购买BCA蛋白定量检测试剂盒。然后，将提取的40ug蛋白溶液用于SDS-PAGE电泳，并以1：4的稀释度添加缓冲液。将B-肌动蛋白蛋白用作内部参考，在80V恒定电压下进行浓缩凝胶电泳40分钟，在120V恒定电压下进行分离凝胶电泳90分钟。电泳完成后，跨膜在100V恒定电压下进行100分钟，并在37°C下封闭60分钟。跨膜后进行了免疫反应。用初级兔抗人Nogo-A多克隆抗体在4℃下孵育16小时。第二天将其在温水中洗涤3次，每次用PBS洗涤10分钟。然后，用次级山羊抗兔多克隆IgG在37°C下孵育60分钟。ECL发光试剂用于可视化和固定。胶片扫描后，蛋白相对表达水平计算为：条带灰度值和内部参数灰度值。
    　　 将U87脑神经胶质瘤干细胞制成4×10/ml的单细胞悬液，进行常规接种，并在96孔细胞培养板上培养。然后，在6小时后添加20ulMTT溶液，并将细胞在37°C下连续培养4小时。除去含有杂质的上清液，加入二甲亚砜，并将板置于水平振动台上。在12、24、48和72h下测量波长570nm处的吸光度值。将U87脑神经胶质瘤干细胞制备成1×106/ml的单细胞悬液。用免疫磁珠分离CD133+细胞，洗涤，重悬，在无血清培养基中计数，观察细胞形态。
    　　 miR-124模拟组，miR-124抑制剂和miR对照组中miR-124的相对表达水平分别为1.83±0.14、0.89±0.09和1.34±0.12。miR-124模拟组细胞中miR-124的相对表达明显高于miR-124抑制剂组和miR对照组，而miR-124在miR-124细胞中的相对表达。抑制剂组低于miR对照组。转染后U87脑胶质瘤干细胞中Nogo-A和NgR蛋白的表达。miR-124模拟组，miR-124抑制剂和miR对照组中Nogo-A蛋白的相对表达水平分别为0.392±0.011、0.569±0.013和0.483±0.012，NgR蛋白的相对表达水平为0.533±0.012、0.711±0.014和0.601±0.014三组之间Nogo-A和NgR蛋白存在显着差异，miR-124模拟组细胞中Nogo-A和NgR蛋白的相对表达显着低于miR-124抑制剂和miR-124抑制剂。miR对照组，而miR-124抑制剂组细胞中Nogo-A和NgR蛋白的相对表达高于miR对照组
    　　 外MTT增殖结果表明，三组的吸光度值在每个时间点均存在显着差异。在每个时间点，miR-124模拟组和miR对照组的细胞吸光度值均显着低于miR-124抑制剂组，而miR-124的细胞值模拟组明显低于对照组。miR-124模拟组，miR-124抑制剂和miR对照组的CD133+细胞水平分别为3.98±0.45、36.12±1.34和51.25±1.48％。三组间差异有统计学意义，miR-124模拟组CD133细胞水平明显低于miR-124抑制剂组和miR对照组，而水平miR-124抑制剂组的CD133+细胞表达高于miR对照组。
    　　 随着分子生物学和相关疗法的发展，越来越多的学者开始关注miRNA在肿瘤中的作用。miR-124在神经发育中起重要作用，但在神经胶质瘤中很少报道。脑胶质瘤中miR-124表达的下调和上调可以起抑癌基因的作用，但对miR-124的机制尚不完全清楚。已经有对的Nogo的途径少数报告，减少的Nogo-A表达可保护大脑损伤，促进神经元再生，而脑胶质瘤从脊髓神经元的癌变。因此，本研究探讨Nogo途径是否在脑胶质瘤中发挥作用，以及它是否是miR-124在脑胶质瘤干细胞分化中的靶标，为临床治疗提供了新的方向。
    　　 被用于脑胶质瘤干细胞的筛选，因为他们长成球能力，这可以用来筛选那些满足实验需要的干细胞U87脑胶质瘤细胞。然后构建miR-124的过表达载体，表达不足的载体和空白载体，以转染U87脑神经胶质瘤干细胞并调节miR-124的表达水平。RT-qPCR结果显示，miR-124模拟组细胞中miR-124的相对表达明显高于miR-124抑制剂和miR对照组，而miR-124在miR细胞中的相对表达-124抑制剂组低于miR对照组，说明转染成功。然后检测Nogo和NgR蛋白的表达水平，发现随着miR-124表达水平的升高，NgR蛋白的表达水平降低，相关分析还表明，miR-124与Nogo和NgR蛋白的表达水平呈负相关，这提示miR-124与Nogo通路之间可能存在一定的调控关系。CD133被认为是肿瘤干细胞的表面标记，在分化的肿瘤细胞表面不表达。因此，表达CD133细胞的定量比例可以在一定程度上反映干细胞的分化。U87脑神经胶质瘤干细胞增殖的分析结果表明，miR-124表达水平高的细胞增殖能力低。U87脑神经胶质瘤干细胞分化的分析结果表明，miR-124表达高的U87脑神经胶质瘤干细胞CD133+细胞比例低，表明分化程度高。这些结果类似于在相关的研究报道miR-124可以促进脑胶质瘤干细胞。
    　　 脑神经胶质瘤干细胞是一种特殊的细胞亚群，是脑神经胶质瘤形成的来源，有可能分化为脑神经胶质瘤细胞。分化也是脑胶质瘤干细胞和脑胶质瘤细胞的重要特征。脑胶质瘤干细胞具有致瘤没有能力和无限增殖能力也分化成脑胶质瘤细胞。因此，促进脑胶质瘤干细胞的分化也是治疗脑胶质瘤的重要方法。另一方面，面对放射疗法和化学疗法，脑胶质瘤干细胞比脑胶质瘤细胞具有更高的耐受性，并且它们的DNA修复能力也强于脑胶质瘤细胞。因此，脑胶质瘤干细胞是脑胶质瘤治疗的新研究方向。目前，这种治疗仍处于探索阶段。miR-124于2008年首次报道发现miR-124表达的增加促进了脑胶质瘤干细胞的分化，但此后很少有关于分化的报道。miR-124可以调节星形胶质细胞和其他神经细胞的分化。这一发现证实了miR-124对脑胶质瘤干细胞分化的调节作用。Nogo-A可抑制脑神经胶质瘤细胞的侵袭和迁移。Nogo，NgR与肿瘤形成之间有着密切的关系。以上结果在一定程度上也提高了出国看病网研究人员结论的可信度。
    　　 但是，这项研究也有一些缺点。脑胶质瘤是多种多样的。U87脑神经胶质瘤细胞只是这些亚型中的一种。需要对其他神经胶质瘤进行研究以进一步验证。体外实验无法在体内模拟复杂的肿瘤微环境。因此，研究人员希望这项研究能够促进该领域的进一步研究。总之，miR-124可能通过Nogo途径参与脑胶质瘤干细胞的分化，这可能为脑胶质瘤的临床治疗带来新的方向。
 
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