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磷酸化在小胶质巨噬细胞中的表达
  • 　　胶质母细胞瘤是最具侵略性的原发性脑肿瘤，尽管采取了激进的治疗方法，但治疗失败率高，预后差。肿瘤分类基于恶性，核非典型性和周围脑实质浸润。不幸的是，一旦患者出现症状，通常就可以诊断出肿瘤，这时病变已经广泛扩散。十多年前建立的黄金治疗标准包括分级放疗结合替莫唑胺经典化疗。然而，在几乎所有情况下，在初始治疗后都会出现化疗耐药性并且复发很常见。靶向T细胞免疫检查点受体PD-1/PD-L1的癌症免疫疗法的临床成功证明了逃避免疫作为癌症标志的重要性。在先天免疫反应方面，控制巨噬细胞-单核细胞谱系贩运的新型CCR2拮抗剂的近期临床前和临床开发属于相同的概念框架。这些免疫治疗药物包括抗体-药物偶联物，肽疫苗，修饰的表达嵌合抗原受体的T细胞的自体输注，自体树突状细胞疫苗，溶瘤病毒，免疫刺激性病毒，检查点阻断抑制剂和作用于先天免疫细胞的药物。
    　　 GBM免疫微环境是异质的，并且在GBM亚型中可能有所不同。尽管显示出对肿瘤微环境的操纵能够抑制GBM肿瘤进展，特定免疫人群的作用仍然很差。小胶质细胞是中枢神经系统的主要驻留免疫细胞，被认为在炎症和生理环境中都是多功能的。尽管在过去的十年中，GBM病理学对多任务小胶质细胞的理解取得了重要进展，但在不同疾病阶段的小胶质细胞的相对重要性以及如何将小胶质细胞靶向以达到最佳治疗效果仍然是个谜。胶质瘤相关的小胶质细胞构成了肿瘤浸润细胞的最大部分，占胶质瘤的30％至70％。取决于GAM位置或疾病阶段，不同的激活模式共存于同一肿瘤中。特别地，GAMs暴露于诱导它们产生细胞因子和趋化因子的因子，这些因子促进肿瘤生长并维持促肿瘤原性，免疫抑制的微环境。因此，小胶质细胞和GBM之间存在双向交互作用。在此背景下，先前研究了大鼠小胶质细胞与C6胶质瘤细胞之间的体外相互作用。暴露于在基线条件下从C6细胞获得的条件培养基中，在小胶质细胞中诱导了主要的M2样表型。相反，如果将C6细胞暴露于含有促炎性刺激的培养基中，则随后将小胶质细胞暴露于这种培养基中，然后转变为M1型表型。此外，调查了41名被诊断为IV级GBM的患者的手术标本中的小胶质细胞和巨噬细胞活化状态。对于每个患者，网研究人员都分析了肿瘤的中心和周围的薄壁组织。研究了四种不同的标志物，即IBA-1，CD163，iNOS和AR出国看病G-1，研究人员发现可以将M2标志物而不是M1标志物作为预后标志物。
    　　 磷酸肌醇3激酶蛋白激酶雷帕霉素的哺乳动物靶标途径是一项经过充分研究的信号传导途径，可调节多种细胞功能，包括增殖，代谢和转录。由于癌基因的功能获得性突变和肿瘤抑制因子的功能丧失突变，在许多人类癌症中均观察到mTORC1的激活。另外，已经描述了mTOR在神经胶质功能的调节中的直接作用。来自研究人员和其他小组的数据支持mTOR参与神经胶质促炎性激活的观点以及小胶质细胞-神经胶质瘤的相互作用。在体外大鼠模型中，研究人员证明了mTOR的抑制可使神经胶质瘤激活的小胶质细胞向M1表型极化，并同时阻止诱导促进肿瘤生长的M2状态的诱导。尽管目前已经很好地确定了mTOR在神经胶质瘤生物学中的相关性，但使用mTORC1抑制剂及其类似物）的初步研究显示，在临床试验中疗效有限。尽管存在此类最初的失败，但仍在研究新型mTOR抑制剂。目前列出了478项正在进行的有关mTOR和癌症的研究，其中28项针对神经胶质瘤。这些试验中的大多数都在单独或与单克隆抗体组合测试ATP竞争性mTOR抑制剂。这种策略既针对GBM单元又针对GAM功能，从而增加了对该领域进一步研究的需求。
    　　 在目前的工作中，研究人员采用两种不同的方法，即人类肿瘤标本和人类细胞模型，来表征GAM中mTOR途径的激活。使用从42例患者获得的外科GBM样本的免疫染色分析，评估了磷酸化的mTOR表达和定位于小胶质细胞，并使用三种人类细胞系，研究了mTOR在体外小胶质细胞-神经胶质瘤相互作用范例中的参与。研究人员招募了42名诊断为GBMIV的患者。对于每位患者，研究人员都能够检查神经胶质瘤标本以及肿瘤周围1-2cm的组织。神经胶质瘤组织中超过35％的细胞和周围细胞中超过25％的细胞显示mTOR激活，这通过Ser2448处的磷酸化表明。尽管在肿瘤内磷酸-mTOR激活的阳性细胞的百分比更高，但研究人员发现肿瘤与周围组织之间的染色强度没有差异。此外，在15名患者中显示出较高百分比的磷酸化mTOR+细胞的亚组中，对磷酸化mTOR和IBA1进行了双重染色，是小胶质细胞巨噬细胞类型的标记。在肿瘤内，所有细胞中约9％是磷酸化mTOR+小胶质巨噬细胞，而在肿瘤周围组织中则为4.4％。查看IBA1+细胞，研究人员发现神经胶质瘤标本中约22％的细胞是小胶质细胞巨噬细胞。这些细胞中有39％是表达磷酸化mTOR的IBA1+细胞。相反，在肿瘤周围，15％的细胞是小胶质细胞巨噬细胞，其中21％的细胞表达磷酸化mTOR。
    　　 两种不同的人类神经胶质瘤细胞系U87MG和T98G用于检查它们对炎症刺激的反应。将细胞暴露于促炎细胞因子混合物中，然后在不同的时间点评估基因表达。TII使IL1B，IL6和COX2显着增加，在8h达到最大水平，此后表达下降。相反，TGFB和ARG2表达不受促炎刺激的影响。在促炎性刺激之前或之后均未检测到iNOS，IL10和ARG1mRNA。基于这些结果以及以前的数据，研究人员通过将胶质瘤细胞与TII或普通培养基预孵育4小时来制备胶质瘤条件培养基。预温育后，将细胞仔细洗涤并在普通培养基中再温育24小时，仅产生基础条件培养基或预刺激的条件培养基。为了表征CM，研究人员在培养培养基中测量了上述基因的终产物水平，即IL1B，IL-6，PGE2，尿素和NO。从U87MG或T98G细胞获得的B-CM或PS-CM中均未检测到NO。相比之下，在T98GCM和U87MGCM的基线处都可以检测到明显的尿素水平，但是当U87MG或T98G预先使用时，这些水平没有差异。用细胞因子混合物刺激。与B-CM相比，U87MGPS-CM的PGE2，IL6和IL1B水平分别显着提高了1.5倍，4倍和5倍。在T98GPS-CM中，还发现与B-CM相比，IL1B和IL6水平分别增加了3倍和6倍，而在PGE2水平上却没有观察到变化。
    　　 研究人员进行了一系列实验，其中将人小胶质细胞CHME-5细胞暴露于CM。将细胞与梯度浓度的CM一起孵育0-72小时。普通培养基中CHME-5细胞的生长在16-24小时内达到峰值，并在长达48小时内保持稳定。此后，观察到死亡细胞的数量增加。当培养基中CM的百分比增加时，这种生长情况保持不变，但有两个例外：在所有测试中，U87MG的B-CM均为100％，但T98G细胞并未增加活细胞总数，而致死率却增加了在暴露于T98G细胞的100％PS-CM后观察到，发现CM对细胞生长没有剂量依赖性的影响。然而，观察到对来自T98G细胞的PS-CM诱导的致死性具有剂量依赖性作用。由于孵育48小时后观察到的杀伤力增加，所有后续实验均在0至48小时之间进行。
    　　 为了研究不同CM在CHME-5细胞中诱导的表型分布，研究人员测量了培养基中释放的尿素和NO的水平，作为通过ARG途径进行L-精氨酸代谢的标志物以及TNFα，iNOS的表达，TGFB和IL10mRNA。研究人员发现B-CM和PS-CM均引起尿素水平的剂量依赖性增加，与普通培养基相比，T98G细胞50％的CM和U87MG细胞100％的CM达到了统计学意义。相反，研究人员发现与对照组相比，NO水平无差异，iNOSmRNA水平或任何其他测试基因均无变化。
    　　 研究人员试图研究CMs对先前用TII刺激4h的CHME-5细胞的影响。实际上，这种预刺激将CHME-5细胞驱动到激活的M1谱中。在这些条件下，研究人员发现T98GCMs引起的尿素水平发生了显着变化，但是通过比较所有CMs促进未预刺激细胞的尿素释放与预处理细胞之间的尿素释放量使用TII时，所有CM都会显着增加尿素的释放。与未刺激的细胞相比，所有CM均显着增加了用TII刺激4h的CHME-5细胞中的iNOSmRNA水平。在用CM刺激4小时后，iNOSmRNA水平增加，但是在更长的暴露时间后，不再观察到增加。孵育48小时后，通过用TII预处理可以提高NO水平，但是由于存在任何CM，NO水平会持续降低。数据合计表明，CMs在静止的小胶质细胞和预刺激的M1小胶质细胞中都诱导出M2谱，尽管后者具有短暂的响应。
    　　 研究人员测试了暴露于人神经胶质瘤衍生的CM后，mTOR通路是否在人小胶质细胞中被激活。研究人员发现T98GB-CM和PS-CM，而不是U87MGCM均在2小时的孵育期后相对于对照显着增加了Ser2448处mTOR的磷酸化。同时，m-TOR下游因子4EBP1被B-CM显着修饰。同样，在所有CM的存在下，另一个mTOR下游因子p-P70S6k也显着增加。还研究了mTOR激活的机制。有趣的是，在存在CM的情况下，上游因子TSC2显着降低。在基础条件下，CHME-5细胞表达高水平的RaptorA和Rictor基因表达。无论使用何种CM，无论是细胞起源还是预刺激状态，均不会影响该基因表达，在任何CM存在的情况下，与mTOR抑制剂RAPA孵育均不会改变Raptor和Rictor基因的表达。
    　　 尽管对mTOR成分没有影响，但是RAPA降低了暴露于B-CM或PS-CM的CHME-5细胞的尿素产量和ARG1表达。此外，与RAPA孵育对IL6，ARG1或IL10基因表达均无影响。RAPA仅由于存在CM而使iNOS的基因表达增加了4倍；但是，这种增加与48h时NO水平的增加无关。这些数据与研究人员先前在大鼠模型中的观察结果一致，并强化了mTOR的阻断与M2/M1比率的改变有关的想法。
    　　 在本研究中，使用两种不同的方法来研究神经胶质瘤相关小胶质细胞中mTOR途径的激活。通过对42例手术GBM样本进行免疫染色分析，显示了小胶质巨噬细胞中磷酸化的mTOR表达和定位。此外，这些发现在功能性实验中得到了证实。使用U87MG或T98G细胞作为人类神经胶质瘤的模型，并使用CHME-5细胞作为人类小胶质细胞的模型，研究人员研究了mTOR在两种不同条件下参与小胶质细胞-神经胶质瘤相互作用的体外范例。
    　　 在过去的十年中，小胶质细胞在GBM病理学中的作用越来越清晰。在GBM的影响下，小胶质细胞倾向于呈现M2表型，其主要具有促肿瘤作用。在GBM中看到的一些具有小胶质细胞特征的细胞实际上是肿瘤细胞群的一部分。根据这些发现，M2小胶质细胞标志物CD163的表达也是免疫细胞与肿瘤性肿瘤细胞之间融合融合的标志物。在外科GBM标本中，男性和女性患者中，GBM标本中的CD163表达均高于周围。综合这些发现，得出这样的假设：在特定条件下，小胶质细胞可能会失去免疫系统的特征并获得肿瘤细胞的特征。但是，需要进一步的研究来确认或消除这些可能性。
    　　 在研究人员的研究中，研究人员使用尿素的产生作为精氨酸代谢的指标。真核生物中尿素的主要来源是精氨酸酶将精氨酸转化为鸟氨酸。但是，谷氨酰胺还可以通过谷氨酰胺酶的作用从谷氨酰胺中产生尿素，然后产生氨，然后将其与二氧化碳冷凝生成尿素。主要发生在肝脏的过程。然而，大多数胶质细胞衍生的肿瘤细胞依赖谷氨酰胺来生长，这与磷酸激活的谷氨酰胺酶的表达有关产生谷氨酸盐作为能源。因此可能修饰尿素产生的T98G细胞治疗可能部分归因于磷酸盐激活的谷氨酰胺酶的变化。此外，由于mTOR抑制剂引起的尿素释放受到抑制可能是由于谷氨酰胺酶表达的降低，这可能有助于这些抑制剂减少神经胶质瘤生长的能力。这将与某些胶质母细胞瘤细胞系中谷氨酰胺酶的上调使其对mTOR抑制具有抗性的发现相一致。
    　　 使用人类小胶质细胞-神经胶质瘤相互作用范例，研究人员显示了在模拟人类GBM病理的条件下，小胶质细胞中的mTOR通路被完全激活。这样的mTOR活化，观察到磷酸化的mTOR分数的增加，是与从人肿瘤标本数据完全一致，表明在神经胶质瘤样本的小胶质细胞-巨噬细胞的39％的细胞表达的mTOR在Ser-2448，作为mTORC1的活化的标志物磷酸化。另外，这里显示小胶质细胞在神经胶质瘤细胞的存在下表达M2肿瘤前表型，并且在mTOR抑制剂存在下该M2表型下调。基于以上数据，假设GBM患者中的mTOR阻断可能导致所有与肿瘤相关的小胶质细胞中约40％的M2表型表达降低。在这方面，必须强调的是，小胶质细胞可能代表了整个肿瘤的30-70％。
    　　 在本研究中，研究人员报告了使用两种不同神经胶质瘤细胞系的数据。初步数据显示，通过U87MG或T98G获得的条件培养基在IL6，IL1B和PGE2释放方面相似但不相同。实际上，与从U87MG获得的CM相比，从T98G获得的CM含有更多的IL6和IL1B，但含有更少的PGE2。这些差异可以解释为什么在某些情况下CM会产生不同的结果。在这里，研究人员表明，取决于不同的实验条件，可以通过不同的途径引发mTOR激活。实际上，当CHME-5细胞用B-CM[模仿病理学早期状态处理时，mTOR途径的激活与TSC2的显着阻断有关。相反，当CHME-5细胞暴露于PS-CM[一种模仿病理晚期的条件时，mTOR激活部分独立于TSC2灭活。虽然TSC2抑制被认为是TOR激活的“经典”途径，但也已经描述了TSC2独立机制。上游致癌突变通过至少两种替代机制激活mTORC1激酶：TSC2的下调失活和AKT对mTORC1抑制剂PRAS40的磷酸化。TSC2蛋白整合了来自三个途径的信号；这些途径中的每一个都可以导致TSC2上几个丝氨酸和苏氨酸的磷酸化。后者反过来又充当小Ras样蛋白Rheb的GTPase激活蛋白。人们认为与GDP绑定的Rheb是无活性的，而Rheb-GTP是mTORC1激酶的必需激活剂。AKT使PRAS40磷酸化会抑制PRAS40与mTORC1的结合以及随后的mTORC1激酶激活。
    　　 由于mTOR抑制剂可作为免疫抑制剂，因此基于其控制细胞增殖的能力，已在肿瘤学的临床试验中对其进行了广泛的研究。到目前为止，依维莫司的功效已被证明是肺癌，胰腺癌或胃肠道源性肾癌，乳腺癌和神经内分泌癌的二线治疗药物。总体而言，mTOR抑制剂在各种其他肿瘤类型的临床试验中取得的成功有限。这种有限成功的原因尚待阐明，但可能与抑制通常参与肿瘤抑制的大量mTORC1调节的信号系统有关，例如受体酪氨酸激酶，PI3K-Akt的激活信号传导和Ras-ERK途径。为了克服这些局限性，在过去的几年中已经探索了替代策略，并且开发了许多具有ATP竞争性的mTOR抑制剂，这些抑制剂可阻断mTORC1和mTORC2的活性。与RAPA是mTORC1的特定变构抑制剂不同，这些与ATP竞争的抑制剂靶向酶的催化位点，从而促进了对mTOR的更广泛，更有效和持续的抑制，从而防止了由de引起的PI3K的激活。重要的是要考虑葡萄糖和谷氨酰胺是mTOR活化的驱动力，尤其是葡萄糖通过PI3K-AKT途径驱动GBM。因此，逃避mTOR抑制剂在临床试验中有限成功的另一种可能方法是使用靶向葡萄糖和谷氨酰胺的疗法来影响mTOR途径。然而，尽管抑制mTOR途径仍然是治疗GBM的有意义的靶标，但仍需要新的和更特异性的分子。
    　　 总之，这项研究的主要发现是，GBM肿瘤中39％的小胶质巨噬细胞激活了mTOR通路，而周围组织中这一比例为21％。研究人员还显示，在早期和晚期神经胶质瘤的体外模型中，mTOR的药理抑制作用可降低尿素水平和ARG1表达。由于普遍认为小胶质细胞激活的M2谱与肿瘤进展有关，因此可以预见mTOR抑制引起的具有细胞毒性和抗肿瘤活性的M1小胶质细胞的比例增加。mTOR抑制剂的其他抗肿瘤机制以及直接的抗增殖活性。
 
出国看病概况

海外医疗在国外发展较为成熟，比如在欧美等医疗技术发达国家，很多医院都设有国际病人办公室并配备多语种医学专业翻译人员，就医流程和模式都已相对成熟。在国内，海外医疗虽然还属于新兴行业，但发展势头迅猛，发展潜力巨大，市场前景广阔。
　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
出国看病适应症
靶向药物
 

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