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吉非替尼可改善靶向神经胶质瘤的治疗
  • 　　成胶质细胞瘤是一个积极的脑肿瘤具有高侵袭性及浸润，尽管采用外科手术和同时放化疗的标准护理疗法，但胶质瘤患者的预后仍然很差。各种异常的细胞信号传导途径有助于神经胶质瘤的恶性表现。在信号转导级联中，表皮生长因子受体起着关键作用。许多研究已证实，脑胶质瘤患者EGFR扩增和基因突变具有较短的中位生存时间。EGFR扩增和突变促进下游信号传导级联，包括的Ras/MAPK和PI3K/AKT途径活化，这是恶性神经胶质瘤增殖，侵袭，迁移和血管生成重要因素。靶向EGFR被认为是神经胶质瘤的一种有前途的治疗策略。选择性EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼已经报道了显示针对在临床试验胶质瘤效应的限制。主要因素之一是血脑屏障阻止Ge进入脑实质。因此，迫切需要找到更有效的方法来在整个BBB中运输Ge。增加高尔基磷蛋白3表达与更差差胶质瘤预后相关。先前发现GOLPH3下调促进了EGFR的内吞作用和降解，抑制了胶质瘤细胞的生长。同时使用阳离子脂质输送的GOLPH3siRNA消耗GOLPH3可以在体内外有效抑制神经胶质瘤细胞的生长。然而，在没有siGOLPH3清除或降解的情况下递送siGOLPH3，然后使其渗透到血脑屏障以被神经胶质瘤细胞吸收是一个巨大的挑战。基于纳米技术的药物输送系统可以帮助进入血脑屏障并克服神经胶质瘤治疗的上述挑战。据报道多种纳米颗粒可以穿透血脑屏障，包括脂质体，聚合物体和胶束。可以用各种靶向剂修饰纳米颗粒表面，以将疗法传递到中枢神经系统。血管肽-2，低密度脂蛋白受体1的特异性配体，已附着的纳米颗粒，以使穿过BBB和访问靶向神经胶质瘤。
    　　 在这项研究中，配制了经A2修饰以共同递送Ge和siGOLPH3的阳离子脂质-聚乳酸-乙醇酸纳米颗粒，用于神经胶质瘤的联合治疗。给予尾静脉的GOLPH3能够穿过BBB并通过受体介导的胞吞作用进入神经胶质瘤细胞。在这种联合疗法中，释放的Ge抑制了EGFP磷酸化，而siGOLPH3下调了GOLPH3的表达，从而进一步增强了EGFR的降解。U87和T98G胶质瘤细胞系购自细胞研究所典型培养物收集委员会。用荧光素酶基因转染U87-GFP-Luci细胞。将U87，T98G细胞和U87-GFP-Luci细胞在补充了10％胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基中进行培养。在37℃下在含有5％二氧化碳的潮湿气氛中以单层培养细胞。实验BALB/c裸鼠购自实验动物技术有限公司。所有小鼠均按照《实验动物的护理和使用指南》进行护理，动物实验规程得到医科大学动物护理和使用委员会的批准。
    　　 PLGA，DSPE-PEG2000-MAL，DOTAP和A2-DSPE-PEG2000-MAL完全溶解在DMSO中。将混合物加到一起并剧烈涡旋2分钟，然后在剧烈搅拌条件下滴入水溶液20分钟，然后在室温下轻轻搅拌2小时，从而配制了A2-改性的阳离子脂质-PLGA纳米粒子。通过用磷酸盐缓冲盐水透析12小时来纯化A2-N，以去除DMSO。使用上述方法用PLGA，DSPE-PEG2000，DOTAP，A2-DSPE-PEG2000和Ge制备A2-N/Ge。将siGOLPH3或NCsiRNA以2的氮/磷酸盐比添加到A2-N中。新鲜制备A2-N，A2-N/Ge和GOLPH3，它们的纳米颗粒使用MalvernZetasizerNanoZS测试了分子大小和Zeta电位。GOLPH3用2％磷钨酸染色，并用透射电子显微镜测试其形态，样品浓度为0.20mgmL-1。A2-N加载siRNA的能力是通过凝胶阻滞测定法测量的。使用含0.5ugmL-1的EtBr的2％琼脂糖凝胶在TAE缓冲液中进行凝胶电泳。实验以不同的N/P比进行，样品在110V下运行10分钟，然后使用UV曝光观察。在紫外透射检测器上观察结果。
    　　 使用UVevis分光光度计在338nm下测定A2-N/Ge中Ge的Ee和Lc。将具有不同Ge浓度的A2-N/Ge溶解在DMSO中，并使用DMSO溶液获得校准曲线。将含有0.225mgGe的一毫升A2-N/Ge溶液分配到3mLPBS中，并置于透析袋中。将透析袋置于50mL离心管中，并补充40mLPBS溶液。将离心管置于37°C下150rpm的振荡器上，以模拟Ge的体外释放。在给定间隔下分离出1mL释放的溶液后，将1mL相应的新鲜PBS加入离心管中。在不同时间点的吸收值为338nm。绘制了从A2-N/Ge释放的Ge的累积百分比与时间的关系。将人类BBBEChCMEC/D3细胞以6×104细胞/cm2的密度接种在明胶包被的0.4-um孔径的多孔板上，并生长48-72小时以达到融合。然后将新鲜培养基中的二十微升A2-N/Cy5-siRNA和N/Cy5-siRNA添加到顶室中。通过在10、30和120分钟的时间从底部室收集样品来确定NP的胞吞作用。使用荧光分光光度计，使用649nm的激发和670nm的发射，分析基室中Cy5的荧光浓度，一式三份制备实验条件。
    　　 将总共5×104个U87细胞接种在3.5厘米的培养皿中，并在5％二氧化碳于37°C孵育24小时。用浓度为1ugmL-1FAM-siRNA的A2-N/FAM-siRNA分别转染细胞2小时和4小时。然后，将细胞用Hoechst33342染色30分钟。内体和溶酶体用Lyso-TrackerRed染色30分钟。CLSM成像由FV10i进行。Lyso-TrackerRed，FAM-siRNA和Hoechst33342分别在577、480和352nm处激发。进行了qRT-PCR，以分析用不同处理的U87细胞中GOLPH3mRNA的表达水平。WB分析用于评估采用不同处理的U87细胞中GOLPH3，EGFR和p-EGFR蛋白的表达。将细胞与剂量为1ugml-1siRNA的PBS，Ge，A2-N/Ge/NCsiRNA，游离siGOLPH3，A2-N/siGOLPH3或GOLPH3孵育6小时。之后，再用DMEM高葡萄糖+10％FBS培养基替换培养基48小时。根据出国看病网研究人员先前的研究进行了qRT-PCR和WB测试。使用ImageJ软件对条带密度进行定量，以分析光密度测定结果。进行了三个独立的染色测试，所有数据均表示为平均值±标准差。
    　　 将U87和T98G细胞以5×103的密度接种在96孔板中，每组有8个重复孔。12小时后，将细胞与PBS，Ge，A2-N/Ge/NCsiRNA，游离siGOLPH3，A2-N/siGOLPH3或GOLPH3孵育，剂量为1ugmL-1siRNA，并孵育再持续48小时。将二十微升的MTT加入每个孔中，并孵育4小时。然后轻轻地除去液体，而不碰到紫色的甲maz，并用150uLDMSO溶解紫色的甲maz。最后，使用分光光度法在570nm的波长处获得光密度。进行了三个独立的实验。将U87和T98G细胞以每孔5×103个细胞的密度接种到96孔板中。之后，将细胞用1ugmL-1siRNA的PBS，Ge，A2-N/Ge/NCsiRNA，游离siGOLPH3，A2-N/siGOLPH3或GOLPH3处理24h。然后，出国看病网研究人员向每个孔中添加100uLEdU，然后在37°C下再混合2h。根据制造商的协议购买和使用Cell-LightEdUApollo567体外成像套件。
    　　 将裸鼠固定在立体定位仪上。将5uLLeibovitzL-15培养基中的5×105个U87-GFP-luci细胞注射入带有微量注射器的右纹状体中。注射时间为2分钟，并保持5分钟以上才退出。在第10天，在XenogenIVISSpectrum光学成像装置下观察裸鼠的荧光素酶荧光强度。然后，将小鼠随机分为3组。通过尾静脉分别注射PBS，游离Cy5-siRNA或A2-N/Cy5-siRNA。为了比较PBS，游离Cy5-siRNA的分布，器官和肿瘤部位的A2-N和Cy5-siRNA，在24h处死小鼠，切除大脑以及其他主要器官，如心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏，并对其进行切除。Xenogen光学成像设备，用于观察Cy5的强度。然后，切下脑，用于根据以前描述的方法来制备石蜡和冷冻切片。
    　　 U87-GFP荧光素酶荷瘤小鼠如上述建立的。在第10天，用XenogenIVISSpectrum光学成像装置使裸鼠异种移植模型成像。然后将这些小鼠随机分为6组。在第12、14、16和18天，每组均通过尾静脉注射PBS，Ge，A2-N/Ge/NCsiRNA，游离siGOLPH3，A2-N/siGOLPH3或GOLPH3。在第20天和第30天，再次给裸鼠拍照并分析荧光值。每两天记录一次裸鼠的存活和体重。体内荧光成像，总通量，相对肿瘤抑制率，体重曲线和存活曲线用于评估不同治疗的治疗效果。在第35天，从每组中随机选择2只裸鼠，切除它们的主要器官并变成H＆E染色石蜡切片以进行器官安全性评估。这些部分由EVOSFLAuto拍摄。制备厚度为10um的切片。进行EGFR和GOLPH3免疫荧光。一抗在4°C下孵育过夜，然后在室温下将荧光标记的二抗）孵育1小时。使用phenylindole标记细胞核。用荧光显微镜观察荧光，并用软件分析。实验结果以所有值的形式给出，在图中显示为平均值±SD。使用Student'st检验进行统计学分析，而P小于0.05被认为是显着的。ns表示P大于0.05，*表示P小于0.05，表示P小于0.01，并且表示P小于0.001。
    　　 构造Al2-N/Ge/siGOLPH，通过直接沉淀法制备A2-N/Ge，并且通过静电吸引将siGOLPH3装载到A2-N/Ge上以形成GOLPH3。A2-N/Ge具有很强的结合siGOLPH3的能力，以2：1的N/P比形成完整的复合物，而在凝胶中没有游离的siGOLPH3。TEM显示GOLPH3脂质体约60nm且分散良好。A2-N，A2-N/Ge和GOLPH3的平均大小分别为87.50、73.02和79.19nm。A2-N，A2-N/Ge和GOLPH3的Zeta电位分别为58.40、57.80和20.08mV。Ge在A2-N/Ge中的包封率和负载量分别为87％和6wt％。使用溴化乙锭染料测定法，siGOLPH3对A2-N的负载效率为83.40％。为了研究A2-N/Ge中Ge的释放，出国看病网研究人员在体外进行了模拟药物释放实验。释放曲线表明，24小时后51％的Ge被释放到PBS中。与单独使用N相比，A2-N能够更好地穿越BBB的体外模型。用A2-N/FAM-siRNA处理的U87细胞的细胞内荧光水平比用N/FAM-siRNA处理的U87细胞表现出更高的绿色荧光，表明A2增强siRNA的细胞内摄取。流式细胞仪结果为A2-N/FAM-siRNA的细胞摄取能力提供了其他证据。A2-N/FAM-siRNA的高内体逃逸能力对基因表达的siRNA沉默至关重要。与A2-N/FAM-siRNA孵育2和4小时后，监测内膜逃逸情况。孵育2小时后，多个绿色信号与红色信号重叠，表明A2-N/FAM-siRNA通过内吞途径进入细胞。与A2-N/FAM-siRNA孵育4小时后，绿色和红色信号几乎没有重叠，表明大多数siRNA从内体中逸出。
    　　 通过qRT-PCR测量GOLPH3的基因沉默能力。用GOLPH3和A2-N/siGOLPH3处理的U87细胞可以使神经胶质瘤细胞中GOLPH3基因的表达沉默，导致GOLPH3mRNA的敲低分别为65.12％和58.92％。A2-N/Ge/NCsiRNA，PBS和免费的siGOPLH3处理几乎没有沉默能力。通过WB分析也证实了siGOLPH3介导的GOLPH3蛋白的下调。同时，A2-N/siGOLPH3和GOLPH3之间的GOLPH3基因或蛋白质表达没有显着差异，表明Ge不会影响GOLPH3基因的表达。出国看病网研究人员还通过WB检查了U87细胞中EGFR蛋白的表达。A2-N/siGOLPH3和GOLPH3处理导致EGFR蛋白表达下调27.39％和33.26％。用PBS，Ge，A2-N/Ge/NCsiRNA和游离siRNA处理不会改变EGFR蛋白的表达。Ge和A2-N/Ge/NCsiRNA分别将p-EGFR蛋白水平下调39.57％和44.32％，而A2-N/siGOLPH3和A2-下调p-EGFR蛋白水平。N/Ge/siGOLPH3分别为27.34％和76.93％。这表明GOLPH3表现出较强的GOLPH3沉默能力，进一步促进了EGFR的内吞作用和降解。此外，GOLPH3与Ge和siGOLPH3协同下调p-EGFR。
    　　 GOLPH3对U87和T98G神经胶质瘤细胞的生存力具有最大的影响。用A2-N/Ge/NCsiRNA或GOLPH3孵育的U87细胞的存活率分别为52.50％和34.58％。相反，用A2-N/siGOLPH3或Ge处理的细胞的存活率分别为78.50％和57.93％。但是，PBS和游离siGOLPH3几乎没有作用。证明GOLPH3对T98G细胞表现出最强的抗肿瘤作用。EdU增殖试验用于进一步确定GOLPH3的抗增殖作用。与用A2-N/Ge/NCsiRNA处理的U87细胞相比，对于GOLPH3观察到了针对U87神经胶质瘤细胞的最强抑制作用。与用PBS，Ge处理的T98G细胞相比，用GOLPH3处理的T98G细胞的EdU阳性细胞百分比明显较低。A2-N/Ge/NCsiRNA，游离siGOLPH3或A2-N/siGOLPH3。结果表明，GOLPH3在体外显着促进神经胶质瘤细胞凋亡并抑制其增殖。
    　　 进一步验证GOLPH3的体内成像和抗肿瘤治疗能力。体内成像结果支持了出国看病网研究人员的假设，即由于添加了A2，A2-N/Cy5-siRNA可以靶向神经胶质瘤细胞。A2是LRP-1的特异性配体，可以穿过BBB和靶向神经胶质瘤。用PBS，游离Cy5-siRNA和A2-N/Cy5-siRNA处理的神经胶质瘤的体内荧光素酶荧光水平证实了动物具有相同体积的脑神经胶质瘤。在用A2-N/Cy5-siRNA处理的组中观察到最强的Cy5荧光信号，表明A2-N/Cy5-siRNA在脑肿瘤组织中积累。相反，用游离Cy5-siRNA处理的小鼠在神经胶质瘤中几乎没有显示Cy5-siRNA荧光分布。收集其他主要器官并用体内成像系统观察。结果表明，游离Cy5-siRNA在24小时内迅速且广泛分布。但是，用A2-N/Cy5-siRNA处理的小鼠的肝脏和肾脏具有更高的强度。然后通过荧光显微镜观察了Cy5-siRNA在小鼠脑组织冷冻切片中的分布。在A2-N/Cy5-siRNA组中，更多的Cy5-siRNA红色荧光与DAPI染色的神经胶质瘤细胞核荧光信号重叠。相反，游离的Cy5-siRNA组在神经胶质瘤组织中仅显示出有限的Cy5荧光分布。在CLSM观察到的冷冻肿瘤组织切片中证实了PBS，游离Cy5-siRNA，N/Cy5-siRNA和A2-N/Cy5-siRNA的分布。从DAPI染色的细胞核以蓝色表示的神经胶质原纤维酸性蛋白的绿色表示，脑肿瘤组织被确定为高细胞区域。注射A2-N/Cy5-siRNA的小鼠比注射PBS，游离Cy5-siRNA和N/Cy5-siRNA的小鼠具有更多的Cy5荧光，表明A2-N改善了Cy5-siRNA向脑肿瘤的递送。。这些结果表明，A2-N可以在体内穿过血脑屏障并进入神经胶质瘤组织。
    　　 为了进一步验证GOLPH3的抗肿瘤生长作用，用PBS，Ge，A2-N/Ge/NCsiRNA，游离siGOLPH3，A2-N/siGOLPH3或A2-N处理神经胶质瘤模型裸鼠/Ge/siGOLPH3。荧光素酶生物发光用于监测肿瘤的生长。在第30天，与第10天相比，注射PBS，Ge或游离siGOLPH3的肿瘤中的信号分别高202倍，117倍和199倍。与使用A2-N/Ge/NCsiRNA，A2-N/siGOLPH3或GOLPH3处理的小鼠相比，小鼠的肿瘤生长率分别为17倍，47倍和7倍。第10天。用GOLPH3处理的小鼠的体重缓慢下降，而其他组的体重迅速下降。用PBS，Ge，A2-N/Ge/NCsiRNA，游离siGOLPH3，A2-N/siGOLPH3或GOLPH3处理的小鼠的中位生存时间为34.50、35.50、40.50、37.50、41和45天分别。用GOLPH3治疗的小鼠的中位生存时间长于其他组。此外，出国看病网研究人员证实了A2-N/Ge/siGOLH3在体内下调了GOLPH3和EGFR的表达。这些结果表明GOLPH3显示出强的抗神经胶质瘤功效。与PBS组相比，大脑，心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏的H＆E染色未显示任何形态学组织变化。这些结果表明，A2-N/Ge/siRNA具有生物相容性并具有潜在的生物学应用。
    　　 胶质母细胞瘤是成人中最致命的脑瘤。最近的分子医学的发展已经提高了它的初始pathophcs。根据癌症基因组图谱数据库，有57％的神经胶质瘤患者具有EGFR过表达，并且以EGFR为靶点的治疗被认为是一种有前途的治疗策略。已经为神经胶质瘤开发了多种EGFRTKI，例如Ge和厄洛替尼，并已在I/II期研究中进行了评估。然而，对于原发和复发胶质瘤患者几乎所有相关的临床试验成效甚微。他们的失败是出乎意料的考虑EGFR扩增的神经胶质瘤中的患病率，并造成这种失败的最显著因素是靶抑制不足和耐药性。大量研究表明，EGFR内吞作用的增强和降解可以抑制神经胶质瘤细胞的生长。GOLPH3最初被鉴定为定位于高尔基池的反面的外周膜蛋白。先前显示GOLPH3在神经胶质瘤中上调，并且该蛋白通过调节EGFR转运介导神经胶质瘤细胞增殖。进一步证明通过将siGOLPH3与阳离子脂质体一起递送，GOLPH3可以作为一种新的神经胶质瘤靶标。通过增强EGFR的内吞作用和降解来抑制EGFR信号通路可能更有效地阻止神经胶质瘤的生长。
    　　 Ge和siGOLPH3共同交付用于靶向神经胶质瘤治疗的主要障碍是BBB的存在及其自身的化学性质。siRNA带负电且亲水，这使其无法穿过生物膜，并使它们易于在体内快速酶促降解。同时，锗被缓慢吸收并广泛分布于全身，这导致较低的生物利用度和严重的副作用。阳离子脂质聚合物是抗肿瘤药物和核酸治疗的常用载体。在这项研究中，开发了一种A2改性的阳离子脂质PLGA纳米颗粒，以共同递送Ge和siGOLPH3。PLGA由于其低的生物降解性和最小的毒性而被广泛用作药物载体。DOTAP修饰的PLGA可以提高siRNA的吸附能力和内体逃逸。DSPE-PEG2000是一种两亲性线性聚合物，PEG修饰的脂质体制剂可以增加血液循环时间并改善脂质体的被动靶向性。A2的结构从Kunitz结构域，其类似于LRP-1中的BBB和神经胶质瘤细胞即过表达衍生。ANG1005由通过酯键与A2共轭的三个紫杉醇分子组成，是临床上第一种用于治疗颅内转移性肿瘤的药物。
    　　 A2-N的直径和ζ电势分别为87.50nm和58.40mV。A2-N上的正电荷有利于核酸。凝胶阻滞试验表明，A2-N具有很强的结合siGOLPH3的能力。体外细胞摄取实验还证明，GOLPH3成功地向神经胶质瘤细胞传递了更多的Ge和siRNA，并具有更强的内体逃逸能力。成像中A2-N/Cy5-siRNA的体内分布进一步证实了A2-N可以穿过血脑屏障。MTT和EdU分析证实GOLPH3在体外可有效促进细胞凋亡并抑制神经胶质瘤细胞增殖。多个酪氨酸残基的自磷酸化发生在C末端区域，并且此事件是由EGF或其他生长因子触发的。这些自动磷酸化启动多个信号级联，并导致DNA合成和恶性细胞的增殖。在研究中GOLPH3在细胞内化后同时释放了Ge和siGOLPH3，因此与单独使用任一治疗相比，它们均显示出更高的协同抗肿瘤活性。进行qRT-PCR和WB分析，以阐明其抗增殖活性的机制。siGOLPH3显着沉默了胶质瘤细胞中GOLPH3基因的表达。GOLPH3的下调增强了EGFR的内吞作用和降解。WB显示U87细胞中EGFR蛋白表达降低。此外，释放的Ge有效抑制p-EGFR，这是Ge作为TKI与siGOLPH3共同发挥作用的主要机制。体内实验还表明，siGOLPH3和Ge的共同递送可以提高荷瘤裸鼠的存活率。
    　　 这种联合治疗的中度疗效有两个主要原因。一方面，U87是一种PTEN突变的神经胶质瘤细胞系，其中由于PTEN功能的丧失，下游靶标激活可抵消EGFR抑制。另一方面，在培养的神经胶质瘤细胞中EGFR的扩增和突变经常丢失。在EGFR因此，出国看病网研究人员的做法很可能显示出增强的效应放大肿瘤。总之开发了一种新颖，安全，有效的神经胶质瘤治疗策略。但是，其具体的临床效果需要进一步研究。
 
出国看病概况

海外医疗在国外发展较为成熟，比如在欧美等医疗技术发达国家，很多医院都设有国际病人办公室并配备多语种医学专业翻译人员，就医流程和模式都已相对成熟。在国内，海外医疗虽然还属于新兴行业，但发展势头迅猛，发展潜力巨大，市场前景广阔。
　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
出国看病适应症
靶向药物
 

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