出国看病
 
胶质母细胞瘤细胞的间质转化
  • 　　多形胶质母细胞瘤是最恶性的原发性脑肿瘤，预后仍然不佳。基于GBM组织分析分子亚型已被鉴定，并且三个主要转录亚型是古典，原神经和间充质。所述MES亚型具有炎症相关基因高表达。由于GBM亚型是使用肿瘤组织样品定义的，因此非恶性细胞有助于表达。然而，特别是炎症相关MES亚型和PN亚型的分子特征，也存在于分离的培养的肿瘤细胞。因此，GBM细胞本身有助于MES表达谱的炎性特征。不同亚型出现在同一个病人的肿瘤内共存，和GBM肿瘤细胞中中间PN-MES细胞州已经在克隆和单细胞水平被检测到炎症反应，STAT3和NF-κB，在原型转录介体可以发起GBM细胞培养物的MES过渡，原神经-间质转变。在很多方面GBMMES过渡过程出现类似物上皮-间质转化，这是在伤口愈合和驱动器增加侵袭，转移和治疗抗性必不可少。同样，当比较不同患者的培养物和比较同一患者的克隆神经胶质瘤起始细胞培养物时，治疗抵抗力的提高与GBM细胞中的MES样表达谱相关。
    　　 在中枢神经系统生理学中，星形胶质细胞保持体内稳态，并且在疾病和健康中对组织结构具有重大影响。响应中枢神经系统损伤，星形胶质细胞可以进入反应性细胞状态，这一过程也称为星形胶质细胞增生/星形胶质细胞增多症。诱导反应的信号包括促炎细胞因子，例如肿瘤坏死因子α和白介素1beta。反应性星形胶质细胞通过调节血脑屏障和产生细胞因子/趋化因子，在协调神经炎症反应中起关键作用。它们还具有条件性MHCII类抗原呈递能力。通过分泌例如生长因子，ECM成分和形态发生素，反应性星形胶质细胞也控制中枢神经系统伤口愈合过程。像星形胶质细胞一样，神经胶质瘤细胞可以产生细胞因子/趋化因子，有条件的MHCII类抗原呈递能力，并对微环境产生广泛影响，包括免疫编辑。GBM细胞激活炎症基因程序的这种能力可能与其遗传的胶质细胞特性有关。GBM细胞和星形胶质细胞之间的相似性进行了说明，但是在这项研究中，扩展了对这种相似性的生物学理解。出国看病服务机构发现，星形胶质细胞进入反应状态时打开的基因程序与GBM的MES亚型和类似MES的GIC中上调的基因有很大的重叠。此外，GBM细胞中反应性星形胶质细胞相关基因表达的变化是自然发生的肿瘤内异质性和治疗耐药性克隆变化的主要组成部分。将对治疗敏感的PN样GIC克隆暴露于IL1B诱导的反应性星形胶质细胞相关基因集，并在表观遗传上将克隆重编程为更具治疗抵抗力的MES样状态。因此，出国看病服务机构建议使用术语“反应性GIC”，将与MES相关的GIC异质性置于生物学环境中。
    　　 原始克隆库，是由区域伦理审查委员会从成人GBM患者在乌普萨拉大学医院患者知情同意和批准后新鲜肿瘤样本得出。GICs在层粘连蛋白包被的细胞培养皿上的无血清神经干细胞培养基中生长。在补充有2％胎牛血清和1％星形胶质细胞生长补充剂的AM培养基中培养来自大脑皮层的原代人星形胶质细胞。细胞用1或10ng/毫升TNFα和10ng/毫升IL1B处理。提取总RNA，并使用高容量RNA转cDNA试剂盒逆转录1ugRNA。QPCR使用Taqman探针使用CFX96系统进行。从出国看病服务机构的电阻签名，从六个GIC克隆文库的组合签名，以及基因特异性上/在U3065MG下调和U3117MG克隆文库。MX1，CCL2和CSF1被选作促炎应答基因。Metascores的计算方式为Sum–Sum。使用用于人类转录组阵列2.0阵列的标准方案分析转录组。使用稳健的多阵列平均值在Affymetrix表达控制台中对数据进行标准化。使用InfiniumMethylationEPICDNA分析BeadChip分析DNA甲基化。根据制造商的协议，在人源抗体阵列上分析亚融合细胞培养物中的条件培养基和细胞裂解液。根据GeneCards中的信息和文献搜索。
    　　 细胞在RIPA裂解缓冲液中裂解，并在NuPage4-12％Bis-Tris凝胶上运行。为了分析分泌的蛋白质，根据ThermoFisher的规程，使用冷丙酮沉淀条件培养基，并将蛋白质沉淀溶解在RIPA裂解缓冲液中。使用的抗体是NFκBp65，磷酸化NFκBp65，亲环蛋白B，beta-肌动蛋白，血小板反应蛋白-1，Galectin-3，IGFBP-7，NCAM-1和辣根过氧化物酶标记的第二抗体。处理前24小时，将细胞接种在层粘连蛋白包被的384孔板中。将细胞以七种不同剂量暴露于替莫唑胺，美氟芬，伊立替康，依托泊苷和吉西他滨72小时。将药物溶解在DMSO中，并用DMSO处理对照培养物。使用荧光微培养细胞毒性试验方案测量细胞存活率。
    　　 为了检查MESGBM转录组概况与神经炎症过程中星形胶质细胞反应之间的联系，建立了一个体外模型来研究星形胶质细胞向反应性细胞状态的转变。培养的人原代星形胶质暴露于TNFα或IL1B，这就造成了NFkB激活以及耦合到促炎反应，基因的上调CSF1，CCL2，和MX1。接下来分析了长期用IL1B治疗期间整个转录组的变化。GSEA使用MSigDB标志性基因集清楚地表明了涉及免疫应答和炎症的过程。总体而言，分子反应证明了体外模型系统捕获的星形胶质细胞转变成更具反应性状态。调查了反应性星形胶质细胞中GBM亚型分类基因的表达是否发生了改变。观察到在经IL1B处理的星形胶质细胞中，MES基因集具有明显的GSEA富集，相反，在未经处理的细胞中，PN基因集却富集。这种模式对应于什么通常见于培养的GBM细胞时它们经受PMT。类似的PN-MES移也被看作应用从小鼠反应性星形胶质三次公开数据集MES和PN签名时：星形胶质细胞暴露在体外对TNFα，暴露在体内全身注射细菌LPS，或从基于脑中动脉闭塞的实验性卒中模型中诱发缺血。
    　　 为了进一步加强MES信号与星形胶质细胞反应状态之间的联系，出国看病服务机构进行了倒数分析。从为期12天的星形胶质细胞IL1B刺激实验中提取了一个基因签名，并在GBM数据集中比较了其变异性。此外，出国看病服务机构使用了来自体外体内激活的小鼠星形胶质细胞数据集的两个签名LPS和MCAO诱导。与来自癌症基因组图谱的GBM组织样本以及大量PN和MES分类的GIC细胞培养物中的其他亚型相比，这些反应性星形胶质细胞基因特征显示出MES亚型的明显富集。总而言之，出国看病服务机构的数据表明，GBMMES表达特征与星形胶质细胞进入反应性细胞状态时诱导的基因之间存在很大的相似性。
    　　 上面确定了星形胶质细胞转变为反应性状态与GBMMES亚型之间的联系，即不同GBM患者之间的分子变异性。先前已经显示了GBM中明显的克隆异质性，这与多药耐药的变化有关。抗性与分子标记相关，而分子标记又与MES标记密切相关。因此，接下来研究了治疗抗性的肿瘤内异质性是否也反映在反应性星形胶质细胞基因程序的可变表达中。用来研究肿瘤内异质性功能的模型系统由来自六个外科GBM样本的克隆GIC培养库组成。每个文库以细胞状态连续梯度的形式捕获分子变异性，一端具有抗性的MES样细胞，而另一端具有敏感的PN样细胞。对114个GIC克隆进行了GSEA，这些克隆按其抗性签名使用了三个反应性星形胶质细胞签名进行排序：出国看病服务机构的反应性星形胶质细胞签名以及来自体外TNFα刺激的小鼠星形胶质细胞数据集和来自体内LPS诱导的反应性星形胶质细胞数据集。该策略揭示了增加的克隆治疗抗性和与星形胶质细胞反应性相关的基因表达之间的紧密联系。此外，MSigDB具有标志性的GSEA突出显示了在IL1B处理的星形胶质细胞中也发现了许多过程。耐药的GIC克隆和经IL1B处理的星形胶质细胞之间富集标记的重叠广泛。因此，患者体内GIC在治疗抗性方面的异质性与反应性星形胶质细胞中表达的基因程序紧密相关。
    　　 为了直接将GBM细胞异质性与星形胶质细胞反应性联系起来，出国看病服务机构还分析了代表急性分离的GBM细胞的单细胞RNA-seq数据集。当在此数据集中使用来自出国看病服务机构的反应性星形胶质细胞签名的可用基因时，观察到从均匀低表达到均匀高表达的梯度。另外，该数据集揭示了反应性星形胶质细胞信号的平均得分和耐药性信号的平均得分之间有很强的相关性。因此，在GIC克隆和GBM肿瘤样品的单细胞分析数据中，治疗耐药性的异质性似乎都与星形胶质细胞的反应状态有关。总之，将GBM中与治疗抗性相关的肿瘤内异质性与反应性星形胶质细胞基因程序的不同表达联系起来。在功能特征性克隆GIC培养库和单细胞GBM数据中，这种联系都是显而易见的。
    　　 星形胶质细胞是中枢神经系统环境的重要贡献者，它们通过蛋白质分泌发挥许多功能。因为发现GBM肿瘤内异质性，克隆疗法耐药性和星形胶质细胞反应性状态之间存在相似之处，所以在蛋白质水平上研究了GIC多样性，重点是分泌蛋白和细胞表面蛋白质。使用抗体阵列分析了敏感克隆U3065MG-C271和抗性克隆U3065MG-C475的条件培养基和细胞裂解液。差异表达的蛋白质被分配到功能类别中，最大的是趋化因子，白介素，TNF家族成员，TGFB家族蛋白，生长因子和ECM相关蛋白。抗性克隆的表达水平高于许多促炎蛋白，包括巨噬细胞招募趋化因子，白介素和一些TNF家族成员。淋巴毒素α和B，半乳凝素3和OX40配体）。在抗性克隆中也发现了许多在抗性克隆中上调的蛋白质。这些三-的GBM容器标记IGFBP7，和MES相关血小板反应蛋白和半乳凝素通过Western印迹分析证实。像反应性星形胶质中，抗性克隆也表达高水平的ECM相关蛋白和许多这些蛋白质的被链接到MES过渡或EMT。这一发现与以前的GSEA标志性反应性星形胶质细胞和抗药性MES样GIC克隆的分析结果相符，这些克隆突出了EMT，炎症和干扰素反应以及与组织修复相关的其他过程。
    　　 与抗性克隆相比，敏感克隆表达了更多的PN相关蛋白NCAM。它还分泌了较高水平的几种具有抗炎作用的蛋白质，包括两种NFκB抑制蛋白–SLPI和脂联素。其他例子包括TGFB信号传递衰减因子vasorin，它可以预防乳腺癌细胞系EMT，以及巨噬细胞抑制性细胞因子1/GDF。有趣的是，在敏感克隆的条件培养基中，出国看病服务机构检测到了几种白介素受体，可能充当白介素清除剂。总之，与来自同一肿瘤的敏感PN样克隆相比，抗性MES样克隆表达并释放了更多的蛋白质，促进炎症和组织修复。该发现与EMT，反应性星形胶质细胞和抗性标记之间的分子相似性相符。
    　　 肿瘤内GIC异质性与反应性星形胶质细胞基因程序之间的联系表明，GIC细胞状态类似于反应的不同阶段，其中抗性克隆的反应性最高。与此相一致，促炎性刺激已被证明可以增加批量培养的MES特性。为了检验GIC异质性在治疗反应中与星形胶质细胞反应性变化有关的假设，出国看病服务机构将敏感的PN样克隆U3065MG-C271暴露于促炎细胞因子TNFα和IL1B。与在原代人星形胶质细胞中看到的相似，NFκB被激活。选择IL1B进行长期治疗，导致促炎反应基因CSF1上调，CCL2和MX1。与未处理的细胞相比，该处理还诱导了U3065MG-C271细胞更平滑和扁平的形态，这种形态在出国看病服务机构的克隆文库中的抗性克隆中通常观察到，可能与ECM-的表达增加有关。接下来，出国看病服务机构以长达42天的时间序列分析了经IL1B处理和未处理的细胞的转录组。MSigDB标志GSEA显示了与炎症相关的过程的激活，并且与反应性星形胶质细胞的丰富标志和耐药性GIC标志广泛重叠克隆。此外IL1B对敏感克隆的治疗诱导了星形胶质细胞的反应性基因签名，PN-MES移位和抗性签名的表达增加。所选基因已通过RT-qPCR确认。在IL1B处理后，耐药克隆相关/反应性星形胶质细胞相关蛋白galectin，IGFBP7和血小板反应蛋白被上调，而PN/敏感克隆相关蛋白NCAM-1被下调。
    　　 令人惊讶的是，即使经过一个月的IL1B治疗，过渡过程仍很缓慢，并且尚未趋于平稳。在这一点上，敏感克隆已经达到了最抗性克隆所具有的MES特征强度的一半左右。为了研究这种细胞状态变化的稳定性，出国看病服务机构在长期暴露后撤回IL1B13天。释放的细胞仍然表达较高水平的抗性/MES相关基因和较低水平的敏感性/PN相关基因与未处理的对照组相比，但未达到暴露于IL1B的细胞的程度。在蛋白质水平上看到了相同的模式。这表明细胞部分向其原始细胞状态漂移，表明该过程是可逆的。出国看病服务机构以前已经发现具有MES特性的克隆具有改变的DNA甲基化谱，并定义了正和负甲基化签名。这可能反映了表观遗传的稳定机制。使用这些标记，发现在IL1B处理后，敏感克隆的DNA甲基化模式明显向耐药克隆的DNA甲基化模式转移。至于转录组标记，经过一个月的IL1B处理后，DNA甲基化标记的移动缓慢，并且变化幅度小于最抗性克隆的一半。总之，GIC克隆与星形胶质细胞对促炎刺激的反应相似，并且诱导的变化与先前观察到的克隆GIC异质性密切相关。但是，重编程速度很慢，即使经过1个月的处理，敏感克隆仍未达到高抗性克隆的分子谱，并且该过程看起来是可逆的。
    　　 IL1B处理诱导了敏感克隆U3065MG-C271中的分子耐药性特征，这表明该克隆对治疗的抵抗力增强。为了从功能上解决这一分子转变，出国看病服务机构使用第一线GBM治疗药物TMZ进行了剂量反应分析。抗性克隆U3065MG-C475被用作评估IL1B处理的敏感克隆的药物敏感性潜在变化水平的参考。长期的IL1B治疗确实使U3065MG-C271对TMZ具有更高的抗药性，但未达到抗药性克隆所具有的水平，这一发现与分子数据。为了进一步扩大分析范围，出国看病服务机构从另一个克隆文库中选择了另外两个克隆，即敏感克隆U3117MG-C568和耐中间治疗的克隆U3117MG-C232。将克隆用IL1B处理2周，并使用一组抗药性和敏感性相关的RT-qPCR标记物，确认了与U3065MG-C271类似的分子移位。在蛋白质水平上，IL1B处理未诱导U3117MG克隆中反应性/抗性/MES相关蛋白galectin-3和血小板反应蛋白-1的表达发生变化，但是敏感性/PN相关NCAM-1被下调。接下来使用四种细胞毒性剂：TMZ，伊立替康，依托泊苷和吉西他滨研究了IL1B处理对所有三个克隆的药物反应的影响。由于U3117MG克隆库通常对TMZ的响应较差，因此出国看病服务机构为U3117MG克隆添加了另一种烷基化剂melflufen。在IL1B处理后，所有三个克隆对四种药物的耐药性均增加。敏感克隆U3117MG-C568的抵抗水平提高到类似于中间克隆U3117MG-C232的起点。对细胞毒剂的耐药性增加可能是由于增殖率下降所致。但看不到经IL1B处理的细胞和未经处理的细胞之间的增殖速率没有任何差异。总之，出国看病服务机构得出结论，长期用IL1B处理克隆GIC培养物引起的反应性和MES相关分子变化与GIC耐药性增加有关。
    　　 MESGBM亚型签名显示与表征反应性星形胶质细胞状态的基因程序有很大的重叠。此外，发现GBM中的MES过渡在很大程度上涉及诱导性星形胶质细胞基因组的诱导。这些发现与以前的研究，其中TNFα和NFκB通过，STAT和相关的炎症通路的信令已经显示出诱导MES基因在GBM细胞合身。因此，像星形胶质细胞一样，GIC似乎具有从基底细胞状态转变为反应性细胞状态的能力，从生物学上讲，MES样GIC可以被称为“反应性GIC”。作为该观察结果的扩展，GBM细胞的分子内肿瘤异质性的主要部分可以描述为反应性表型的变异。GIC进入这种反应状态的能力可能是其起源细胞的传承，可能与星形胶质细胞位于同一发育分支，或者在肿瘤进展过程中被劫持。然而，与星形胶质细胞反应性的联系为GIC中的PMT过程提供了生物学背景。通过结合这些相关研究领域的结论，也有可能出现新的，尚未探索的研究思路。反应性星形胶质细胞不均匀，它们既可以支持也可以阻碍CNS的恢复。它们的表型部分取决于所述触发事件，该事件指示下游炎性信号之间的平衡通路。而NFκB信号传导的显性具有神经毒性副作用，STAT介导的反应性是根本创建营养和更少的炎症环境。因此，神经胶质瘤细胞，以模拟星形胶质细胞的反应性的能力可能在塑造一个肿瘤促进微环境中起重要作用。刺激反应的信号可能既来自GIC本身，也来自微环境中的周围细胞。像星形胶质细胞一样，GIC可能会以不同方式“反应”，具体取决于这些刺激信号的整合方式。
    　　 出国看病服务机构以前曾报道过，GBM瘤内克隆的MES特征和治疗耐药性均表现为表观遗传而不是基因调控。该结论基于“半稳定”的克隆行为以及DNA甲基化模式的相关变化，其中包括MES驱动基因。反应性星形细胞增多症是表观遗传调控的，但需要进一步研究。然而，充分表征和PMT相关EMT过程被称为一个表观遗传调节的渐进多步骤的过程，这也已被链接到治疗的抗性。在本报告中，出国看病服务机构从分子角度剖析了促炎刺激如何诱导缓慢重编程为反应性状态，并增加了耐药性并相应改变了DNA甲基化模式。这例证了外部信号如何向下投射到GIC的表观遗传状态的转变。需要进一步的研究来破译不同线索如何控制GIC反应性和治疗抵抗力。如何反应GIC细胞状态链接到治疗的抗性可能是多因素的，包括增殖，ABC转运的诱导，并提高代谢异生物质减少。炎性区域是苛刻和介导更高的韧性可能已经共同进化与链接到炎症应答和组织修复的基因的表达的细胞功能的活化。即使没有在GIC的治疗性和MES字符之间有明显的联系，所述MESGBM亚型仅微弱地链接到预后更差。这可能是由于同一肿瘤中不同亚型的共存，使得单个患者活检无法代表肿瘤或非肿瘤细胞对所测转录谱的贡献。还应该注意的是，目前的治疗方法对几乎所有患者而言都是无效的。从治疗的角度看，一种有吸引力的策略是采用抵消反应性GIC细胞状态的预处理来降低GBM细胞的耐药性水平。该策略可能涉及抗炎成分，可能是针对其他中枢神经系统疾病开发的。在例如神经退行性疾病的研究领域中，正在探索针对星形胶质细胞反应性的策略。例如，已经证实，前炎症信号传导的拮抗作用potentiatesGBM的放射治疗的小鼠中的效果。抵消GIC反应性也可能有助于打破肿瘤产生的免疫抑制环境，并促进免疫细胞清除肿瘤细胞。这可能会增强迄今为止在GBM43中基本上失败的免疫治疗方法。随着对反应性GIC如何引导微环境以及反应性如何与治疗耐药性相关的了解增加，结合这些原理的方案可能会发展。总而言之，出国看病服务机构在这里为所谓的GICMES过渡提供了生物学背景，因为它模仿了反应性星形细胞增多过程，并且出国看病服务机构建议使用术语“反应性GIC”。出国看病服务机构提供了有关如何诱导GIC克隆进入反应性状态以及特定表观遗传修饰的详细分子表征，并且出国看病服务机构预测针对GBM肿瘤细胞的炎症反应可能是根除治疗耐药性克隆的策略。
 
出国看病概况

海外医疗在国外发展较为成熟，比如在欧美等医疗技术发达国家，很多医院都设有国际病人办公室并配备多语种医学专业翻译人员，就医流程和模式都已相对成熟。在国内，海外医疗虽然还属于新兴行业，但发展势头迅猛，发展潜力巨大，市场前景广阔。
　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
出国看病适应症
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