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胶质瘤甲基化低状态
  • 　　异柠檬酸脱氢酶1和2的杂合错义突变是世界卫生组织II级和III级神经胶质瘤中最常见的遗传病灶，其引起D-2-羟基戊二酸的病理性积累在这些肿瘤中。D-2HG与α-KG具有结构相似性，可调节α-酮戊二酸依赖性酶的活性，并通过这种机制引起染色质结构和基因表达的致瘤性改变。这些IDH1之一与突变相关的表观遗传学变化是神经胶质瘤CpG岛甲基化者表型，它是在WHO，II，III和IV级神经胶质瘤中发现的主要基于基因启动子的CpG岛超甲基化的一种模式，其中IDH突变通常发生。在以前的报道中，利用七个与pneuralG-CIMP阳性状态最紧密相关的基因中的CpG启动子甲基化，将胶质母细胞瘤肿瘤分类为G-CIMP阳性。尽管甲基化的G-CIMP模式通常在肿瘤复发时是稳定的，但G-CIMP阳性肿瘤中DNA甲基化有特定的下降，对预后具有重要意义。具体而言，在低级和高级肿瘤中均已鉴定出G-CIMP阳性星形胶质细胞胶质瘤低甲基化模式，称为G-CIMP-low。这种模式显示了CpG公海中低甲基化的富集，CpG公海定义为距任何带注释的CpG岛超过4公里的区域。对于低表型的G-CIMP，使用131CpG探针对患者肿瘤进行分类，这些探针在IDH子集中被低甲基化先前已分类为G-CIMP阳性的多变型肿瘤。此外，与G-CIMP高肿瘤相比，G-CIMP低状态与较差的生存率相关。因此，了解导致G-CIMP低表型上升的遗传和环境因素是了解神经胶质瘤肿瘤进展和预后的重要研究领域。
    　　 最近，尝试鉴定IDH1突变型神经胶质瘤进展的尝试已发现继发性胶质母细胞瘤中IDH1基因的拷贝数变化。这些拷贝数变化包括的野生型等位基因的损失IDH1，的突变体等位基因的缺失IDH1，以及任一等位基因。突变IDH1等位基因的丢失也伴随着G-CIMP-low-likeDNA甲基化表型的获得，这导致了这样一个假说，即依赖IDH1的D-2HG突变体的生产损失是G-CIMP-低DNA甲基化模式的一种途径。以往的文献还表明，致癌IDH1突变并不严格要求的不断增殖IDH1-mutant神经胶质瘤细胞在体外，并在体内原位异种移植物。利用这一发现来设计具有内源杂合WT患者源性神经胶质瘤细胞系的同基因细胞系模型，并产生R132H或野生型IDH1的敲除等位基因。无论是突变体或野生型的丧失IDH1足以抑制d-2HG生产）。利用这些基因工程病人的衍生车型要求的DNA甲基化景观是否IDH1-mutant胶质瘤依赖于持续的IDH1相关的突变d-2HG生产。
    　　 细胞系IMA和细胞系08-0537在杜克大学的PrestonRobertTisch脑肿瘤中心从雄性III级间变性星形细胞瘤和继发性胶质母细胞瘤中分离出来分别如前所述。粘附系IMA在含有1：1培养基中培养：DMEM。将细胞系08-0537在具有20ng/mLEGF，10ng/mLFGF和2ug/mL肝素的1x人完全Neurocult培养基中生长在层粘连蛋白包被的细胞培养皿上进行贴壁培养。每4至6天刷新一次细胞培养基，大约每10天或以80％汇合的速度分裂细胞。细胞在37°C和5％CO2下生长。
    　　 将IMA细胞以每孔1,000个细胞的浓度接种在6孔板中以进行长期生长测定，或以2,000个细胞的浓度将其置于96孔板中进行短期生长测定。对于长期生长测定，将板固定在甲醇中，并用0.2％结晶紫溶液染色，然后在Chemi-docImager上对板进行成像。使用ColonyArea插件在ImageJ中确定区域。对于短期生长测定，将细胞接种在96孔黑壁板中，培养6天，然后按照制造商推荐的Cyquant测定法进行处理。从IMA，08-0537和衍生的亚克隆中提取基因组DNA，以通过短串联重复序列分析法对匹配的患者血液基因组DNA进行细胞系鉴定。杜克细胞培养设施使用MycoAlertPLUSTest进行支原体测试，所有细胞均为阴性。克隆后，在第10到20代之间使用了患者来源的细胞系IMA，在第10到20代之间使用了Cas9编辑的克隆。克隆后在第20至32代之间使用细胞系08-0537，在第10至20代之间使用克隆。
    　　 具有内源性IDH1的患者源性神经胶质瘤细胞系突变以两种方式之一瞬时转染。实验一的IMA和08-0537克隆是使用Lonza4D-NucleofectorXUnit使用20uL试管条，程序CA-137和缓冲液P3创建的。来自实验2的IMA克隆是使用Neon电穿孔仪，10uLR缓冲液，程序1,150V，2个脉冲，30秒脉冲宽度生产的。所有转染均使用200,000个细胞和500ng质粒进行。通过在24孔板中的完全生长培养基中铺板，在电穿孔4天后恢复细胞，然后在DukeFlow通过流式细胞术为GFP阳性细胞选择转染的克隆细胞计数核心设施。排序后在使用有限稀释克隆铺板单个克隆之前，允许细胞恢复1周。对于细胞株08-0537，为了克服低铺板效率，首先通过第一个铺板克隆以1,000个细胞的速度将细胞克隆到10厘米层粘连蛋白包被的平板上，最终使用康宁克隆圆筒和有希望的多克隆菌落选择单个病灶然后将其传到有限稀释板中以分离真正的单个克隆。
    　　 使用不区分突变型IDH1和野生型IDH1等位基因的PCR引物进行克隆的初步筛选，以鉴定在任一等位基因中均带有插入或缺失的克隆。选择有前途的克隆后，对单个克隆进行等位基因特异性PCR扩增野生型或突变IDH1等位基因，最后将所得产物进行Sanger测序。
    　　 有限稀释克隆后，使用DNA试剂盒按照制造商建议的指示从细胞的第10到20代之间分离基因组DNA。然后通过ZymoGenomicDNAClean＆Concentrator试剂盒处理gDNA，并洗脱到diH2O中。按照制造商推荐的方案，使用ZymoEZDNA甲基化试剂盒和Illumina的Infinium由共享资源进一步处理样品。使用IlluminaiScan系统捕获阵列，并使用ChAMP软件包或minfi软件包在R版本3.5.2中进行预处理。简而言之，ChAMP处理可去除检测P的探针在5％的样品以及SNP相关探针，多击中探针和非CpG探针中，>0.01，或<3个珠子。ChAMP处理后，有720,551个探针经过过滤，并用于下游分析。Beta混合物分位数膨胀归一化方法用于校正探针类型的设计偏差。为了评估面对不同归一化方法选择时结果的稳定性，还使用功能归一化和Illumina专有的归一化方法通过minfi和GenomeStudio处理了数据，结果与ChAMP处理的数据一致。
    　　 用二辛可宁酸测定法定量1×RIPA缓冲液中的总细胞裂解液，并使用4％–12％Bis-Tris缓冲的SDS-PAGE凝胶分离20ug的总蛋白。将凝胶浸泡在转移缓冲液+20％甲醇中，然后使用微型Trans-Blot转移池按照制造商的规程转移到聚偏二氟乙烯膜上。转移后，将PVDF膜在TBST中短暂洗涤，然后在TBST无蛋白封闭缓冲液中封闭1小时。封闭后，将一抗1：ID500稀释用于抗IDH1R132H抗，否则以1：1,000在封闭缓冲液中孵育，并在4°C下孵育过夜。洗涤膜，并与辣根过氧化物酶偶联的二抗1：2,000在TBST中孵育1小时。通过在Bio-RadChemiDocMP系统上的化学发光进行检测。使用的抗体包括总IDH1抗体，COXIV抗体和IDH1R132H。如先前由Duke药代动力学药效学实验室所述，进行培养基和组织中D-2HG的分析。使用比辛可宁酸测定法对细胞沉淀的总蛋白质进行标准化。
    　　 当只有两组时，使用两尾学生t检验评估两组之间的比较。对于基因组的CpG上下文的分类分析χ2适合性检验的优度对EPIC甲基化芯片，以确定丰富在芯片上的CpG探测率背景上CpG位点的频率运行。否则结果以算术平均值±SD表示。实验人员没有系统地对小组作业或结果评估不了解。这项研究中的甲基化阵列数据符合MIAMI标准，并已提交至符合MIAME标准的NCBI基因表达综合数据库，登录号为GSE128032。原始测序数据将应要求提供给合格的出国看病网研究人员。
    　　 IDH1突变被认为是神经胶质瘤发生的早期事件，而突变的IDH1活性已被证明可介导正常人星形胶质细胞的转化。但是，先前使用突变IDH1抑制剂的研究表明，该突变对于体外和体内的生存能力和持续增殖变得无关紧要。使用源自WHOIII级间变性星形细胞瘤的突变IDH1星形细胞瘤细胞系，后者在TP53和ATRX中也具有星形细胞瘤病理突变，评估突变IDH1抑制剂AGI-5198对增殖和D-2HG产生的影响。如以前的报告，d-2HG产量通过90％抑制-99％时将细胞用1.25微摩尔/L的选择性IDH1的处理R132H抑制剂AGI-5198。尽管D-2HG受到了这种显着抑制，但即使用10umol/L的AGI-5198处理，该系的短期或长期生长也没有差异。除IMA细胞系外，IDH1突变的胶质母细胞瘤系08-0537在体外未显示与AMA-5198相比，在用AGI-5198治疗后细胞增殖方面存在差异，并且在TP53和ATRX中同时发生突变。
    　　 使用CRISPR介导的基因编辑来生成IDH1等位基因的敲除，以创建IDH1丢失的等基因模型。由于这些品系不适合基于化学的转染方法，因此利用电穿孔和瞬时表达编码IDH1的sgRNA和Cas9-2A-GFP的质粒进行表达。为了提高生成单克隆和编辑细胞的可能性，研究人员利用流式细胞术选择了以GFP表达为替代标记的Cas9活性，并在限制稀释克隆之前严格选通了GFP阳性的细胞。使用两个针对IDH1的sgRNA在两次实验尝试中筛选IMA细胞产生约200个克隆用于进一步表征，最终在突变体等位基因中产生具有三个不同编辑的三个不同克隆。使用特异性抗人IDH1R132H抗体或总抗人IDH1抗体的蛋白质印迹细胞裂解物显示，在IDH1R132H等位基因中无意义突变的IMA克隆没有可检测的IDH1R132H蛋白。此外，在IMA中，IDH1R132H等位基因具有移码突变的克隆中D-2HG的生产水平降低了100到1,000倍。同样，克隆08-0537细胞产生了七个亚克隆，其中包含至少一个在野生型IDH1等位基因中具有无义突变的克隆。在野生型IDH1等位基因中无意义突变的08-0537克隆在IDH1R132H特异的蛋白质印迹中保留了突变IDH1预期重量的条带，但不再产生升高的D-2HG量。该观察结果证实了即IDH1突变的杂合性对于有效产生D-2HG是必需的。
    　　 由于D-2HG的产生足以诱导CpG岛超甲基化的全基因组模式，并且对于维持先前描述的星形胶质细胞模型中的这种超甲基化是必需的，因此研究人员调查了IDH1丢失的遗传模型，无论是野生的-类型或突变等位基因，将显示CpG高甲基化的任何广泛变化。使用Illumina的EPIC阵列分析了CpG甲基化，用于亲本，IDH1敲除或未经编辑的IMA克隆，并对样品进行了无监督的分层聚类。观察到D-2HG产量减少的克隆聚集在一起，而亲本和未编辑的克隆聚集在一起，这表明IDH1R132H损失可能足以诱导全基因组甲基化变化，并且与人类星形胶质细胞中先前的报道一致。同样，在08-0537号细胞系中，亲本细胞和未经编辑的克隆聚集在一起，而野生型缺失克隆显示出更大的距离。将克隆分为已编辑和未编辑的子集，并使用ChAMP处理管道中的DMP算法分别评估了每个CpG位点的克隆之间的beta值差异。在研究人员的对照条件下，检测到6,417个CpG位点，显示出亲本和未编辑的克隆之间存在甲基化差异，但是在亲本和编辑后的克隆之间，检测到了差异显着的甲基化探针，总计16,777个CpG。通过在IMA和08-0537的所有四个D-2HG缺陷克隆中施加增量BetaBeta值≤-0.2的条件，并且在任何未经编辑的克隆中不重复产生增量BetaBeta值≤-0.2的条件，进一步完善了此列表。确定了两类中与突变IDH1介导的D-2HG产生损失最紧密相关的971个探针列表。
    　　 为了确定在IDH1突变赋予的已知DNA甲基化模式的背景下观察到的DNA甲基化差异意味着什么，特别关注了先前报道的G-CIMP相关基因座，用于G-CIMP状态分类。在细胞系IMA中，未在先前鉴定为与G-CIMP表型最紧密连接的七个CpG-loci的甲基化中检测到克隆之间的明显差异。在IMA细胞中，用于将肿瘤分类为G-CIMP的六个高甲基化位点中有六个在IDH1R132H丢失后保持了高甲基化，而在G-CIMP中被低甲基化的一个位点之一保持了低甲基化。相比之下，超突变系08-0537显示出一种用于分类G-CIMP高甲基化的探针与一种用于G-CIMP连锁的低甲基化的探针的差异，但敲除了野生型IDH1，从而损失了D-2HG的产生，没有导致那些在亲代细胞中高度甲基化的与G-CIMP相关的基因座显着脱甲基。尝试使用欧几里德距离对样本进行聚类并且仅使用所考虑的七个G-CIMP基因座来完成连锁时，没有基于IDH1编辑状态的克隆分组。在寻找具有潜在临床意义的其他CpG位点时，例如MGMT-SPT27，观察到甲基化被保留，这表明IDH1R132H不足以完全消除人星形细胞瘤细胞系中的高甲基化表型。
    　　 为了观察可能驱动编辑后的克隆聚类的CpG甲基化变化的差异，研究人员对极端甲基化变化进行了分类。与未编辑的对照细胞相比，在IMA和08-0537细胞系中，WT杂合状态的丧失与更多的探针显示出显着的去甲基化。看到编辑过的和未编辑过的克隆之间的去甲基化水平存在差异后，假设去甲基化可能表明获得了G-CIMP-低甲基化状态。提取了131个在G-CIMP低肿瘤中被识别为低甲基化的探针，并使用样本的欧几里德距离进行了无监督的层次聚类。研究人员没有观察到先前在患者肿瘤中确定的定义为G-CIMP低状态的131位低甲基化的准确概括，许多探针保留了高甲基化。然而，当研究人员将同一细胞系的编辑亚克隆与亲本细胞或未编辑亚克隆进行比较时，具有CRISPR介导的IDH1改变的克隆似乎在131个位点总体上具有较低的甲基化水平。
    　　 先前以G-CIMP低态为特征的TCGA结果也报告了CpG远海地区脱甲基的相对富集，以及CpG岛屿中CpG脱甲基的相对缺乏。在删除未编辑的克隆中显示甲基化变化的位点作为对照的同时，探索了所有CpG位点的基因组背景，这些位点在所有编辑的克隆中均显示保守的去甲基化）。在IMA以及08-0537中，在基因间公海，5UTR公海和距转录起始位点1,500个碱基对的CpG岸位都有明显的去甲基化CpG位点过高表达。观察到在CpG岛中相对缺乏CpG脱甲基，特别是在距转录起始位点200bp的CpG区域以及位于基因体内的CpG位置内，与EPIC阵列上这些位点的背景频率相比。先前的报道首先描述了星形细胞瘤中的G-CIMP低状态，当比较已鉴定的G-CIMP低病例和G-CIMP高病例的整体甲基化模式时，发现了相似的去甲基化模式。具体而言，已表明G-CIMP低的情况下进行比较的G-CIMP低例异形所有探针差分探头时显示在CpG岛富集在CpG的公海区域去甲基化，脱甲基化和代表不足。因此，在IDH1丢失模型中经历去甲基化的CpG探针的基因组背景与患者肿瘤中G-CIMP低模式显示低甲基化的CpG探针的基因组背景相似。
    　　 利用来自IDH1突变型肿瘤的患者衍生的III级和IV级神经胶质瘤细胞系，已经生成了IDH1突变状态不同的同基因胶质瘤细胞系。野生型或编码R132H的IDH1等位基因的敲除足以消除升高的D-2HG生产。进一步表征这些同基因对细胞的DNA甲基化，以揭示尽管某些G-CIMP位点在D-2HG丢失后仍保留了高甲基化，但存在全基因组范围的可测量去甲基化模式，尤其是在公海地区和CpG岛海岸。虽然G-CIMP低表型并不严格要求IDH1缺失在患者肿瘤的等位基因中，在IDH1基因座上已鉴定出具有拷贝数变化的肿瘤亚群，表现出G-CIMP低表型。因此，结果支持了IDH1等位基因的丧失和D-2HG产生的可能性，可能是这一复发肿瘤亚组中甲基化变化的驱动因素。
    　　 在IDH1突变神经胶质瘤细胞系中，发现IDH1WT或IDH1R132H的敲除足以诱导去甲基化趋势。这与D-2HG介导的对α-KG依赖的表观遗传酶）的抑制作用丧失一致。在WT神经胶质瘤中，包含IDH1基因座的Chr2q杂合性的丧失导致CpG岛以外的多个位点的甲基化丧失。结果与该观察结果一致，表明IDH1中D-2HG的生产损失突变细胞可以重新编程DNA甲基化组。此外，与先前发表的用于研究的模型相辅相成，该模型用于研究抑制剂治疗后甲基化变化或IDH1等位基因的自发丧失。尽管IDH1的自然丢失往往与Chr2q上的多个基因缺失同时发生，但细胞模型在IDH1周围的基因座之间克隆之间的Chr2q拷贝数方面没有保守的显着差异，这使能够分析IDH1R132H损失是由于乘客的影响编码基因，小分子抑制剂可以具有它们自己的脱靶效应，并可能难以在长周期一致地应用在体外已经需要看d-2HG抑制介导的去甲基化作用。由于这些原因，使用基因工程的患者衍生的IDH1突变细胞系为研究IDH1在长期过程中维持IDH1突变相关表观遗传学变化中的作用提供了一种新颖且互补的方法。
    　　 虽然不能排除观察到的全基因组去甲基化模式在亲代细胞群的一部分中预先存在的变化的可能性，但果确实表明D-2HG产生的损失与全基因组甲基化的变化有因果关系。这些甲基化变化在很大程度上受限于在公海CpG环境中G-CIMP低位基因亚群中甲基化的降低，并且在大多数情况下，在基因启动子中都未观察到DNA甲基化的显着逆转。尽管如此1308的CpG19以前使用的基因座到簇IDH1从-mutant胶质瘤IDH1野生型神经胶质瘤确实显示了IMA编辑的克隆中甲基化的变化，通过ChAMP调用差异甲基化探针进行检测。与之相比，在未经编辑的IMA克隆中，有1,308个CpG探针中有6个被检测为DMP。在启动子中保留的高甲基化可能是甲基化和5-羟甲基化的组合，这是由于检测方式无法区分两个标记。但是，观察到的G-CIMP低位点甲基化的完全去除不受此限制的影响。
    　　 最近的研究表明，IDH1突变的G-CIMP阳性神经胶质瘤中低水平的去甲基化可能是通过被动去甲基化发生的。这种解释基于以下观察结果：G-CIMP低胶质瘤中的去甲基化基因座与神经干细胞的晚期复制基因组区域密切相关，并且这些晚期复制区域可能由于DNMT1的甲基化维持活性不足，这是由于基因组复制率提高。抑制D-2HG的产生可能是IDH1突变型肿瘤中DNA甲基化的修饰剂。但是，需要进一步的实验来了解研究人员在IDH1中观察到的脱甲基编辑的克隆是由于DNA维持甲基化的保真度发生变化，进而导致被动去甲基化，或者是由于主动去甲基化的变化。
    　　 在未来的工作中，确定在G-CIMP低基因座中这些DNA甲基化的丧失是否会影响位于基因间开放海域的增强子元件的活性以及这些活性变化对IDH1突变型神经胶质瘤的致瘤性有何影响将是重要的。细胞。尽管先前的临床前报告表明，不需要这些甲基化逆转即可看到小分子IDH1抑制剂的治疗效果，但不同IDH1突变型神经胶质瘤对IDH1诱导的各种表观遗传变化的依赖性可能存在异质性突变。研究人员推测，在某些原位异种移植模型中，抑制突变体IDH1后，这种与启动子相关的DNA甲基化依赖性和稳定性的异质性可能导致未能获得治疗益处。
    　　 总之，这项研究提供了在遗传相关背景下对IDH1突变型神经胶质瘤进行建模的新方法，可对现有方法进行补充。这些模型在最保守的G-CIMP位点上表现出高甲基化，该位点在IDH1突变相关的D-2HG产生丢失后仍然存在。新态IDH1突变的丧失导致G-CIMP中CpG甲基化的全基因组范围内的广泛变化-像公海的基因组背景一样低，类似于患者的肿瘤和星形胶质细胞的过度表达系统。利用这些基因相关模型将有助于阐明如何今后的工作IDH1突变继续促进的恶性表型IDH1-mutant胶质瘤。
 
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　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
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