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宫颈癌是一种常见的妇科恶性肿瘤
  • 　　宫颈癌是一种常见的妇科恶性肿瘤，在全球女性恶性肿瘤中发病率排名第三。在中国女性恶性肿瘤中，CC的发病率最高。根治性手术，放射疗法和化学疗法是CC的主要治疗方法，但是治疗引起的不良反应严重影响了患者的生活质量。因此，有必要在分子水平上研究CC的机制，并为临床治疗CC确定有效的基因靶点。微小RNA是一组小的，保守的非编码RNA，可以与同源mRNA靶标上的非翻译区序列特异性结合。近年来，研究发现，miRNA可调节肿瘤和生物学行为，诸如化疗的敏感性的发展，通过调节癌基因/肿瘤抑制基因。位于2P16.1号染色体上的miR-217是一种抑制细胞增殖并在各种细胞的生长和发育中起关键调节作用的miRNA。已经示出了miR-217是密切相关的肿瘤细胞的增殖和迁移。在人胰腺导管腺肿瘤，的miR-217通过靶向靶基因，包括Tpd52l2，KRAS和E2F3抑制细胞增殖。miR-217还靶向dickkopf-1来调节WNT信号通路，因此影响肝细胞癌中干细胞的特性。但是，miR-217在CC中的作用仍有待充分阐明。
    　　 已经证明的是，促分裂原活化蛋白激酶信号传导途径在供应CC进展的关键生物学作用。MAPK是一系列细胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在进化中高度保守。MAPK1也称为细胞外信号调节激酶2，在激活之前位于细胞质中，一旦被激活进入细胞核，它可以被激活或在多种类型的肿瘤组织中高水平表达，包括CC，肺癌，乳腺癌和肝癌，通过激活靶基因。因此，MAPK1的表达与肿瘤密切相关。ERK1/2的通路是在MAPK家族的枢转信号转导通路和与肿瘤发生的进展密切相关。在本研究中，研究了miR-217在CC中的表达水平的临床意义以及miR-217在CC进展中潜在作用的调控机制。该研究旨在为治疗CC患者提供有效的策略。2015年至2017年之间，在医院共采集了60例人类来源的CC标本和非癌组织样本。在所涉及的患者中，男33例，女27例，年龄在42至63岁之间。实验得到医院伦理委员会的批准。在开始放疗或化学疗法之前收集所有组织，并立即冷冻并保存在-80°C直至需要。可从每个受试者获得CC诊断的细胞学或病理学证据。患者提供了书面知情同意书。
    　　 Ect1/E6E7人正常宫颈细胞系，人源CC细胞系和293T细胞是从美国典型培养物保藏中心获得的。细胞在补充有10％胎牛血清的RPMI1640培养基或Dulbecco改良的Eagle培养基中生长。100U/毫升青霉素和100u克/毫升，在5％的CO增湿室链霉素2在37℃下。miR-217模拟，miR-217阴性对照和MAPK1表达载体购自GenePharma。脂质体3000转染试剂用于根据制造商的方案与前述的miRNA转染细胞，用6小时转染的培养时间。PD98059获自TocrisBioscience。根据制造商的方案，进行了细胞计数试剂盒8测定以评估细胞活力。简而言之，将转染的和未转染的细胞转移至96孔板。在10以下2个小时温育u升CCK-8在37℃下，在每一个孔的吸光度在450nm处用酶标仪读。根据制造商的说明，使用TargetScan7.2在线软件预测了miR-217的潜在靶基因。插入了“miR-217”，并选择了“人类”。扫描了miR-217的假定靶基因。
    　　 将野生型MAPK1和突变的MAPK1克隆到pMIR-REPORT荧光素酶载体中。293T细胞接种到6孔板中，然后用使用Lipofectamine3000两者载体转染(R)处理24个小时，根据生产商的使用说明书。使用Dual-Luciferase-Reporter1000分析系统评估荧光素酶活性。Renilla活性用于标准化。根据制造商的方案，使用TRIzol提取总RNA。使用NanoDrop2000分光光度计确定RNA的浓度和纯度。总RNA使用反转录cDNA试剂盒和TaqManMicroRNA逆转录试剂盒进行反转录，以合成cDNA方法被用于分析mRNA的表达。GAPDH的表达用于标准化。使用RIPA收集总蛋白。甲BCA蛋白质测定试剂盒来测量蛋白质的浓度并调节至6的浓度u克/u使用1X装载和DEPC水升。样品在10％SDS-PAGE凝胶上分离，然后转移到聚偏氟乙烯膜上。用PBST中的5％脱脂封闭1小时后，将一抗在4°C下过夜探测膜，并在PBST中洗涤3次。然后将膜与二抗一起孵育。室温下2小时。然后将膜用PBST洗涤3次。使用显影剂进行显影，并使用ImageJ软件对试纸条的灰度值进行分析和计数。
    　　 流式细胞术用于分析细胞凋亡。用表达载体或模拟物转染HeLa细胞，并孵育24小时。将上清液收集在15毫升离心管中，并通过加入2毫升PBS将培养瓶轻轻洗涤一次。用不含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶轻轻摇动消化细胞，并在壁湿时吸出胰酶。将该混合物在室温下放置1分钟，并加入含有10％FBS的DMEM以终止消化。将细胞在4℃以1,000×g离心3分钟，并除去上清液。然后将细胞用预冷的PBS洗涤两次，并重悬于1XAnnexinV结合缓冲液中。根据Annexin-V-FITC细胞凋亡检测试剂盒在室温下，收集细胞并用AnnexinV-FITC和碘化丙啶染色15分钟，然后通过流式细胞仪。流式细胞仪散点图显示，左下象限中显示的活细胞受到机械损伤，左上象限中的坏死细胞坏死，而右上象限中显示高级凋亡细胞，右下象限中显示早期凋亡细胞象限。
    　　 通过流式细胞仪进行细胞周期分析。更具体地说，将具有70％冷乙醇的5×105细胞在-20℃下培养过夜。第二天，将固定的细胞在4°C下以1200×g离心1分钟，并用PBS洗涤两次。将细胞用200处理u在悬浮液升RNA酶A10分钟，在37℃下，随后将300u升PI加入到染色DNA在黑暗中的细胞中。在室温下孵育20分钟后，使用ModFitLT软件V2.0在FACScan流式细胞仪中分析细胞的细胞DNA含量。下列24个小时的HeLa细胞的转染，一个间隙是使用200-创建u横过井的中间升无菌尖端。用DMEM将细胞洗涤两次以使划痕的边缘光滑，并除去漂浮的细胞。在培养箱中培养0和24小时后，在光学显微镜下观察细胞的迁移，观察细胞迁移的距离并成像使用Image-ProPlusAnalysis软件6.0捕获图像。
    　　 一个8-u米Transwell小室放置在一个24孔板以Matrigel的层上涂覆在Transwell小室。将HeLa细胞在无血清培养基中培养12小时以消除血清的影响，然后将其重悬于含有游离FBS的牛血清白蛋白的DMEM中。悬浮细胞加入到Transwell小室，和400u含有20％FBS加入到基底外侧腔室的DMEM升。将细胞在含有5％CO2的培养箱中于37°C培养24小时。然后移出Transwell室，弃去的培养液，并用无钙PBS洗涤两次，然后将室在甲醇溶液中固定30分钟，并在室温下用0.1％结晶紫染色20分钟。随后，将腔室用PBS洗涤，并抽吸上腔室液体。使用棉签轻轻擦拭上层中未迁移的细胞。用一双小镊子小心地除去微孔膜，将其底面朝上干燥，然后转移到载玻片上，并用中性胶密封。使用倒置光学显微镜观察并收集图像。所有实验数据均以平均值±SEM表示。P小于0.05被认为指示统计学上的显着差异。通过单组间方差分析，然后进行Bonferroni检验确定统计学显着性。所有统计分析均使用GraphPadPrism6进行。
    　　 测量患有CC，CC细胞系和对照的患者的癌组织中miR-217的mRNA水平，并测定CC组织中MAPK1的mRNA水平。结果表明，与正常组相比，在癌组织中，miR-217的mRNA水平降低了，而MAPK1的mRNA水平升高了。还发现miR-217和MAPK1的水平呈负相关。还发现，在CC细胞系中miR-217的表达低于对照细胞中的表达。miR-217的表达在HeLa细胞中表现出更大程度的减少，因此，HeLa细胞用于以后的实验中。为了进一步研究miR-217在CC中的作用，将miR-217模拟物转染到HeLa细胞中。用miR-217模拟物成功地转染了细胞。发现与空白对照组和模拟对照组中的水平相比，miR-217模拟物分别抑制了细胞活力，迁移和侵袭。结果表明，与空白对照组和模拟对照组分别观察到的结果相比，miR-217模拟物诱导了细胞凋亡并且细胞周期被抑制。miR-217模拟组的抗凋亡Blc-2蛋白水平较低，而促凋亡蛋白的表达水平较高。为了确定miR-217与MAPK1的结合能力，使用TargetScan7.2网站并将MAPK1鉴定为miR-217的潜在靶标。双荧光素酶报告基因检测数据表明，MAPK1-WT模拟组的荧光素酶活性低于MAPK1-WT空白组，而MAPK1-MUT组未见明显变化。MAPK1在CC中的作用进行了体外研究。通过在蛋白质水平上的观察发现，MAPK1被成功转染到细胞中。通过RT-qPCR分析，MAPK1的mRNA表达被增强并被证实。发现miR-217模拟物抑制细胞活力，迁移和侵袭，这被MAPK1逆转。MAPK1改善了miR-217模拟物诱导的细胞凋亡。模拟组中p-ERK1/2的蛋白质水平低于空白组，这也被MAPK1逆转。p-ERK1/2是MAPK信号通路的重要组成部分。进行了蛋白质印迹法检测p-ERK1/2和MAPK1的水平，发现模拟MAPK1组的MAPK1和p-ERK1/2的水平高于空白对照组。然而，PD98059逆转了MAPK1对MAPK1和p-ERK1/2的影响。
    　　 CC是全世界女性中最重要的恶性肿瘤之一，并且是癌症相关死亡率的主要原因。当前，大多数CC患者在早期没有明显的症状，当CC患者被诊断出患有这种疾病时，通常会发生转移。在过去的几十年里，取得了长足CC的处理。增加CC患者的存活率仍然是一个挑战。miRNA靶向多种靶基因，因此它们可以在不同类型的癌症中充当肿瘤抑制因子或启动子。miRNA通过调节癌细胞的增殖，凋亡和细胞周期，在CC的发展和转移中起关键作用。作为一个miRNA的，的miR-217是密切相关的肿瘤进展和预后不良。miR-217与其靶mRNA结合以抑制肿瘤的形成和进展，包括胃癌和肝癌。然而，关于miR-217在CC中的作用仍知之甚少。本研究的目的是研究mir-217在CC发育中的作用。检测到miR-217在CC组织和细胞中的表达，并证实与正常相邻组织相比，在CC组织中其表达显着降低，并且在CC细胞系中观察到相似的结果。这些数据表明，miR-217可能在CC中起着抑癌基因的作用。正常细胞的生物学功能发生过程中遇到的重大变化，以促进的癌症的进展，包括侵袭和转移。在生物体各种组织细胞保持通过增殖和凋亡的定量平衡，然而，干扰这种平衡导致的疾病，如癌症。细胞凋亡是由多种抗癌药物诱导的细胞死亡的主要机制，因而，凋亡在癌症治疗中的作用已成为抗肿瘤研究重点。先前已发现miR-217在CC组织和细胞中低水平表达。本研究旨在确定miR-217高表达对CC细胞的影响，因此，将miR-217模拟物和模拟对照转染到HeLa细胞中。发现miR-217模拟物抑制了细胞活力，转移，侵袭和细胞周期，并增加了细胞凋亡。另外，miR-217模拟组中促凋亡蛋白的表达增加，而抗凋亡蛋白的表达降低。这些数据表明miR-217可能是CC进展中的肿瘤抑制基因。
    　　 为了研究miR-217对CC的肿瘤抑制作用的分子机制，使用了生物信息学软件来识别miR-217在CC细胞中的靶标。发现MAPK13'UTR在305-311和778-784位置具有两个miR-217结合序列。荧光素酶活性测定进一步证实MAPK1是miR-217的靶基因。MAPK途径被认为是细胞中重要的蛋白级联反应，可将信号从细胞表面的受体传递至细胞核。在此途径中的重要信号分子是ERK和其上游激酶。MAPK途径被认为是癌症治疗干预的潜在靶标，因为它在调节癌细胞的增殖，侵袭和存活中是有效的。证明MAPK1的抑制可抑制前列腺癌的致瘤性和转移。miR-217通过靶向MAPK1抑制大肠癌中的肿瘤生长和凋亡。miR-585直接靶向MAPK1来抑制胃癌的增殖。MAPK1参与了癌症的发展。发现CC细胞中MAPK1和miR-217模拟物的共转染恢复了CC细胞中miR-217模拟物的作用。miR-217模拟物抑制了p-ERK1/2的水平，而MAPK1则将其逆转。为了验证MAPK信号通路在CC中的作用，使用了ME980的有效抑制剂PD98095和MAPK1对细胞进行了共处理，结果发现PD98095可以增加CC的表达水平。p-ERK1/2和MAPK1。上述实验数据表明，miR-217抑制了CC的发生和发展，并且这种功能可能与MAPK信号通路相关。
    　　 尽管本研究发现MAPK1是CC中miR-217调控的靶标并有效抑制CC的恶化，但该研究仍存在局限性。首先，的miR-217的在通过调制MAPK1保护CC功能通过只支持体外实验。另外，受miR-217所观察到的显著调控CC调节MAPK1不明确，需要进一步调查。综上所述，本研究结果有助于出国看病服务机构失调的miR-217的CC的进展通过靶向MAPK1作用的认识。该结果为提高CC患者的生存率提供了有效的治疗目标。
 
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　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
出国看病适应症
靶向药物
 

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