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胶质瘤的高侵袭性特征
  • 　　胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤，具有侵袭性和高侵袭性特征，并且是由于中枢神经系统肿瘤引起的癌症相关死亡的主要原因。尽管开发了包括手术，化学疗法和放射疗法在内的治疗方案，但这些肿瘤患者的中位生存时间约为诊断后1年。胶质瘤治疗的主要局限性是手术后复发的普遍性，这是由于渗入周围组织以及对化疗和放疗的内在或获得性抗性所致。对于胶质母细胞瘤的治疗的新的治疗目标和工具应进一步探讨。
    　　 末端激酶是丝裂原活化蛋白激酶超家族的成员，由三种同种型组成，即JNK1，JNK2和JNK3。JNK被组成在初级神经胶质肿瘤活性，并且其活化为临界弥漫胶质瘤的组织学分级相关。活化的JNK易位至细胞核并激活转录因子，通过上调细胞周期蛋白D1，基质金属蛋白酶，MPP9，MMP14，uPAR促进恶性增殖或侵袭。活化的JNK对维持胶质瘤干细胞样细胞的自我更新和致瘤性至关重要，并使胶质瘤细胞获得对EGFR抑制或替莫唑胺的主要抗性。JNK活化在胶质瘤的肿瘤发生了至关重要的作用。
    　　 JNK由两种双特异性MAP激酶激酶特异性激活，即MKK4和MKK7，通过苏氨酸和酪氨酸的磷酸化。到JNK的活化相似，MKK4和MKK7处于它们的活化通过上游MAP激酶激酶激酶，已证实MLK3沉默或MLK抑制块JNK活化和两个GBM细胞迁移和侵入，以及沉默MLK4抑制自我更新，运动性和胶质瘤干细胞的无线电通电阻，这表明MLK-JNK轴是至关重要用于GBM肿瘤发生。在胶质瘤形成过程中直接激活JNK的关键激酶仍然未被识别。在研究中发现MKK7而非MKK4仅在不同类型的神经胶质瘤细胞系中激活JNK，这种激活对于恶性细胞进展至关重要。MKK7转录严重依赖于HDAC4对脱乙酰化的SP1和Krüppel样因子-5，而HDAC4抑制导致SP1和KLF5改变其从激活因子到MKK7转录抑制因子的功能。出国看病网的研究人员的研究结果提供了关于在MKK7转录和致癌JNK级联的选择性激活中HDAC4介导的SP1和KLF5去乙酰化的神经胶质瘤形成的分子机制的新见解。
    　　 在2015年12月1日至2017年12月30日在医院进行组织病理学诊断的92例石蜡包埋的胶质瘤标本中进行的25例GBM样本与相邻肿瘤周围相匹配收集脑组织。为了确定不依赖贴壁的生长，如前所述，使细胞在软琼脂中生长。将细胞再悬浮在0.325％的终浓度添加有琼脂培养基的细胞。将1ml所得细胞悬浮液涂布在六孔板中，所述六孔板用补充有0.65％琼脂的DMEM培养基分层，并在37℃，5％CO2培养，计算形成球形克隆的细胞百分比。使用双向ANOVA或具有选择对分析的单向ANOVA分析比较。在分析之前确定数据是正态分布的。以及两种主要培养的神经胶质瘤细胞。MKK7击倒大大降低JNK在所有的神经胶质瘤细胞的c-Jun磷酸化水平使用，而沉默MKK4却没有这样的效果。MKK7敲低也造成显着减少uPAR的，MMP-14和细胞周期蛋白D1的，它们是JNK-c-Jun的途径。MKK7而不是MKK4有助于胶质瘤细胞中JNK的活化。确定MKK7表达是否与胶质瘤等级和磷酸化-c-Jun水平密切相关，这表明JNK活性。在使用的92个样品中，来自同一患者的匹配的肿瘤周围组织可用于25GBM样品。GBM组织表现出更大的增加比相匹配的肿瘤周围组织，该产物与MKK7mRNA水平一致。GBM组织表现出p型的c-Jun水平比匹配的肿瘤周围组织更大的增加，反映了JNK活性在GBM组织更高。MKK7蛋白在临床胶质瘤组织水平与神经胶质瘤等级呈正相关，以及与对c-Jun的水平。数据支持MKK7对胶质瘤细胞中JNK信号的激活至关重要，并且胶质瘤的进展与MKK7表达增加有关。
    　　 确定MKK7是否对胶质瘤细胞的恶性进展至关重要。MKK7敲低有效地降低侵袭和迁移的所有三种神经胶质瘤细胞系，即U251，U87和BT325的速率，以及生长。JNK2在胶质瘤进展中起着重要作用。经由MKK7-JNK2，表现出相比JNK2或单独MKK7JNK活性显着增强的融合蛋白的过表达大大升高JNK2活性，显着地促进了迁移，侵入和增殖，以及贴壁依赖性生长，相对于控制。总之，MKK7在触发JNK激活和胶质瘤形成中起关键作用。MKK7转录关键取决于神经母细胞瘤细胞中的HDAC活性。在这三个神经胶质瘤细胞系，抑制HDAC抑制剂，包括TSA，SAHA和M344HDAC活性的，也抑制MKK7转录和表达，这表明HDAC依赖性MKK7转录很可能是一种常见的机制。通过使用特异性siRNA沉默各HDAC成员，研究人员发现只有HDAC4敲低导致MKK7mRNA和蛋白质的显着减少，伴随着p21表达和H3K9乙酰化的增加。而不脱乙酰化能力的突变体，转录上调MKK7表达和所述JNKc-Jun的测试目标。两个特定HDAC4抑制剂，即，LMK235和他喹莫德，抑制MKK7mRNA和蛋白水平以剂量依赖的方式，并因此导致了JNK的。总之，这些结果表明HDAC4活性对MKK7转录至关重要。
    　　 为了探究HDAC4如何调节MKK7转录，首先通过使用报告基因，即MKK7-luc来确定HDAC4是否参与调节MKK7启动子的活性。与MKK7mRNA和蛋白，敲低或HDAC4的抑制的抑制效果一致的那些相比在控制大大降低了报告的活动。单独的SP1位点-1或位点-2的突变极大地降低了MKK7-luc报告基因的基础活性，并导致对HDAC4抑制的抑制反应增加，而SP1位点的突变-3没有这样的影响。当SP1位点-1和位点-2都发生突变时，双突变体报告基因的活性恢复到野生型MKK7-luc报告基因的基础水平，并失去对HDAC4抑制的反应。这些结果有力地表明SP1位点-1或位点-2不仅对于MKK7启动子的激活是必需的，而且对于在HDAC4抑制下抑制MKK7启动子也是必需的，从而在MKK7转录的调节中起关键作用。
    　　 当调节基因表达时，SP家族蛋白和样因子都更喜欢结合SP1位点。研究人员随后确定MKK7转录是否取决于两个转录因子，即，SP1和KLF5，其已经显示出参与调节MKK7启动子活性。SP1或KLF5的击倒大大降低MKK7的活性-Luc，以及MKK7mRNA和蛋白水平。相反，SP1或KLF5的过表达显着增加MKK7启动子的活性并上调MKK7mRNA和蛋白质的水平。在进一步的测试中，通过过表达显性阴性SP1来阻断SP1和KLF5与SP1位点的结合，其仅含有人SP1的DNA结合结构域而不是反式激活域，显著降低MKK7启动子的活性和MKK7mRNA的水平和蛋白质，以及。结果表明SP1和KLF5对MKK7转录都至关重要。
    　　 已经证明SP1和KLF5在HDAC抑制后可以将它们的功能从活化剂转化为抑制剂。SP1或KLF5的敲低显著救出MKK7启动子活性，以及MKK7mRNA和蛋白质水平的LMK235诱导的抑制，表明HDAC4活性的损失是一个关键步骤导致SP1和KLF5在MKK7转录中改变它们从激活因子到抑制因子的作用。为了确定HDAC4是否可以直接使SP1或KLF5去乙酰化，检查了HDAC4抑制是否导致两种蛋白质的乙酰化增加。LMK235治疗或HDAC4击倒电泳，表明SP1和KLF5获得了新的修改。曝光结果显示HDAC4抑制导致KLF5的强烈增加和SP1的轻微降低。由于在HDAC4抑制后SP1和KLF5mRNA水平均增强，SP1蛋白的减少很可能是由于该蛋白的强烈移位。免疫沉淀揭示SP1的乙酰化水平显著正常化至总SP1后HDAC4抑制后增加，而乙酰化的KLF5的水平增加，因为其诱导的。研究人员确定HDAC4是否与SP1和KLF5相关联。这些结果支持HDAC4与SP1和KLF5形成复合物并直接使这两种蛋白质脱乙酰化。
    　　 为了通过与上述鉴定的MKK7启动子中的SP1位点-1和位点-2结合来阐明复合物是否调节MKK7转录，用抗-HDAC4，KLF5和SP1进行ChIP。HDAC4抑制后增加的KLF5和SP1蛋白也与两个SP1位点包含的核心区域结合，表明SP1和KLF5的乙酰化不影响它们的DNA结合能力，而是逆转它们的功能。作为阴性对照，在与引物1或引物4扩增的核心区域相邻的侧翼序列中未检测到完整复合物。结果支持HDAC4，KLF5和SP1一起作为复合物，通过两个SP1调节MKK7转录。为了进一步证明脱乙酰化-KLF5和脱乙酰化-SP2有助于MKK7上调，使用表达KLF5或SP1的乙酰化缺陷突变体的质粒。异位SP1和KLF5相比野生型增加的显著MKK7-luc的活性和蛋白的表达。两个突变体共表达显着上调MKK7表达和恢复下HDAC4抑制该表达。值得注意的是，KLF5或SP1单独对MKK7-luc的活性的微妙的影响，而两种突变体的组合大大激活MKK7-luc的，因此表明脱乙酰-SP1和-KLF5活性协同上调MKK7转录。测试了HDAC4介导的组蛋白去乙酰化是否发生在已鉴定的MKK7启动子核心区上。发现HDAC4击倒也导致H4K12乙酰化一个强劲增长之外H3K9，但不会影响其他组蛋白赖氨酸网站测试的乙酰化。通过使用对乙酰基-H3K9或乙酰基-H4K12特异性的抗体进行ChIP测定，观察到HDAC4介导的H4K12的去乙酰化经常出现在MMK7启动子的核心区域，而出现在区域乙酰化H4K12的机会HDAC4敲低。由于在MKK7启动子区域都没有出现低乙酰化或高乙酰化的H3K9，研究人员推断HDAC4可以被SP1募集到MKK7启动子区域，并且负责将H4K12去乙酰化并促进MKK7。
    　　 由于完整的HDAC4复合物对MKK7表达至关重要，因此研究人员评估了复合物对GC中恶性表型的功能。通过敲低对HDAC4的抑制有效地缓解了GC的迁移，侵袭和增殖。SP1-DN过表达阻断SP1功能也引起类似的抑制作用。相反，HDAC4的过表达显着促进胶质瘤恶性肿瘤。与野生型相比，SP1或KLF5的表达极大地增强了神经胶质瘤细胞的侵袭，迁移和增殖能力。两种突变体的组合提供了比两种野生型更多的恶性效应，并极大地挽救了HDAC4抑制下的抑制作用。两个异位HDAC4的影响，并在两个突变体通过SP600125废除强烈建议SP1和KLF5通过HDAC4的脱乙酰化促进神经胶质瘤细胞的恶性进展经由MKK7信令。评估HDAC4抑制的抗癌作用，研究了HDAC4抑制剂LMK235的体外和体内功效。通过LMK235HDAC4的抑制显著抑制迁移，侵袭和选区中，用HDAC4击倒的影响是一致的。在体内从U87异种移植物的小鼠的结果表明，在对照和分析的任何一天LMK235基，表明LMK235治疗在裸鼠中没有引起明显的毒性。十天后处理，LMK235治疗显著减少与对照相比的相对肿瘤体积和引起更大的抑制12或14天治疗后。伴随对肿瘤生长的抑制作用，暴露于LMK235诱导MKK7mRNA水平以及蛋白质表达的明显降低。其结果是，磷酸化c-Jun和其靶基因的水平下降。总之，这些结果强调了MKK-7表达和JNK活性的抑制参与体外和体内HDAC4抑制所产生的肿瘤生长抑制作用。
    　　 在GBM组织HDAC4表达远低于在匹配的肿瘤周围组织更高和HDAC4免疫阳性程度的增强，神经胶质瘤的临床病理等级相关。神经胶质瘤样本中HDAC4的表达显示与MKK7和对JNK的显着相关性，以及对c-Jun的。在临床胶质瘤组织HDAC4核免疫染色呈正胶质瘤级。核HDAC4的阳性与MKK7表达。这些数据支持HDAC4核积累与MKK7增加相关的概念，MKK7参与胶质瘤的进展。研究人员发现MKK7主要激活JNK以促进胶质瘤细胞的恶性表型，其表达与神经胶质瘤的等级以及胶质瘤组织中的p-c-Jun水平密切相关。机械地，MKK7转录依赖于HDAC4介导的SP1和KLF5的脱乙酰化。HDAC4的抑制抑制MKK7表达，从而导致JNK活性的降低和这些蛋白在体外和体内的GC中的致癌作用。
    　　 在过去的几十年中，JNK信号在胶质瘤形成中的致癌作用已被广泛考虑。一系列研究检测了人类GBM组织中基础JNK和c-Jun的活性，并独立证实强烈磷酸化的JNK和c-Jun出现在GBM病例的大多数并且相关具有胶质瘤的组织学分级。JNK信号和JNK的神经胶质瘤细胞中的致癌作用的重激活紧紧依靠MLKs的活性。在此证明MKK7直接激活神经胶质瘤细胞中的JNK信号传导。发现MKK7表达与胶质瘤的分级密切相关，GBM组织中的表达高于肿瘤周围组织，并且与JNK的激活密切相关。增加MKK7表达是一个重要参数，加上MLKs的活性，增加神经胶质瘤细胞恶性肿瘤中JNK信号的激活。
    　　 此处鉴定的MKK7转录受HDAC4活性调节。作为IIa类HDAC成员，HDAC4在脑细胞中高度表达，并且该蛋白质的功能紧密依赖于其在细胞质和细胞核之间的亚细胞定位。HDAC4核输入诱发的有害作用已被称为几种疾病模型的病理原因，如共济失调性毛细血管扩张症，中风和帕金森病。在神经胶质瘤细胞，HDAC4活性已经牵涉于侵袭，增殖，以及药物和耐辐射性。高表达HDAC4正与肿瘤等级相关，与总生存率呈负相关。p21表达的HDAC4介导的转录抑制已被发现有助于神经胶质瘤，恶性增殖以及其它癌症细胞，包括乳腺癌，结肠癌和肺腺癌，暗示HDAC4核输入最有可能是由于其在肿瘤发生中的作用而占优势。通过IHC分析，发现II级，III级和IV级胶质瘤样本中核HDAC4的比率显着增加，并且与分级呈正相关。这些比率与MKK7表达正相关。数据表明，HDAC4核输入可赋予其促进胶质瘤恶性肿瘤的致癌活性的功能获得性，至少通过提高MKK7表达和JNK活性。
    　　 转录因子SP1和KLF5，已知在神经胶质瘤的形成，发挥有效的致癌作用被发现参与HDAC4调节MKK7转录。其通过与启动子中的共有GC富含元件结合来调节靶基因。SP1或KLF5通过其作为反式激活因子或反式抑制因子，或将功能从激活因子转换为抑制因子，在促或抗肿瘤发生中的关键作用，发现HDAC4对KLF5和SP1的直接去乙酰化对MKK7表达至关重要，而HDAC4抑制后乙酰化-SP1和乙酰化-KLF5的增加转变为抑制MKK7和胶质瘤形成，突出了HDAC4的新机制。对于SP1和KLF5介导的MKK7转录的正或负调节是至关重要的。
    　　 总之，在神经胶质瘤细胞中，高表达的HDAC4直接使SP1和KLF5脱乙酰化，这导致这些蛋白质协同上调MKK7表达。结果，升高的MKK7激活JNK信号以促进胶质瘤恶性肿瘤。相反，在乙酰化-SP1的增加和乙酰化抑制开关后转录抑制MKK7转录和因此降低JNK的活性和神经胶质瘤进展。这些发现为HDAC4-SP1轴调节胶质瘤恶性肿瘤的分子机制提供了新的见解，并提示HDAC4抑制可能是具有高JNK活性的肿瘤中更有效的临床靶点。
 
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