出国看病
 
神经胶质瘤干细胞
  • 　　胶质瘤干细胞已被证明存在于肿瘤，两者的坏死和血管周围区域，其中成胶质细胞瘤的细胞采用多种干细胞样表型。最近，单细胞RNA测序研究已经鉴定出在单个肿瘤中不同程度存在的四种GBM细胞状态。这项开创性研究突出了这些侵袭性肿瘤中存在的多样性和异质性，并为更好地了解GBM中肿瘤微环境的遗传多样性，可塑性和影响提供了框架。细胞外基质蛋白和基底膜的形成是支持GBM中TME所需的关键结构成分。肌营养不良蛋白-糖蛋白复合物是肌膜蛋白和糖蛋白的大型跨膜寡聚复合物。DGC的主要成分是dystroglycan受体。DG是一种ECM结合受体，最著名的是它具有桥接ECM和骨骼肌细胞中细胞骨架的功能。DG受体包含两个非共价连接的a和B亚基。细胞外成分aDG被高度糖基化。层粘连蛋白结合附着在aDG上的聚糖结构，这种相互作用对于调节ECM附着至关重要。BDG跨膜成分主要调节肌营养不良蛋白附着到F-肌动蛋白在细胞内的电缆。aDG糖基化或DG损失导致各种形式的肌营养不良的失调，最熟知的是杜兴氏肌营养不良。DG还被证明对大脑发育至关重要，受体失调会导致许多结构和功能性大脑缺陷。与骨骼肌功能相比，关于DGC在成年大脑中的作用知之甚少。DG已与血-脑屏障功能和存在于星形胶质细胞的血管周围端脚，它介导细胞粘附于血管ECM蛋白。DG也具有调节少突胶质细胞分化和功能已建立的角色。DG存在于脑室下区域中，并通过抑制出生后大脑中的Notch信号传导来调节神经干细胞和祖细胞的增殖。
    　　 Eph受体酪氨酸激酶和整联蛋白家族受体已被很好地描述为在GSC生态位形成和维持中具有功能性作用。Eph受体开发过程中首次描述，并已被证明是功能性地超过在多种人类癌症表达。出国看病网研究人员以前的工作和其他人的研究结果表明，特定的家庭成员EphA3的，在被显著上升MES样GBM，对GSC中特别是在血管周围的区域中最高度表达，并在疾病复发被显著上升。此外，EphA3已被证明在人类癌症的TME中在间充质基质细胞上过表达并发挥功能。最近已经证明，使用有效载荷的抗体治疗策略，EphA3可以有效靶向GBM动物模型。整联蛋白受体，特别是整联a6还表达在在血管周围生态位的GSC和功能，以促进肿瘤发生。aDG在GSC承诺中的作用及其对GBM细胞状态的贡献尚待阐明。在这里通过严格调控ERK信号，确定aDG受体在促进GBMMES样状态和维持血管生境中GSC方面的核心作用。发现表明，aDG在功能上被糖基化，并与EphA3和整联蛋白a6受体协同介导MES样状态，并进一步发挥锚固血管周围肿瘤区域中GSC的作用。
    　　 人类脑癌标本是在人类伦理学批准的项目HREC：脑癌的新疗法下，从皇家布里斯班妇女医院收集的。切除后立即收集标本，并在QIMRBerghofer实验室进行分析处理。出国看病网研究人员已经开发出一种表征GBM患者来源的细胞系资源，数据可公开获自Q-细胞GBM线被维持为神经胶质瘤神经干细胞培养或按照制造商的指导使用StemProNSCSFM作为神经球培养。如上所述，从ATCC获得U251-MGGBM细胞并培养为神经球。所有小鼠实验均根据QIMRBerghofer动物伦理委员会批准的实验方案，根据澳大利亚国家卫生与医学研究委员会澳大利亚有关动物的护理和科学使用守则进行。为了进行颅内异种移植研究，五周大的雌性NOD/SCID动物来自CanningValeWesternAustralia的动物资源中心。用表达多个联合DAG1shRNA靶向序列或表达非靶向对照shRNA的慢病毒载体转导源自人GBM标本的原代系。计数细胞WK1GNS1.6×104个细胞，每组4只动物；1.5×105用一个小动物立体定向装置将JK2GNS细胞移植到右纹状体内。在手术前30分钟对小鼠进行镇痛，并于第二天再次镇痛。根据道德准则，动物监测标准和评分，每天对小鼠进行疾病或肿瘤负担迹象的监测。在终点通过颈脱位使动物安乐死。收集大脑并在10％中性缓冲的福尔马林中固定24小时，转移至70％乙醇中，然后包埋在石蜡中。切下切片并根据常规方法对H＆E进行染色，
    　　 使用TRIzol试剂从组织或细胞系中分离出总细胞RNA。使用不含RQ1RNase的DNase对RNA进行DNase处理，然后使用随机六聚体SuperScriptIII逆转录酶和dNTPs合成第一链cDNA。使用Viia7实时PCR系统和SYBR-GreenPCRMasterMix进行实时PCR。将结果标准化为B-肌动蛋白，表达表示为每1000个B-肌动蛋白的拷贝数。使用8M尿素与磷酸酶和蛋白酶抑制剂分离总细胞蛋白。使用Mem-PERPlus膜蛋白提取试剂盒分离膜和细胞质蛋白组分。加载等量的蛋白质，通过SDS/PAGE分离，并使用标准方法进行免疫印迹。免疫组织化学实验是使用OCT包埋的来自患者脑肿瘤的冷冻标本进行的。切成6um的切片，在2：1的丙酮：乙醇溶液中固定5分钟，在3％的过氧化氢中孵育10分钟以阻断内源性过氧化物酶活性，并在BackgroundSniper中孵育30分钟以阻断非特异性结合，然后与以下一级抗体在4°C下孵育过夜，然后按照制造商的说明与3,3'-二氨基联苯胺色原试剂盒一起与MACH1或MACH2HRP聚合物检测一起孵育，以进行检测。然后使用LeicaST5010AutostainerXL和LeicaCV5030全自动玻璃盖玻片对切片进行复染，脱水，清除并盖玻片。根据制造商的说明，与3,3'-二氨基联苯胺色原试剂盒一起进行检测。
    　　 使用具有以下特异性的一抗分析表达用于指示背景染色。将细胞在PBS中洗涤两次，并在补充有1％BSA的PBS中封闭20分钟。封闭后，将细胞与一抗在室温下孵育20分钟。在分析之前，将细胞在封闭溶液中洗涤以除去任何未结合的抗体缀合物。使用LSRFortessa检查了20,000至50,000个总事件，并使用FACSDiva软件分析了数据。使用碘化丙锭染色门控活细胞。如上所述，对GBM细胞系重复流式细胞术程序。然后在ImageStreamx上运行样本。简要地说，每个样品收集了5,000个事件，单色控件用于创建补偿矩阵以校正光谱重叠。然后使用IDEA软件分析所有数据。如IHC所述，使用来自患者GBM肿瘤的OCT嵌入式冷冻标本进行切割，固定，在过氧化氢和BackgroundSniper中孵育的双重IF实验。将切片与a-dystroglycan抗体和山羊抗小鼠AF488，然后是纯化的IgG小鼠Fab片段一起孵育分钟）和啮齿动物阻断Fab片段5以阻断任何游离的小鼠抗体。第二次染色是用CD31/PECAM，Clone-JC70A，山羊抗小鼠AF647进行的，并用DAKO荧光固定介质盖上盖子并使用蔡司共聚焦显微镜。
    　　 将单细胞悬浮在StemProNSCSFM中，并接种到含有无菌盖玻片的24孔板中。然后将细胞用a-Dystroglycan抑制抗体或IgM对照抗体处理24小时。治疗后，将粘附和肿瘤球培养物在室温下固定在4％PFA中15分钟。然后如前所述封闭细胞并分析细胞外蛋白a-Dystroglycan，EphA3和EphA2的表达。通过在0.25％TritonX-100中透化固定培养物来分析分化标记物BIII-微管蛋白，GFAP和髓鞘碱性蛋白的表达在4°C下放置10分钟。将单细胞接种在24孔板的盖玻片上，生长因子饥饿过夜。然后，如上所述，在固定和通透之前，将细胞用a-Dystroglycan抑制抗体或IgM对照处理24小时。还包括用FBS充分处理过的对照。使用抗体磷酸化的ERK观察到ERK易位的表达。将单细胞接种在涂有Matrigel的盖玻片上，并如前所述分析a-Dystroglycan的表达。将单细胞悬浮于无生长因子的StemProNSCSFM中，并一式三份接种在6孔板中，并用a-Dystroglycan抑制抗体或IgM对照。7天后，收集粘附和神经球培养物，并用Accutase解离，通过使用血球计数器直接细胞计数来计算增殖。在实验前，将单个GBM细胞铺在各个孔中16h。用a-Dystroglycan抑制抗体或IgM对照处理细胞。采用Incucyte系统实时定量细胞黏附，作为替代品以读取分化。
    　　 使用ApoTox-GloTriplex测定法评估细胞凋亡和生存力。IIH6处理后48小时评估了切割的caspase3/7活性和细胞活力，将7.5千克每毫升顺铂处理用作阳性对照。结果显示为相对于IgM对照相对于细胞生存力标准化的caspase3/7活性。病毒感染前24小时，将靶细胞以50％融合度铺板在StemProNSCSFM中的Matrigel涂层板上。第二天，除去平板培养基，并加入聚乙烯，然后加入慢病毒颗粒a/B-DystroglycanshRNA。和对照shRNA。转导后24小时，加入新鲜培养基，并对细胞进行嘌呤霉素选择。与对照shRNA相比，使用先前验证的整联蛋白a6shRNA序列可将CD49f下调。转染前24小时，将靶细胞铺在50％融合度下。第二天，除去电镀媒体和使用的FuGENE转染细胞HD：3.0DNA比：1中。
    　　 使用FACSAriaIIIu基于GFP表达选择阳性克隆。通过使用CD49f的流式细胞术确认了表达KD。将解离的细胞接种在24孔板中，并用a-Dystroglycan抑制抗体或IgM对照处理。将单细胞接种在6孔板中，并使生长因子饥饿过夜。然后在用a-Dystroglycan抑制抗体或IgM对照处理前24小时，用CD49f处理预封闭细胞。孵育3小时后，收集细胞，并通过蛋白质印迹分析pERK和总ERK的表达。将单细胞接种在24孔板中，使生长因子饥饿过夜。然后在用a-Dystroglycan抑制抗体或IgM对照处理之前24小时，用Erlotinib或Gefitinib处理细胞。体内实验-每个实验的样品大小或重复次数均在图中标出。使用Graphpad软件产生生存图。使用Log-rank检验确定实验组之间的显着性。P-值所指示的，*p≤0.05被认为是统计学显著。体外实验-学生的t检验确定了差异的可能性；p小于0.05被认为是显着的；所有统计检验均为2面检验。使用Spearman等级确定相关系数。
    　　 从肌营养不良蛋白相关糖蛋白基因转录出aDG和BDG。DG被翻译为单个前原多肽。受体被自动催化裂解成保持非共价结合的a和B链。aDG的粘蛋白样结构域在到达表面膜的途中被高度糖基化。dystroglycan通过matriglycan结合细胞外基质的蛋白质，如层粘连蛋白。受体的糖基化对于适当的功能是必需的，没有它aDG不能结合层粘连蛋白。为了确定DAG1在脑癌中是否重要，询问伦勃朗数据库和TCGA数据库以将DAG1相关基因表达与生存有关。在GBM的上下文具体且也神经胶质瘤，与升高的患者的肿瘤DAG1导致显著生存期短。伦勃朗数据库还用于评估GBM中的DAG1基因表达以及其他形式的恶性脑癌和正常脑组织。这表明DAG1倾向于与肿瘤分级相关，因为与少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤病例相比，GBM中的表达最高，而所有肿瘤类型均高于正常脑组织。DAG1在GBM表达进一步分层为分子亚型。DAG1表达在经典亚型GBM中最高，而在其他亚型，前神经元）中大约相等。为了评估GBM中DAG1的相对mRNA水平，对来自内部肿瘤库的28个GBM肿瘤标本进行了QPCR。将表达与其他受体进行了比较，这些受体先前被确定具有维持GSC的作用。DAG1水平等同或更高，以这些受体在评估所有的情况下。
    　　 重要的是，受体功能与糖基化状态而不是基因表达紧密相关。为了确定aDG糖基化的水平，出国看病网研究人员使用了由坎贝尔及其同事先前开发的单克隆抗体，该抗体对具有已知受体阻断功能的aDG上的聚糖部分具有特异性。已经开发了GBM患者来源的细胞系的资源，其中GBM线被维持为神经胶质瘤的神经干细胞培养物。这种方法在培养中促进了更去分化的干细胞样表型。出国看病网研究人员评估了一组的亚型和未分类内部产生的早期传代GBM文化。流式细胞术分析揭示了大多数表达高水平的糖基化的aDG不论GBM分子亚型的线。选择一组四个IDH1WTGBM系进行进一步分析，分别为JK2-，RN1-，SJH1-和WK1-，通过Westernblot确认aDG蛋白的表达。出国看病网研究人员接下来进行细胞分级分离的研究，随后WB的GBM线在面板上，数据所表示的大多数蛋白质的存在于细胞膜所示。先前关于乳腺癌的报道表明EphA3可以调节aDG。鉴于发现，通过流式细胞术评估了糖基化的aDG和EphA3蛋白水平的共表达。平均通道荧光分析显示高相关性在所测试的初级GBMGNS线n=10）。
    　　 为了检查糖基化的aDG的空间定位和肿瘤特异性，首先检查了GBM的一种变体，胶质肉瘤，该变体经历部分去分化过程，继而丧失神经胶质分化标记GFAP和间充质特征的获得，这一过程类似于上皮-间质转化。GS是由神经胶质瘤胶质状和肉瘤间充质样肿瘤的元件。在GBM和GS之间发现了常见的遗传改变，并且两者均预后不良。GS的已知临床特征是间充质肿瘤区隔高度迁移，并渗入富含ECM蛋白的大脑区域，如软脑膜。间质成分对波形蛋白染色呈阳性。对波形蛋白进行了免疫组织化学，发现胶质丰富和主要是间充质区域之间清晰可见。接下来在连续的GS肿瘤组织切片上进行了IHC，以确定aDG，BDG，EphA2和EphA3的定位。一个有代表性的例子表明，aDG和EphA3主要在存在间充质肿瘤成分并且在分化程度更高的GFAP+神经胶质肿瘤成分上表达低或不表达的区域表达。对于EphA2和BDG，这种离散的模式并不明显，它们在神经胶质和间充质肿瘤元件中均显示出可比的表达。在GBM标本中，虽然不那么明显地离散，但在GS中也观察到了双相的肿瘤组织模式。这些区域比GS肿瘤更小且不那么突出，并且还显示了GFAP，波形蛋白，EphA2，EphA3aDG，CD49f和CD31的异质表达，表明该肿瘤组织模式也可能在GBM中发生。另外，在GBM患者标本中免疫荧光染色显示，aDG染色在紧邻肿瘤血管的血管周围区域最强。
    　　 鉴于EphA3和aDG在GS和GBM组织中的重叠表达谱，希望评估这些受体之间的膜定位和潜在相互作用。IF分析显示在所测试的四个主要GBM细胞系中，EphA2，EphA3和aDG的膜存在明显的重叠。为了评估这些蛋白质是否可以复合在一起，在这些细胞系中进行了EphA3的免疫沉淀。结果显示EphA3与EphA2和aDG的共免疫沉淀。为了进一步证实这些受体之间的联系，在SJH1和JK2细胞系中进行了shRNA介导的EphA3敲低。继EphA3KD之后，观察到aDG水平相应下降。这些数据表明，aDG和EphA3可能与细胞膜相关。
    　　 接下来，使用Amnis图像流技术，这是一种流式细胞仪方法，可捕获单细胞多色荧光图像。该方法用于评估aDG与已知GSC标记的细胞表面共表达。最初，这是在手术时直接获得的离体GBM患者肿瘤组织上进行的。aDG的与EphA2，EphA3的，CD49f的CD133和CD15。使用Amnis和使用GBM细胞系的标准流式细胞术重复了此分析。结果表明，尤其是与EphA2，EphA3和CD49f共同表达aDG的模式相似，对于CD15，CD29和CD133则不太明显。为了评估高表达人群和低表达人群的干性特征，使用流式细胞仪对WK1GBM细胞进行了分类，并进行了神经球分析。结果表明，与低密度人群相比高密度人群中神经球的形成显着增加。另外，观察到aDG种群的细胞变化。低表达细胞未能形成神经球显示的附分化的细胞的形态。aDG高vsaDG低排序，重组了两个细胞群并评估了随着时间的推移aDG的表达。排序后的14天，低表达和高表达种群均得以维持，这表明这两个独特的种群可以在文化中长期共存。GSC分化后，aDG表达和茎干特性应丢失。为了测试这一点在神经球培养物中诱导了分化，并在分化后72h通过流式细胞术评估了aDG的表达，并通过QPCR评估了GSC标记的表达。结果显示，分化后aDG蛋白表达显着降低，这伴随着茎标记的基因显着下调和分化标记GFAP，BIII-微管蛋白的上调和OLIG2。
    　　 为了评估aDG糖基化对GBM进展和GSC表型维持的贡献，采用了aDGmAb，其特异性结合并阻断aDG上聚糖部分结合层粘连蛋白的能力。用IIH6抗体孵育神经球后，与用保持球体完整性的同型对照mAb孵育的培养物相比，观察到球形成的稳健而迅速的损失。在所有测试的原代培养物中均可靠地观察到了这种反应。观察到的分化反应是剂量依赖性的，而三种独立的IgM对照抗体未观察到反应。神经球丧失提示分化和增殖能力丧失。分化是通过采集的神经元和神经胶质谱系标记物。使用INCUCYTE技术在实时这种分化响应进行定量并显示出显着细胞附着以下IIH6处理。观察到的分化反应伴随着增殖的显着降低。在以下抗体处理观察到可忽略的细胞死亡诱导。如果在治疗的7天内去除抗体，分化作用是可逆的。如果附加IIH6单克隆抗体7天时加入，大多数再攻击肿瘤细胞的显着表现出的细胞形态的变化和两个周。这些数据突出了GBM细胞在早期分化过程中恢复的能力，但也易受IIH6抗体诱导的长时间终末分化的影响。
    　　 与瞬时信号不同，持续的ERK激活会诱导ERK转运到核，从而导致神经元细胞的前分化转录变化。基于以前的工作研究看来，这个机制在许多癌症，包括GBM也观察到。因此评估IIH6治疗后的ERK激活，发现pERK激活在治疗后24小时持续存在。IIH6处理后对pERK细胞定位的分析表明，激活的ERK主要位于细胞核中。所观察到的反应是相当于正微分控制，而在对照处理的细胞中，大部分的pERK的被保留在细胞质中。为了检查这种相同的机制是否在患者组织中起作用，而不是在培养物上起作用，通过IHC对aDG，EphA3，GFAP，pERK和Ki67的连续GS肿瘤切片进行了评估。结果证实在间充质部分中aDG和EphA3的共表达，其与更分化的GFAP+神经胶质部分是分离的。pERKIHC染色显示与GFAP+明显共表达神经胶质为主肿瘤区域也显示出较少的增生如图非常低的水平Ki67染色。该数据证实了持续的ERK激活发生在高级神经胶质瘤组织中，并且局限于分化程度更高的GFAP+，有丝分裂活性较小的肿瘤区域。
    　　 一项针对乳腺癌的研究发现，肿瘤细胞群体的整合素a6细胞质结构域剪接变体的表达有所不同。a6A在上皮肿瘤细胞上表达，而a6B在间充质肿瘤细胞上表达。数据显示，a6B是驱动EMT和癌症干细胞功能并促进肿瘤发生的关键变异。层粘连蛋白与整合素的相互作用可以激活ERK，但只能在主要表达具有完整细胞质尾巴的a6A的细胞中激活，而不是a6B。DG与层粘连蛋白结合时，可以抑制整联蛋白a6介导的ERK激活。整合素a6先前已被证明在GSC生态位中表达并具有功能，并且通常在生态位形成和基底膜附着过程中具有活性。通过QPCR评估了28个GBM标本中的a6A和a6BmRNA表达。结果表明，a6B和间充质标记N-钙粘蛋白和弹头的主要表达，而a6A和上皮细胞标记物E-钙粘蛋白是基本上不存在。还研究6种主要GBMGNS细胞系中a6A和a6B的相对mRNA水平，发现与a6A相比，a6B平均增加了12.1倍。与E-钙粘蛋白相比，这与间质标记N-钙粘蛋白平均增加210倍相关。此外，在所测试的主要GNS系中，a6B与间质和GSC标记高度相关。癌基因BMI-1是干细胞因子和多梳子族家族成员，可作为剪接因子ESRP-1的阻遏物。Mercurio及其同事在乳腺癌中显示，a6B受到自分泌VEGF-A信号的正调控，该信号最终导致RNA剪接因子ESRP-1的转录抑制。因此通过QPCR评估了GNS细胞系和GBM组织中BMI-1，VEGF-A和ESRP-1mRNA的水平，这表明BMI-1和VEGF-A，而未检测到ESRP-1水平。这表明与乳腺癌中观察到的机制相似的机制可以在GBM中起作用。为了确定整合素a6是否负责驱动IIH6处理后持续的ERK活化，进行整合素a6shRNA介导的KD与对照shRNA的比较。然后将这些细胞用IIH6阻断mAb处理，整联蛋白a6的KD不会逆转分化反应。当用整联蛋白a6阻断mAbGoH3预处理细胞时，观察到类似的反应。当在多种GNS细胞系上用作单一药剂时，GoH3阻断抗体几乎没有作用，并且似乎没有诱导分化反应。
    　　 单独使用GoH3治疗似乎可以诱导非常低水平的ERK激活。鉴于存在的大多数整联蛋白a6是具有截短的细胞内尾巴且ERK信号传导能力降低的a6B剪接变体，因此可以预料到这一点。当IIH6与GoH3联合使用时，观察到分化反应更快，这与治疗后24小时相比单独的IIH6持续ERK活化水平提高以及细胞增殖的更大降低相吻合。指示在IIH6处理后观察到的持续ERK活化不是通过整联蛋白a6驱动的。如上所述，EphA3与dystroglycan和整联蛋白a6共定位。继EphA3IP之后，在GBM细胞中观察到EGFR的共免疫沉淀作用，这表明EGFR也作为该复合物的一部分存在，并且可能参与调节ERK的活化。为了测试在抗体治疗后EGFR是否导致持续的ERK活化，在IIH6治疗之前先用吉非替尼或厄洛替尼对神经球进行预处理。EGFR抑制不能阻止分化的诱导。综上所述数据表明，aDG与层粘连蛋白结合时，与EphA2，EphA3，整联蛋白a6B，EGFR和可能的其他受体形成复合物，通过严格调节ERK信号传导介导去分化的GSC间充质样表型。
    　　 为了进一步定义GBM中的DG功能，出国看病网研究人员进行了慢病毒DAG1shRNA介导的KD，使用针对DAG1的五个靶标特异性19–25核苷酸序列的组合，测试了四个GBM神经球系。以下在JK2，RN1和WK1细胞中，观察到显著减少和神经球损失典型分化GBM细胞中。在SJH1的情况下观察对DAG1KD的小反应。KD后7-14天内，所有细胞均发生细胞死亡。鉴于这种快速反应，SJH1细胞被排除在进一步分析之外。体外DAG1KD还降低了EphA2，EphA3和CD49f的表达，同时显着增加了神经胶质分化标记GFAP的表达，表明KD诱导了神经胶质谱系分化。为了探索DAG1KD是否降低了体内GBM细胞的肿瘤发生潜能，将对照shRNA与DAG1KD细胞的原位移植入NOD/SCID小鼠的右侧纹状体。当观察疾病或疾病负担的迹象时，对动物实施安乐死。选择两个最高的DAG1表达线。对于WK1卡普兰Meier生存分析结果显示DAG1KD显著提高成活率p=0.0266，对照组的中位生存期为94天，而DAG1KD为109天。死后肿瘤组织的qPCR分析证实，与植入对照shRNA的动物相比 ，DAG1mRNA水平显着降低。在所有对照和DAG1KD植入动物中，苏木精和曙红染色均证实阳性肿瘤形成。KaplanMeier对JK2的生存分析表明DAG1KD显着提高了总生存率p=0.0043，没有动物达到存活端点，而对于对照组平均存活为195天。所有DAG1KD动物均发展为自发性胸腺淋巴瘤，这是该菌株中的常见现象，并按照道德准则予以安乐死。阳性肿瘤形成通过H＆E在所有对照shRNA嫁接动物染色确认，而在观察颅内肿瘤形成的无临床症状DAG1KD动物或颅内肿瘤检测通过H＆E染色验尸。
    　　 尽管数十年来的研究极大地增进对GBM的了解，但这一知识尚未转化为对患者有意义的生存益处。现在才刚刚开始完全认识到这些侵袭性肿瘤中存在的真正复杂性和功能性细胞状态。与TME的这种可塑性和复杂的相互作用在很大程度上归因于迄今为止取得的适度临床进展。例如实体瘤GBM，也具有具有干细胞样能力的癌细胞群。这些GSC具有自我更新，肿瘤萌发和复发的潜力，通常位于坏死和血管周围区域。在可能取得有意义的临床进展之前，需要更好地了解GSC生物学和驱动GBM中这些动态细胞状态的功能元件。脑中的糖聚糖生物学和功能相对研究不足，而在GBM中则鲜为人知。跨膜BDG在大多数脑肿瘤组织中高度表达。在两种血清中生长的永生化GBM细胞系中的aDG表达降低，并且在一种EphA3+GBM细胞系中表现出阳性表达。通过流式细胞仪分析，发现在无血清GNS培养物中生长的17/20早期传代原代GBM样品中有明显的aDG表达。似乎没有与分子亚型表达的相关性，这被期望作为GNS培养物上的层粘连蛋白或基质胶基底膜其趋于促进更生长MES状去分化的表型无关分子亚型的。IHC和IF表达分析表明，患者标本中脑肿瘤血管周围有很强的aDG表达。
    　　 这种血管周围表达模式证实了较早的研究。还在波形蛋白+，EphA3+中检测到大量的aDG表达，GFAP低MES样肿瘤区域。与其他区域相比，aDG+/EphA3+/波形蛋白+肿瘤区域中Ki67阳性细胞的数量增加，表明该肿瘤区室的有丝分裂活性更高。此外，注意明显的形态学差异，aDG+/EphA3+/波形蛋白+区具有拉长的间充质形态，而阴性区则具有更加圆润，不运动的外观。尽管在GBM和GS肿瘤中均很明显，但该观察在GS中最为明显，并且与疾病生物学相一致，波形蛋白+MES样的肿瘤细胞是高度能动并迁移到富BM在大脑区域，例如软脑膜。GS是GBM的罕见变体，尽管表现出明显的肉瘤和胶质瘤形态，但仍是具有GBM相关基因改变的单克隆肿瘤。尽管GBM不是上皮肿瘤，但在GS肿瘤中观察到的间充质分化是通过EMT样过程发生的。在GBM中，观察到类似的不太突出的MES样aDG+/波形蛋白+通常在大肿瘤切片中检测到肿瘤组织，这表明GBM也可能会经历类似的EMT样过程。最近进行的开创性研究描述了单个GBM肿瘤内不同程度存在的四种状态。这些状态都由肿瘤内的独特元素驱动并显示出独特的特性。像MES那样的NF1驱动区域高表达波形蛋白，并经常与TME相互作用和免疫浸润。与发现相似，MES样组织包含大量增殖细胞，反映了MES样肿瘤区室的侵略性。综上所述数据表明，aDG和EphA3是这种MES样肿瘤状态的关键组成部分，促进了与TME和血管周围环境中的BM蛋白的功能相互作用。
    　　 出国看病网研究人员还观察到aDG与其他已知GSC标记的强共表达。考虑到DG最近在出生后SVZ中调节神经干和祖细胞定性的作用，这不足为奇。通过aDGmAb阻断或DAG1下调破坏DG与层粘连蛋白的牢固连接，导致干细胞样特征的明显丧失和分化诱导。aDGmAb阻断的体外作用在治疗一周内是可逆的，而长期治疗则导致肿瘤细胞死亡，提示不可逆的终末分化。体内DAG1使用两种模型WK1和JK2进行KD研究，在后来的间充质模型中，在所有DAG1KD动物中均未检测到肿瘤，包括在移植后存活了598天的单只动物。这暗示在这种间充质亚型模型中aDG强烈依赖于肿瘤进展。
    　　 在aDG和EphA3之间发现的牢固联系进一步证实了先前的发现，将EphA3与MES样GSC表型联系起来。EphA3在复发性GBM中显着升高，并与EphA2协同促进肿瘤发生。基于发现aDG也可能富含复发性GBM。持续ERK活化诱导的ERK，导致在正常神经元细胞亲分化的转录变化细胞核和一些形式的癌症易位。在以前的工作中发现GBM中的EphA3KD诱导持续的ERK活化，从而诱导分化并降低细胞生长和致瘤性。对于aDG似乎是正确的，抗体介导的受体阻滞也导致持续的ERK活化和ERK转运到细胞核，然后发生GSC分化，最终导致细胞死亡。还观察到这种现象的患者组织，其中更分化，GFAP在+Ki67的波形蛋白低，肿瘤区域染色呈阳性磷酸化ERK1/2，在疾病进展期间突出的主动过程。尽管整联蛋白-a6A剪接变体通过与层粘连蛋白相互作用可以激活ERK途径，但对28个肿瘤标本的mRNA表达分析表明，整联蛋白-a6B剪接变体主要在GBM中表达，并与间充质标记物相关。a6B与乳腺癌中的间充质干细胞信号密切相关，并具有无法主动发出ERK信号通路的截短的细胞内结构域。因此，在GBM当aDG势必BM蛋白如层粘连蛋白，BDG最有可能的螯合MEK和ERK防止ERK途径的激活。发现表明，当与层粘连蛋白结合时，DG受体的a亚基主要起到阻止ERK活化的作用，从而在富含BM的区域和这些肿瘤内的壁ni中维持GSC和MES样种群。
    　　 DG在整个身体中广泛表达，尤其是在骨骼肌中，使得对该受体的潜在治疗靶向具有挑战性。似乎已经鉴定出独特的脑营养不良糖苷表位，并提出了抗体来识别这些独特的聚糖部分。可以设想可以开发出aDG脑特异性靶向抗体，尽管对正常大脑的靶向仍不理想。这可以通过将双特异性靶向策略与肿瘤特异性抗原结合使用来克服。减少或DG表达的丧失已报道在几个上皮肿瘤如乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，暗示在肿瘤侵袭和传播受体。解释这种现象的潜在机制是TME中MMP降解BDG。另外，aDG糖基化的缺陷也可能在癌症进展中起作用。许多上皮起源的癌症显示出aDG糖基化丧失与肿瘤进展之间的关联。GBM也显示了该机制的报告。在几个与aDG糖基化相关的基因中，LARGE可能对癌症生物学和LARGE的沉默产生重大影响促进癌细胞的迁移和锚定依赖性生长。糖基化的aDG可能通过促进与TME中的BM蛋白的相互作用来维持鲁棒的MES样表型，并进一步将GSC锚定在血管壁中。考虑到GBM中存在显着的异质性，两种机制都可能是正确的，其中将aDG糖基化调整为维持MES或GSC状态，因为肿瘤细胞离开这些壁ni时，aDG表达消失，肿瘤细胞分化和状态发生改变。
 
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　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
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