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肝纤维化是一种伤口愈合反应
  • 　　肝纤维化是一种伤口愈合反应，其特征在于慢性肝损伤后细胞外基质的积累。持续的肝纤维化通常会导致肝硬化或肝功能衰竭。a-SMA阳性的肌成纤维细胞的肝，活化的肝星状细胞的一个子集是肝纤维化期间负责ECM的沉积增加的主要细胞类型。此外，aHSC在将肝脏炎症与纤维发生联系起来中也起着关键作用。在肝纤维化的引发中的关键步骤是强炎症反应，持续的慢性炎症和在大规模纤维发生和瘢痕组织肝实质的进步取代ECM结果的积累。当肝脏定居巨噬细胞被诱导时，它们释放激活的HSC静态为成肌纤维促炎性和促纤维化介质。肝纤维化的分子机制了解甚少，因此，迫切需要确定有效的肝纤维化治疗方法。橙皮素，一种从柑桔果皮中提取的黄烷酮糖苷化合物。在肾纤维化，肝纤维化中具有多种药理作用和肺纤维化。在出国看病服务机构实验室中通过Mannich碱合成的橙皮素衍生物可以改善橙皮素的水溶性和生物利用度，被用作潜在的消炎性单体化合物，用于治疗急性肝损伤。在最近的一项研究中，进一步发现HD对慢性肝纤维化具有抗纤维化作用。
    　　 另一项研究提供了橙皮素通过拮抗刺猬信号通路来抑制肾纤维化的证据。hedgehog途径是用于生物标志物的开发和治疗靶标开发的肝纤维化的潜在重要的，因为刺猬蛋白信号的激活促进静态HSC的到纤维化肌成纤维细胞过渡。另外，刺猬信号与肝损伤和炎症反应有关，它们实质上促进了纤维发生的发生。胶质瘤相关癌基因1蛋白是转录因子Kruppel家族的成员，它具有五个保守的锌指DNA结合结构域，并与其靶基因的启动子结合。刺猬-Gli信号传导涉及各种细胞反应，例如增殖，分化和细胞存活，Gli-1充当增强Gli活性的积极反馈。刺猬的Gli途径，通常通过的Gli-1的上调，涉及人类癌症类型的多个包括肝癌和肾间质纤维化表现的异常活化。基于这些观察，假设HD可能通过与肝纤维化和炎症反应相关而对肝纤维化具有治疗作用。评估了HD在肝纤维化中的功能和分子机制。在这方面，这是第一个在体内和体外检测HD在CCI4诱导的小鼠慢性肝纤维化模型和TGF-B1刺激的LX-2细胞中抗纤维化作用的研究。
    　　 实验得到动物实验伦理委员会的批准。在本研究中使用了雌性雄性C57BL/6J小鼠。将小鼠随机分为六组。如前所述建立了CCI4诱导的肝纤维化小鼠模型。肝纤维化小鼠每两周一次腹膜内注射10％CCI4剂量为0.001毫升/克，持续4周。媒介物组的小鼠暴露于相同体积的橄榄油。三只接受HD治疗的组小鼠每两周一次腹膜内注射CCI4，并通过每日胃内给药分别接受不同剂量的HD。阳性对照组小鼠每两周一次腹膜内注射CCI4，并通过每日胃内给药接受秋水仙碱。载体和CCI4组小鼠接受等体积的生理盐水。在最终的CCI4后三天处死小鼠注射。从每组六只小鼠的肝组织中进行低聚甲醛固定和石蜡包埋，从每组八只小鼠中分离原代肝细胞。
    　　 通过灌注小鼠肝脏的胶原酶-磷酸酶分离了原代HSC和巨噬细胞。根据制造方案，分别用11.5％和20％的OptiPrep通过梯度离心将分散的细胞的悬浮液分层。肝窦窦内皮细胞通过选择性黏附从巨噬细胞级分中去除。从小鼠肝脏中分离出原代肝巨噬细胞并通过流式细胞术进行分析。将细胞与结合了PE的大鼠抗小鼠F4/80和结合了FITC的大鼠抗CD11b）一起孵育。此外，将与同种型匹配的无关对照抗体孵育的细胞和未染色的细胞用作阴性对照。用CytoFLEX流式细胞仪检测细胞，并用CytExpert软件分析细胞。使用RayBio(R)MouseELISA试剂盒测量血清TNF-a和IL-1B的水平。使用制造商推荐的方案进行测定。使用Thermomax酶标仪测量每个孔在450nm处的吸光度。至少进行了六个独立实验。
    　　 为了确定小鼠的肝形态并确定其肝纤维化，分别进行了苏木精和曙红染色和Masson三色染色。将多聚甲醛固定，石蜡包埋的肝组织切成薄片，以水合并通过标准方法染色。免疫组织化学在石蜡中进行了切片，使用了基于微波的抗原回收技术。使用自动数码幻灯片扫描仪对染色区域进行拍照和转换，并展示了代表性的视图。LX-2细胞在DMEM中培养。将浓度为2ng/毫升的重组人TGF-B1添加到细胞培养物中48小时。此外，在GANT61的5,10和20uM的剂量一个的Gli抑制剂根据制造商的说明书在LX-2细胞申请了剂量依赖性的测定。在整个研究过程中至少进行了三个独立的实验。HanliBiotechnology合成了Gli-1和阴性对照的小干扰RNA。根据制造商的规程，使用LipofectamineRNAiMax将siRNA-Gli-1或阴性对照转染LX-2细胞。转染6小时后，将培养基替换为新鲜培养基，再培养48小时。转染后通过实时PCR确认沉默效率。
    　　 通过TRIZOL试剂从原代HSC，巨噬细胞和LX-2细胞中分离总RNA，通过NanoDrop2000分光光度计进行定量。使用CFX96实时PCR系统进行实时PCR分析。用B-肌动蛋白标准化感兴趣的mRNA的比例。用RIPA和PMSF裂解缓冲液提取蛋白质，按照先前的描述进行蛋白质印迹程序。封闭印迹膜，并与目的一抗一起孵育。在这项研究中使用的抗体包括对a-SMA，Bax，Bcl-2有特异性的一抗。Col1a1，Gli-1，Shh，Smo，P65，p-P65;TNF-a，IL-1B，B-肌动蛋白;前胱天蛋白酶3，cle-caspase3。通过增强的化学发光系统将条带可视化。使用ImageJ软件对每种蛋白质印迹的信号强度进行定量，并以B-肌动蛋白作为内部对照进行标准化。
    　　 首先，出国看病服务机构确定了HD在CCI4诱导的小鼠进行性肝纤维化中的功能作用。从组织学上讲，苏木精和曙红染色显示，接受HD处理的肝纤维化小鼠剂量依赖性地抑制了肝细胞坏死，炎性细胞浸润和小鼠肝纤维化。先前的研究证实，秋水仙碱施用肝纤维化特征在于显著抗炎，抗纤维化和免疫调节作用，因此，秋水仙素用作本研究阳性对照。此外，用HD治疗肝纤维化小鼠后，血清ALT，AST和ALP降低。指示HD在体内在CCI4诱导的小鼠慢性肝纤维化模型中显示出肝保护作用。接下来研究了HD是否在胶原基质蛋白降解中起作用。Masson染色表明，胶原沉积显着抑制了从HD-治疗肝纤维化的小鼠受伤肝组织肝纤维化的小鼠进行比较。引人注目的是，用HD治疗肝纤维化小鼠进一步降低了TGF-B1和HA的血清水平，这与肝脏组织中Hyp的降低相对应，体内。综上所述，HD对CCI4诱导的肝纤维化小鼠的活纤维形成具有明显的抑制作用。进一步证实了HD在HSC上的功能性作用，HSC激活或转分化为成肌纤维细胞样细胞，这是肝纤维化期间ECM沉积的主要细胞类型。免疫组织化学分析的结果，a-SMA+myofbroblasts是在增加的CCI4与车辆的小鼠相比，诱导肝纤维化的小鼠。然而，接受HD治疗的肝纤维化小鼠以剂量依赖性方式显着降低肝组织中a-SMA的表达。一致地，与肝纤维化小鼠相比，从经HD处理的小鼠分离的原代HSC中，纤维生成基因的mRNA水平降低了。此外，通过蛋白质印迹进一步证实了a-SMA和Col1a1的蛋白表达。这些发现表明，HD介导了HSC的活化，有助于抑制小鼠肝纤维发生的开始。
    　　 免疫组织化学表明，四氯化碳4诱导的与HD治疗肝纤维化的小鼠显著降低F4/80+巨噬细胞浸润。众所周知，F480和CD11b是泛巨噬细胞的标志物。从小鼠中分离的肝巨噬细胞被定义为F4/80+CD11b的+细胞通过流式细胞术分析。与CCI4诱导的肝纤维化小鼠相比，HD处理的小鼠中炎症基因的mRNA水平降低。一致地，出国看病服务机构通过ELISA评估了血清中促炎细胞因子的循环水平。与肝纤维化小鼠相比，经HD治疗的小鼠的TNF-a和IL-1B的血清水平明显降低。同样，免疫印迹法证实了用HD治疗可抑制肝纤维化小鼠的TNF-a和IL-1B蛋白表达。此外，出国看病服务机构检测到HD显着抑制了NF-κB-P65的磷酸化和激活。这些结果表明，用HD治疗肝纤维化小鼠体内调节肝巨噬细胞的浸润，有助于抑制CCI4诱导的肝纤维化中的炎症反应。评估了HD对TGF-B1激活的LX-2细胞的影响。MTT测定的结果表明，HD，用浓度不高于16uM，对LX-2细胞的生存力在有限的抑制效果。此外，发现高于1uM的HD浓度对TGF-B1活化的LX-2细胞具有明显的抗纤维化作用，选择了1、2和4uM的浓度用于后续的体外实验。蛋白质印迹的结果显示HD在TGF-B1活化的LX中抑制了a-SMA和Col1a1的蛋白表达并抑制了a-SMA，Col1a1，Col3a1，TIMP-1和PAI-1的mRNA水平。-2细胞呈剂量依赖性。此外，双重免疫荧光分析显示，经2uMHD处理后，TGF-B1诱导的LX-2细胞中a-SMA和Col1a1持续降低。
    　　 出国看病服务机构研究了高清抗纤维化作用的机制。最近的报道显示橙皮素对肾纤维化的功能与刺猬蛋白信号有关。首先证实了HD对分离自小鼠的原代HSC中Hedgehog信号相关因子Gli-1，Gli-2，Sonic刺猬和Smoothened表达的影响。实时PCR和免疫印迹分析表明，接受HD处理的肝纤维化小鼠显着抑制Gli-1和Shh的mRNA水平和蛋白质表达，表明HD可能与这两个因素有关。值得注意的是，双重免疫荧光显示肝脏组织中Gli-1和成纤维细胞标志物a-SMA的免疫反应性共定位，与肝纤维化小鼠相比，HD处理的小鼠中Gli-1的表达降低。此外，LX-2细胞暴露于GANT61，GANT61对的Gli-1mRNA水平和蛋白表达的影响进行了测定，和GANT61的所用剂量显示出对可忽略的影响LX-2细胞活力。结果表明，HD处理后，TGF-B1激活的LX-2细胞中a-SMA和Gli-1的表达降低。此外，hedgehog-Gli1信号的激活诱导血小板衍生的生长因子上调，这是肝纤维化的关键驱动力。在这项研究中发现PDGF在CCI4血清中均被减弱HD处理的肝癌诱导的肝纤维化小鼠以及HD处理的TGF-B1激活的LX-2细胞的mRNA水平。在暴露于GANT61的TGF-B1激活的LX-2细胞中，a-SMA和PDGF的水平得以恢复。提示HD表现出的抗纤维化作用与Gil-1依赖性机制有关。刺猬信号与激活的HSC的凋亡有关，这是肝纤维化消退的关键事件。使用PE/AV-FITC染色的流式细胞仪分析显示，经HD处理的TGF-B1激活的LX-2细胞促进了细胞凋亡反应，在阻断Gli-1后被逆转。通过对与凋亡相关的裂解的胱天蛋白酶3，Bax和Bcl-2蛋白表达的免疫印迹分析证实了该作用。构建了siRNA靶标Gli-1，将siRNA转染到LX-2细胞后评估了Gli-1的敲低效率。结果表明，HD增加了Bax和裂解的caspase3的水平，而敲低Gli-1则实质上逆转了HD在LX-2细胞上的凋亡诱导特征。这些结果表明，Gli-1信号可能是参与HD调节肝纤维化发病机制的重要途径之一。
    　　 橙皮素是中药中常用的化合物，已在纤维性疾病中得到广泛研究。此外，据报道橙皮素具有抗氧化，抗致瘤和抗炎作用。出国看病服务机构最近的工作表明，HD对患有急性肝损伤和LPS处理的RAW264.7细胞的小鼠的炎症具有直接的抑制作用。进一步探讨了HD在慢性肝纤维化中的药理作用。在本研究中发现HD衰减的CCI4诱导的肝纤维化小鼠进行性肝损伤和肝纤维化，表明HD对肝纤维化的肝保护作用。此外，出国看病服务机构研究了HD抑制肝纤维化过程中胶原样基质沉积，并相应抑制了CCI4的纤维化因子。诱导的肝纤维化小鼠。一致地，HD显着降低了TGF-B1诱导的LX-2细胞中a-SMA，Col1a1，Col3a1，TIMP-1和PAI-1的表达。这些观察结果揭示了HD对肝纤维化的起始和进展的调节作用。此外，出国看病服务机构发现高清促进了LX-2细胞的凋亡。迄今为止，已有证据证实肝纤维化的消退与活化的HSC的凋亡有关，这是纤维化消退的关键步骤。阐明了HD的抗纤维化作用可能部分与其抗炎功能有关，因为肝纤维化与未解决的炎症反应有关。发现F4/80+HD治疗后，肝纤维化小鼠中巨噬细胞向肝组织的浸润明显减少。此外，HD可降低小鼠中的炎症因子的水平，从而有助于抵抗炎症反应。需要进一步的研究来揭示参与HD对肝纤维化炎症反应的分子机制。
    　　 还评估了HD减弱肝纤维化的潜在信号通路。HD显示出对肝纤维化相关的刺猬蛋白信号直接功能。进一步证实了HD在刺猬信号相关因子中的作用，并发现HD介导了HSC中Gli-1的表达。因此，出国看病服务机构得出结论：HD的影响可能取决于猬蛋白-Gli-1信号传导，因为Gli-1的缺乏很大程度上消除了HD对肝纤维化的治疗作用。总体而言，出国看病服务机构的研究首先发现HD减轻了CCI4诱导的肝纤维化小鼠的肝损伤和纤维生成，并抑制了活化HSCs中纤维生成基因的表达。实质上，HD预防了肝巨噬细胞中的炎症反应并降低了炎症因子的水平。此外，HD的抗纤维化作用至少部分通过抑制肝纤维化期间Gli-1的过度活化而与刺猬信号相关。这项研究表明，HD可能是治疗肝纤维化的潜在抗纤维化中药单体。
 
出国看病概况

海外医疗在国外发展较为成熟，比如在欧美等医疗技术发达国家，很多医院都设有国际病人办公室并配备多语种医学专业翻译人员，就医流程和模式都已相对成熟。在国内，海外医疗虽然还属于新兴行业，但发展势头迅猛，发展潜力巨大，市场前景广阔。
　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
出国看病适应症
靶向药物
 

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