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神经胶质瘤细胞复发
  • 　　胶质瘤实际上是脑中最流行的成人恶性肿瘤，其特点是复发频繁，进展迅速，攻击性行为和预后不良。各种手术方法，包括外科手术，放射疗法和化学疗法，可用于治疗神经胶质瘤。然而，胶质瘤患者的预后仍然很差，这可以归因于较高的肿瘤复发率，尤其是胶质母细胞瘤。因此，确定神经胶质瘤的发生和发展的分子机制非常重要。Chromobox蛋白同系物3，则异蛋白1家族的成员，已经被认为是用于转录抑制或激活，表观遗传修饰的分化十分重要，以及细胞的生长和。此外，CBX3有报道在许多癌症中失调，发挥在癌症发展和生长有关的基因的表观遗传调控至关重要的作用。CBX3有望成为癌症的潜在靶标，始终预示不良预后。因此，CBX3可能在肿瘤进展中起关键作用。CBX3在神经胶质瘤中的明确功能和机制仍然未知。在研究中发现CBX3在人类神经胶质瘤组织中高表达，并且高CBX3表达预示了神经胶质瘤患者的不良预后。因此，建立了介导RNAi靶向CBX3的慢病毒载体。同时，发现shRNA-CBX3在体外和体内确定CBX3在人脑胶质瘤进展中的作用和机制。
    　　 根据癌症基因组Atlas-CancerGenome，从出国看病网数据库收集了GBM患者和低度胶质瘤患者的预后数据。在每种情况下，根据RSEMRNASeqV2标准化结果评估CBX3表达。此外，从诊断之日至死亡之日的几天内，已测量了总生存期。此外，还从Oncomine数据库收集了不同类型的神经胶质瘤和正常组织中CBX3mRNA的表达。从中国胶质瘤基因组图谱。LGC和GBM中IDH1突变和MGMT表达的数据是从UCSCXena浏览器基于TCGA数据库获得的。评估了CBX3表达与IDH1突变之间的关系。根据MGMT表达的中位水平，将其分为两组：高表达组和低表达组。人神经胶质瘤U-87MG细胞和人肾上皮293T细胞已从细胞银行购买，并在含10％胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基中加工。该研究登记2012年至2017年间在医院接受初次手术的神经胶质瘤患者。此外，通过癫痫切除术获得了八个正常脑组织。所有患者均提供了知情同意书以参加本研究。新乡医科大学附属第一医院医学伦理委员会批准使用样本。立即将所有标本冷冻并保存在液氮中。没有患者在切除之前天真地接受治疗。
    　　 靶向CBX3基因和CDKN1AsiRNA序列的短发夹RNA慢病毒，并使用Lipofectamine2000转染到U87胶质瘤细胞中。同时，将空载体转染的细胞用作对照。简而言之，将总共4×10U87细胞以40％融合接种在6孔板中，并用shRNA-CBX3-慢病毒或阴性对照慢病毒感染。感染3天后，在荧光显微镜下观察到细胞，并通过qRT-PCR和Westernblot验证了shRNA-CBX3的抑制作用。使用Trizol从神经胶质瘤组织和细胞中提取了总RNA。CBX3和CDKN1A的mRNA表达水平已通过基于制造商协议的一步式RT-PCR试剂盒通过RT-qPCR进行了鉴定。转染后72小时收获细胞，并加入RIPA裂解缓冲液以在4°C下裂解细胞30分钟。然后，使用BCA蛋白质检测试剂盒确定蛋白质的浓度。每种处理的等量总蛋白已通过12.5％SDS-PAGE分离，然后转移到PVDF膜上。一抗包括兔抗CBX3，抗CDKN1A和抗GAPDH抗体。同时，已将辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG用作第二抗体，而GAPDH用作内部对照以使CBX3表达水平正常化。
    　　 收集指数期的U87细胞，用shRNA-CBX3或shRNA-Ctrl感染，以4×10细胞的密度接种，并在96孔板中进行处理。0，24、48、72、96和120小时后，将10ulCCK-8溶液添加到每个孔中。2小时后，使用酶标仪在450nm处测量吸光度。每组总共进行了5次重复，分别进行了3次。已经计算出神经胶质瘤U87细胞，并以每孔300个细胞的密度接种到6孔板上用于集落形成测定。细胞在37°C下孵育20天后，可见菌落已用4％多聚甲醛固定30分钟，并用0.1％结晶紫染色另外30分钟。最后，以每个平板细胞的菌落数×100％来测量菌落形成效率。用shRNA-CBX3或shRNA-Ctrl感染后，已计算出神经胶质瘤U87细胞，并以1×10细胞的密度接种到24孔板中。孵育后48小时，细胞暴露于50uMEdU中2.5h，固定后，透化并用Apollo反应混合物染色，用于EdU，Hoechst33,342，用于U87细胞核。之后，使用荧光显微镜将样品可视化。胶质瘤U87细胞已被shRNA-CBX3或shRNA-Ctrl感染，并在收获前于37°C孵育。随后，将细胞用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，并用75％的冰冷乙醇固定。使用细胞周期染色试剂盒对细胞进行处理，并按照制造商的说明在黑暗中孵育30分钟。此外，为了评估shRNA-CBX3感染对细胞凋亡的影响，已按照制造商的说明通过胰蛋白酶消化法收集了U87细胞，并与FITC偶联的膜联蛋白V和PI孵育。最后，通过流式细胞仪分析了细胞。
    　　 所有动物实验均经动物保护和使用委员会批准，并根据医院的实验方案进行。简而言之，已经用shRNA-CBX3或shRNA-Ctrl转染了神经胶质瘤U87细胞，并将16只雄性裸鼠随机分为CBX3下调组或对照组。然后，将4×10转染的U87细胞注射到每只裸鼠中以构建神经胶质瘤异种移植模型。在暴露于CO2之前，需要2个月的时间观察小鼠的存活时间安乐死。随后，将神经胶质瘤组织切片与抗Ki-67和抗CDKN1A抗体一起孵育。此外，选择了三个区域来确定阳性肿瘤的百分比和染色强度。
    　　 TCGA数据集和Oncomine数据库中神经胶质瘤中CBX3的表达
    　　 根据TCGA数据集，GBM组织中的CBX3表达水平明显高于LGG组织中的CBX3表达水平。此外，本研究中152名GBM患者的临床信息和基因表达谱与510名LGG患者的临床信息和基因表达谱相匹配，以进一步确定CBX3表达水平是否与患者生存率相关，这是通过Kaplan-Maier分析和log等级比较。表明脑胶质瘤患者较高的CBX3表达水平与较短的总生存期相关。这些发现表明脑胶质瘤中低的CBX3表达水平可能是患者良好OS的原因。另外，从在Oncomine数据库太阳脑统计结果表明，CBX3mRNA表达在间变性星形细胞瘤显著较高，弥漫性星形细胞瘤，GBM和少突神经胶质瘤显着高于正常脑组织。CGGA数据库的结果表明，CBX3的表达显著随着胶质瘤的等级增加。而且，从UCSC浏览器西娜的结果表明，CBX3表达在LGG患者野生型IDH1是显著更高和低表达MGMT。然而，在GBM患者可能是因为有患者IDH1突变体较少，并且在CBX3表达野生型和突变IDH1组。MGMT高表达组的CBX3表达明显高于IDH1低MGMT表达组的CBX3表达。
    　　 使用qRT-PCR和Western印迹检查了NBT和神经胶质瘤样品中CBX3的表达水平。结果表明，在脑胶质瘤组织的CBX3mRNA水平明显高于那些在NBTs相比。同时，CBX3表达水平在脑胶质瘤组织比在NBTs。为了进行统计分析，神经胶质瘤患者根据CBX3表达水平的中值分为高CBX3表达组和低CBX3表达组。随后，讨论了脑胶质瘤患者CBX3表达与临床病理特征之间的相关性。CBX3与肿瘤大小，卡诺夫斯基绩效量表评分，WHO分级，复发和生存状态。然而，CBX3的表达与切除水平，囊性改变，肿瘤位置，性别和年龄均无关。为了探讨CBX3表达对神经胶质瘤预后的影响，本研究进行了对数秩检验和Kaplan-Meier分析。结果表明，在OS和无复发存活在神经胶质瘤患者的高CBX3表达均较胶质瘤患者具有低显著下CBX3表达式。此外，根据组织病理学特征，在具有不同WHO等级的神经胶质瘤中进行了CBX3表达的Kaplan-Meier生存分析。人类肾上皮293T细胞已被shRNA-CBX3或shRNA-Ctrl感染，并且293T细胞中的CBX3蛋白水平已通过蛋白质印迹法测定。结果建议，CBX3表达水平在shRNA的-CBX3组较的shRNA-CTRL组。
    　　 人神经胶质瘤U87细胞系是应用最广泛的神经胶质瘤细胞之一，其具有体内强烈的致瘤性。为了更好地了解CBX3在神经胶质瘤中的作用，生成了表达GFP的shRNA-CBX3和shRNA-Ctrl，并将其转染到U87细胞中。慢病毒感染后超过85％的细胞显示出阳性绿色荧光。分别通过qRT-PCR和Western印迹分析了敲低效率。感染后，CBX3的mRNA和蛋白质以shRNA的-CTRL组的U87细胞水平显着更高与shRNA-CBX3组相比。为了更好地了解CBX3在神经胶质瘤细胞生长中的作用，已经对用shRNA-CBX3或shRNA-Ctrl转染的神经胶质瘤U87细胞进行了CCK-8和集落形成分析。与shRNA-Ctrl组相比，CBX3敲低将基本上抑制shRNA-CBX3慢病毒处理的U87细胞的增殖潜力和生长。此外，shRNA-CBX3处理的细胞的体外生长在第4天和第5天。集落形成也显着降低之后CBX3抑制。通过EDU细胞图像测定法评估了CBX3对下调CBX3后增殖的影响。与CCK-8和集落形成分析的结果一致，EDU细胞图像分析的结果表明，shRNA-CBX3组的U87细胞的EdU阳性率低于shRNA-Ctrl组，并且EdU数量阳性细胞减少约22.5％。因此，这三个实验的结果表明，CBX3敲低将明显抑制神经胶质瘤U87细胞的生长。
    　　 细胞增殖与细胞周期分布直接相关。因此，随后通过流式细胞术检查了CBX3下调后U87细胞的细胞周期分布。随着CBX3的抑制，进入G0期的细胞数量增加了28.4％，进入S期的细胞数量下降了14.5％。还检查了CBX3敲低对神经胶质瘤U87细胞凋亡的影响。结果表明，shRNA-CBX3组的U87细胞凋亡百分比明显高于shRNA-Ctrl组。这些结果表明，CBX3敲低可以通过提高G0期的细胞百分比，同时降低S和G2期的细胞百分比并诱导凋亡而显着抑制U87细胞的增殖。为了在体外探索神经胶质瘤细胞中CBX3的靶标，用shRNA-CBX3或shRNA-Ctrl转染U87细胞。通过qRT-PCR和Western印迹分别鉴定了CDKN1A的mRNA和蛋白表达水平。结果表明，与shRNA-Ctrl转染相比，shRNA-CBX3转染后CDKN1A的CBX3mRNA表达水平明显上调。另外，在shRNA-CBX3转染组中，CDKN1A的CBX3蛋白表达水平显着更高。
    　　 CBX3敲低将抑制胶质瘤细胞的体外增殖。为了评估CBX3的下表达是否会降低体内神经胶质瘤的生长，将稳定转染了shRNA-CBX3或shRNA-Ctrl的人U87细胞注射入裸鼠的大脑，以建立颅内异种移植模型。结果表明，与shRNA-Ctrl组相比，shRNA-CBX3组的颅内肿瘤体积明显减少。另外，已经进行了IHC测定以检查Ki-67水平，这是专门用于预测肿瘤增殖的指标。在shRNA-CBX3组中发现Ki-67蛋白显着降低，IHC结果还显示，shRNA-CBX3组中CDKN1A表达上调，与体外结果一致。此外，分析不同处理组之间的OS，一个Kaplan-Meier存活曲线作图，这表明在的shRNA-CBX3组小鼠该操作系统是显着延长与在的shRNA-CTRL组相比。总之，这些数据表明，CBX3的下调将通过上调CDKN1A的表达而在体内抑制神经胶质瘤的生长。
    　　 在shRNA-CBX3U87细胞中转染CDKN1AsiRNA后，CDKN1AsiRNA组中CBX3的相对表达水平与阴性对照组相比无显着性差异，而CDKN1A的相对mRNA表达水平也有显着差异。阴性对照组的患者。此外，CDKN1A表达的下调部分恢复在U87细胞中，将其通过的shRNA-CBX3所示。HP1家族由保守的染色质结合蛋白组成，可以直接与甲基化的H3K9启动子区域结合，从而参与基因表达的异染色质沉默。HP1基因的异常表达可诱发多种人类疾病，包括癌症发展和机体缺陷。由CBX3编码的异染色质蛋白1Gamma是HP1的旁系同源物。在许多癌症中都发现了高CBX3表达，CBX3可能在癌症进展中起关键作用，因此有望成为肿瘤治疗的潜在靶标。CBX3在非小细胞肺癌组织中过表达，并且高CBX3表达预示了这些癌症患者的预后不良。CBX3表达水平与Ki-67表达水平呈正相关，这预示着前列腺癌患者的预后不良。CBX3在癌症进展中可能具有重要功能。CBX3在胶质母细胞瘤中过表达，并且沉默CBX3可以通过阻断G2期的细胞周期来抑制胶质瘤U373细胞增殖。然而，CBX3在神经胶质瘤患者的进展和预后中的明确作用仍未完全确定。
    　　 在本研究中首先使用来自TCGA的神经胶质瘤患者的公开表达谱和临床数据。TCGA数据分析表明，与LGG组织相比，GBM组织中CBX3表达水平显着上调。此外，与NBT相比，CBX3被证实在人类神经胶质瘤组织中高表达。CGGA数据库中，随着胶质瘤等级的升高，CBX3的表达显着增加。CBX3的表达与IDH1突变和MGMT的表达密切相关。其次，CBX3的表达与肿瘤大小，KPS评分，WHO等级，复发和生存状态密切相关。Kaplan–Meier分析证明，患有CBX3高表达的神经胶质瘤患者的OS和RFS相对较短。进一步的多变量和单变量生存分析证实，可以使用CBX3作为胶质瘤患者的独立预后生物标志物。第三，建立可稳定下调U87细胞中CBX3表达水平基因的shRNA-CBX3慢病毒载体，并转染神经胶质瘤U87细胞。结果表明，CBX3敲低可以通过增加G0期细胞的百分比，同时降低S和G2期细胞的百分比并诱导凋亡来明显抑制U87细胞的增殖。
    　　 CBX3可以通过靶向CDKN1A促进结直肠癌而促进结肠癌细胞的增殖。另外，在舌鳞状细胞癌中，CBX3还通过CDKN1A下调通过调节G1期来促进增殖。随着CBX3表达的增加，CDKN1A的启动子活性显着降低，CBX3可以与甲基化的H3K9结合，然后募集辅因子或直接与靶标相互作用。此外，当下调CBX3时，CDKN1A启动子上的组蛋白标记h3k9me也显着降低。CDKN1A启动子中甲基化的H3K9结合CBX3阻止了CDK6作为转录调节子的功能，因此CBX3可以沉默CDKN1A的表达。然而，CBX3在神经胶质瘤中的机制仍有待充分阐明。在这项研究中还发现，与shRNA-Ctrl相比，在体外转染shRNA-CBX3后CDKN1A的mRNA和蛋白表达水平显着上调。与体外测定结果一致，异种移植测定和IHC测定还表明，响应于CBX3抑制，肿瘤生长和Ki-67表达水平被抑制，而CDKN1A表达水平在体内增加。CDKN1A是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，可以抑制CDK1和CDK2的复合物。
    　　 在研究机构的研究中CBX3表达的下调可以抑制神经胶质瘤细胞的增殖。但结果表明CBX3表达与细胞周期的G1期有关，而不与G2期有关。这可能与选择的不同小区有关。此外，CBX3可以通过抑制细胞周期相关基因CDK6的表达来促进体内和体外结肠癌细胞的增殖和细胞周期的进展。CBX3可能通过CDKN1A调节神经胶质瘤U87细胞的增殖。先前的多项研究表明，CDKN1A可以调节S和G1期的细胞周期进程。验证CDKN1A可以与增殖细胞核抗原，其在S期DNA复制和DNA损伤修复[关键作用相互作用。因此，CBX3途径可能与神经胶质瘤U87细胞中G1期的细胞周期有关。最后，CDKN1A表达的下调部分恢复了U87细胞的细胞增殖能力，这被shRNA-CBX3抑制。CDKN1A表达是由肿瘤抑制蛋白p53调节的，而CDKN1A可以介导p53依赖性细胞周期停滞在G1响应于多个应激刺激。此外，CBX3可通过下调NCOR2和ZBTB7A来促进肺腺癌中肿瘤促进基因的表达。CBX3通过抑制胰腺癌细胞中的FBP1充当有氧糖酵解的正调控剂。因此，研究机构推测CBX3的功能部分取决于CDKN1A途径，是否还有其他重要因素也参与了胶质瘤中CBX3的调控网络。发现表明CBX3可能通过抑制CDKN1A促进神经胶质瘤U87细胞的生长。CBX3在神经胶质瘤中过表达，而沉默CBX3可以抑制神经胶质瘤U373细胞增殖，但是，还需要进一步的验证和功能评估来评估CBX3在其他神经胶质瘤细胞系中的作用以及这种关联的显式机制。
    　　 总之，从发现表明CBX3在人类神经胶质瘤的进展和预后中起着至关重要的作用。通常，CBX3在人神经胶质瘤组织中高表达，这预示了神经胶质瘤患者的预后不良。此外，shRNA-CBX3下调CBX3表达可通过在体内外通过上调CDKN1A来抑制神经胶质瘤U87细胞的增殖。CBX3可通过靶向CDKN1A刺激神经胶质瘤U87细胞的生长，从而可作为神经胶质瘤临床治疗的新靶标。
 
出国看病概况

海外医疗在国外发展较为成熟，比如在欧美等医疗技术发达国家，很多医院都设有国际病人办公室并配备多语种医学专业翻译人员，就医流程和模式都已相对成熟。在国内，海外医疗虽然还属于新兴行业，但发展势头迅猛，发展潜力巨大，市场前景广阔。
　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
出国看病适应症
靶向药物
 

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