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神经胶质瘤的分级
  • 　　过去主要基于组织学标准的神经胶质瘤的分级在过去几年中已被诊断或预后生物标志物所补充。在异柠檬酸脱氢酶基因1或2中发现“亚型”突变为少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤提供了诊断和预后的生物标志物。这将它们与IDH野生型神经胶质瘤区分开来，后者预后较差。IDH野生型和IDH突变的胶质母细胞瘤在组织学上相似，但在分子上截然不同，不仅其IDH突变状态不同。因此，仅在实验环境中才可能对突变IDH的效果进行直接比较和评估。表达突变体IDH的细胞将a-酮戊二酸催化成2-羟基戊二酸的D对映体，这会导致DNA超甲基化剂表型。突变型Idh在小鼠脑中的发育表达可能导致出生后早期致命性脑出血，可能是由于稳定的低氧诱导性缺氧诱导因子，胶原蛋白成熟受损以及基底膜结构和功能。这种致命的表型排除了突变型Idh的肿瘤作用的研究。对诱导型Nestin-Cre介导的Idh1R132H在脑室下区域的成年神经祖细胞中表达的研究规避了胚胎致死性。这些小鼠的SVZ增大，其静止神经干细胞及其后代数量增加，但并未形成脑瘤。相反，他们发展了脑积水，这是脑萎缩的标志。高细胞内水平的R-2-羟基戊二酸的生长延迟效应似乎与IDH1R132H的肿瘤促进作用相矛盾。突变型Idh1，Atrx和Pten的组合在实验模型中形成的神经胶质瘤，但尚未解决Idh1R132H本身在肿瘤性神经祖细胞形成中的作用。在RCAS模型中已显示出突变型Idh1在抑制实验性神经胶质瘤中的免疫浸润细胞中的作用。
    　　 假设突变体IDH和2-HG的产生通过触发降低增殖或使肿瘤细胞易于细胞死亡的细胞途径来诱导生长延迟。在小鼠和细胞模型中测试该假设，以选择性研究突变型Idh1在已建立的固有脑肿瘤模型中的作用。所述IDH-mutant神经胶质瘤起始细胞和肿瘤以及对应于人IDH-mutant星形细胞瘤和成胶质细胞瘤，产生高水平的2-HG的，并呈现出前神经表达谱。选择这种方法来比较Idh-wildtype和Idh的转录组突变的肿瘤，已经确定了丰富的基因集，可用于内质网应激反应和miRNA家族96-182-183，可控制信号量并介导ER应激反应。
    　　 为了研究突变体IDH1R132在肿瘤发生和扩散中的病理功能，出国看病网研究人员生成了Idh1的敲入小鼠模型。Cre的表达用突变的外显子3替换了Idh1基因的外显子3，并且可以用突变特异性抗体H09检测所得的Idh1R132H。Idh1敲入小鼠与野生型或p53和Pten；p53小鼠，导致Idh1和Idh1;p53和Idh1;Pten;p53小鼠对照。将所有小鼠饲养在ROSA26报告基因背景中，以鉴定重组细胞。突变IDH1催化a酮戊二酸进入D2HG，其积聚在IDH突变肿瘤，并且在研究人员的模型，复制人类IDH突变肿瘤的代谢变化。确定Idh1R132H对幼稚的神经干细胞的作用，从鼠SVZ衍生了神经干细胞，并用腺苷诱导了Idh1R132的表达。经过多次传代，非重组的B-半乳糖苷酶阴性细胞或球体的生长速度快于Idh-突变体部分。用腺cre重复转染可“恢复”B-半乳糖苷酶阳性Idh突变细胞群，表明Idh野生型细胞比Idh突变细胞具有生长优势。增长减少Idh突变细胞被p53的其他纯合缺失过度补偿，使Idh细胞比野生型细胞具有生长优势。与野生型对应物相比，所有Idh1突变培养物的增殖持续降低。caspase活性测定显示Idh中的凋亡增加了1.5倍突变细胞培养。集落的形成，自我更新的量度，显著减少IDH相比文化的Pten的对照。总之，将Idh1R132H引入幼稚神经干细胞可减少细胞增殖并增加体外细胞凋亡。
    　　 通过将Idh1小鼠与GLAST-creER和ROSA26报告基因小鼠杂交，评估了Idh1R132H对干细胞生长和体内肿瘤发生的影响。他莫昔芬全身给药并导致SVZ干细胞群体中Cre表达。Cre激活五周后，通过Ki67标记确定SVZ中的增殖。在SVZ和GLAST-creER的call部下区域总体上重组细胞的数量较少；Idh1小鼠与对照组相比，但在IDH突变的SVZ来源的细胞中，按比例的Ki-67标记的核仍显着减少。他莫昔芬诱导的GLAST-creER的长期观察；ROSA26;Idh1小鼠或腺注射的ROSA26小鼠；Idh1小鼠显示了重组的SVZ干细胞群，但没有肿瘤。确认突变Idh1的肿瘤生长延迟作用，生成了Idh和Idh小鼠。Idh1小鼠和野生型小鼠作为对照。在30至50天内，向新生的Idh野生型或Idh突变型小鼠的脑室内注射表达PDGF-IRES-Cre的逆转录病毒可诱发胶质母细胞瘤，发病率>90％。Idh突变小鼠的肿瘤中含有高水平的D2HG，这与人类IDH突变星形细胞瘤的发现一致。而使用Idh控制仅突变或无突变都会发展出具有长潜伏期的肿瘤，p53小鼠已在30天发展出肿瘤。突变体Idh1的额外表达将肿瘤形成延迟了35天。两种Pten等位基因的进一步缺失均导致Pten和Idh小鼠的肿瘤发生加速，Idh野生型组，存活时间较短Idh突变组。Idh突变和野生型肿瘤在神经和神经胶质标志物表达或肿瘤微环境中没有差异。注射PDGF-IRES-Cre逆转录病毒的新生儿ROSA26报告基因小鼠在150天后发展为小浸润性神经胶质瘤，再次证实了突变体Idh1的生长延迟作用，这些肿瘤的Idh突变已在DNA上证实。总之，研究人员在这里表明突变型Idh1延迟了肿瘤发生。Pten和Idh小鼠的腺癌诱导的肿瘤再次在形态上无法区分，但发生率较低。为了与IDH突变型Cre腺癌引起的肿瘤的发生率降低保持一致，植入NOD-SCID纹状体的Idh1或Pten细胞也显示出差异，Idh1肿瘤的肿瘤发生率更低。
    　　 了解突变型Idh1如何减少细胞生长并促进凋亡，研究人员对Idh1和Pten进行了RNA测序。基因集富集分析显示Idh1细胞中ER反应和ER应激诱导的细胞凋亡途径显着丰富。用ER应激诱导剂衣霉素或毒胡萝卜素处理Idh1突变细胞会增加Idh1BTIC中的细胞死亡。为了探讨这种ER应激敏感性是否由D2HG介导，研究人员用Adh-5198处理了Idh突变细胞。反之，将Idh1野生型细胞与D2HG混合，然后将其暴露于衣霉素和毒胡萝卜素。Idh1BTIC在衣霉素处理后显示出4倍的凋亡增加，而Pten中则是1.5倍。用AGI-5198抑制可预防ER应激诱导的Idh1BTIC中的凋亡，进而用10mg/mL-2-羟基戊二酸二钠盐处理Pten单独用AGI-5198或D2HG治疗而不用衣霉素或毒胡萝卜素对ER应激致敏的Pten没有效果。分析了内质网应激触发的未折叠蛋白应答途径的激活。UPR由三个应激受体介导：需要肌醇的跨膜激酶，蛋白激酶RNA样ER激酶；激活转录因子。ATF4和CHOP在PERK的下游激活。未经衣霉素或毒胡萝卜素处理，Idh和Pten表现出相似水平的PERK下游靶标，Atf6及其靶标Grp94和X-box靶标结合蛋白1，Grp78，尽管在这种条件下无法检测到Chop蛋白。衣霉素或毒胡萝卜素处理上调了Idh1中的UPR基因，但未在Pten中上调。XBP1mRNA的剪接是IRE1途径激活的直接指标，实际上在衣霉素和thapsigargin处理的Idh1中，内质网应激期间的Xbp1剪接增加了。在衣霉素处理的荷瘤小鼠体内也观察到了这种作用。然后，研究人员评估在Idh和Ptens衣霉素和毒胡萝卜素治疗8小时后，UPR基因蛋白水平的变化。在这两种BTIC基因型中，Chop逐渐积累，但在Idh1中却以更高的速率积累。即使两种基因型中的Grp蛋白水平也保持恒定，即使Grp78转录本差异表达。衣霉素对体内荷瘤小鼠的体内治疗显示，DMSO治疗的Pten组中几乎不存在caspase-3标记的凋亡核和衣霉素治疗组中的稀有阳性细胞核，两组之间无显着差异。相反，IDH1Pten的肿瘤具有更高基线的caspase的活性的Pten的肿瘤和细胞凋亡在衣霉素处理的显著增加IDH1的Pten的肿瘤，也就是说，衣霉素在体内使Idh突变的肿瘤对细胞凋亡敏感。内质网应激通路转录本的表达分析表明，Idh1中Chop转录本的表达上调肿瘤与Pten对照相比。总体而言，显示Idh1R132H突变在体外和体内都使BTIC对ER应激敏感。
    　　 为了确定Idh1R132H介导的内质网应激敏化的机制，比较Idh1和Pten的miRNA表达谱。ER诱导的UPR信号传导与miRNA表达之间的功能性联系揭示了蛋白质稳态调节的机制，而ERUPR调节miRNA的生物发生。发现31个显着差异表达的miRNA。对前14个DE-miRsqRT-PCR的验证确定了miR-183-5p被最明显地差异调节。miR-183是包含miR-182和miR-96的miRNA簇的一部分。qRT-PCR证实了Idh1细胞中所有3个miRNA的显着上调。这是分析这些miRNA参与调控凋亡途径的起点。
    　　 为了确定miR-183，miR-182和miR-96在调节Idh1和Pten增殖和凋亡中的作用，用模拟物和拟南芥转染了它们。细胞融合和生长率通过活细胞成像确定。用miR-183模拟物转染的Pten和经antagomiR-183处理的Idh1BTIC与对照相比显着增长，而用miR转染-96或miR-182模拟物没有显着改变其增长率。为了研究miR-183如何使细胞对衣霉素敏感，用miR-183模拟物转染了miR-183基线水平较低的Pten细胞。衣霉素对Pten-miR-183细胞的处理显着提高了caspase的活性。相应地，用miR-183antagomir转染Idh细胞可显着降低衣霉素诱导的细胞死亡，也就是说，拮抗miR-183使细胞对衣霉素诱导的ER应激不敏感。，并在这种情况下抵抗IdhR132H介导的作用。相反，miR-182和miR-96对体外细胞增殖没有显着影响，并且在Idh1或Idh1BTIC中未调节衣霉素诱导的ER应激。总之，在这里显示miR-183介导BTIC中Idh1突变相关的ER应激敏化。在IDH突变的肿瘤中，miR-183的基线表达水平较高。研究人员通过将miR-183或miR-183antagomir表达盒插入PDGF-IRES-cre逆转录病毒载体中，证实了其在体内的病理生物学作用。PDGF-IRES-cre-miR-183ant在Idh小鼠中诱导肿瘤和具有PDGF-IRES-cre-miR-183。Pten-miR-183小鼠显示出显着的肿瘤发生延迟，存活期增加了29天，而Idh小鼠显示出明显的肿瘤形成加速，减少了9天。总之，miR-183在体外IDH突变BTIC和体内IDH突变实验性神经胶质瘤中介导ER应激反应。
    　　 为了鉴定与凋亡相关的miR-183的靶结合位点，研究人员进行了TargetScan并鉴定了23种差异调节基因semaphorin3E。Sema3E通过抑制细胞凋亡途径来调节肿瘤细胞的存活。通过在Pten中表达miR-183模仿物来证实miR-183与Sema3E的相互作用，从而导致Sema3E转录本的高度显着下调。相反，miR-183抑制剂在Idh1细胞中的表达显着上调了Sema3E转录本。miR-183结合的荧光素酶报告基因测定到含有野生型或突变的miR-183-5p结合位点的Sema3E的5'非翻译区，当miR-183结合Sema3EUTR而不是突变的对照Sema3E时，萤光素酶信号降低UTR，即miR-183与Sema3E启动子之间存在功能相互作用。保持一致，用两种不同的shRNA敲低Sema3E可降低Pten细胞的增殖，使它们对衣霉素诱导的内质网应激敏感并诱导凋亡。这种相互作用在Idh中得到了进一步证实，后者显示Sema3E。总而言之，在这里显示了miR-183在靶向Sema3E和降低其表达中的作用，从而拮抗凋亡抑制作用，使细胞对内质网应激更为敏感。为了证明Sema3E和miR-183表达呈负相关，分析了miR-183的转录本，发现与Pten对照相比，Idh1肿瘤中miR-183表达增加的统计学意义无统计学意义。Idh1肿瘤中Sema3E表达降低的非显着趋势。在鼠脑肿瘤上对Sema3E蛋白进行的免疫染色显示，肿瘤细胞中的表达斑片状，在选定的神经元群体中广泛表达。总体而言，Idh突变型和IDH野生型肿瘤之间无显着差异。
    　　 为了将实验结果转化为人类神经胶质瘤的生物学特性，研究人员在选择的人类神经胶质瘤中分析了miR-183和Sema3E转录本。将IDH突变星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤与具有胶质母细胞瘤分子特征的IDH野生型星形细胞胶质瘤和IDH野生型GBM进行了比较。先前已经描述了本研究中使用的肿瘤，并对其分子进行了详细表征。首先，确定IDH突变体和IDH野生型神经胶质瘤相比，IDD突变型神经胶质瘤中有4个IDH野生型星形细胞瘤，并且发现miR-183的表达明显较高。183个转录物水平。miR-183通过与Sema3E的3'UTR结合而下调Sema3E。同时，在所有IDH突变型肿瘤中Sema3E转录水平均较低，在IDH野生型神经胶质瘤中Sema3E转录水平显着较高，与体外实验的预测一致。较高的Sema3E表达水平与研究人员自己的队列以及癌症基因组图谱队列的患者生存期较短有关。具有较低Sem3E表达的患者的更长生存期是由该人群中IDH突变型肿瘤的过度表达所解释的，显示IDH突变型神经胶质瘤表达高水平的miR-183，从而下调其目标Sema3E，而Sema3E的表达与存活率呈负相关。
    　　 在研究中展示了突变型Idh1在神经胶质瘤细胞对ER应激的敏感性中的新作用，它通过上调miR-183并抑制其靶标SemaE3导致凋亡。诱导Idh1R132H表达以及新生儿SVZ中Pten和p53的丢失。该模型允许肿瘤在类似于年轻人成年人SVZ的环境中发展，即在起源细胞的某个发育阶段发展；结合在星形细胞瘤中常见的Idh1R132H和p53突变；过表达PDGFR，它是IDH突变星形细胞瘤的特征，并且快速形成肿瘤，以便研究大型队列以及抑制或刺激信号的作用。通过比较Idh突变体与野生型细胞，即Idh1与p53突变肿瘤，以及Idh1与Pten突变肿瘤，选择性地研究了突变型Idh1的作用。与IDH突变的人类肿瘤相对应，IdhR132H突变的鼠细胞和肿瘤产生代谢产物D2HG。IdhR132H突变在体外延迟了神经干细胞的自我更新和增殖和体内。这与先前的报道存在差异，干细胞中突变型Idh1R132H的存在导致祖细胞库的扩大。研究有可能使用突变特异性抗体更准确地追踪重组的Idh1R132H细胞的命运，而先前的研究仅研究了重组的间接证据。与IDH野生型“配对”相比，人类IDH突变型神经胶质瘤的一个关键发现是相对缓慢的生长，尽管应该承认，这些“配对”是生物学上不同的实体，仅具有共同的形态特征。直接比较IDH-突变型和IDH-野生型神经胶质瘤的病理生物学特性使得难以剖析突变型IDH的特定作用。因此，研究人员的模型旨在识别与IDH1R132H相关的生物学效应，将Idh1与p53突变的肿瘤以及Idh1与Pten进行比较-突变肿瘤。对应于人的同行，实验IDH突变体和野生型胶质瘤是不可区分的形态，和IDH突变胶质瘤产生D2HG。重要的是，虽然不可能直接证明突变IDH在人肿瘤中的生长抑制作用，但研究人员可以证明Idh1显着延迟了肿瘤发生。实验范式与以前的研究不同，它结合了IDH突变星形细胞瘤的一些但不是全部遗传损伤。菲利普及其同事的研究与研究人员的模型有很多共同点，例如靶向Pten的突变IDH1的表达，而不是p53的表达。相反，他们的模型还针对Atrx，这是IDH突变星形细胞瘤的诊断突变，并且它需要额外的CDKN2A缺失才能引发肿瘤。
    　　 IDH突变体与野生型肿瘤的直接比较表明，突变体IDH使BTIC对内质网应激敏感。这导致了DE-miR的鉴定。miRNA控制着许多生物学过程，例如细胞周期，凋亡，干细胞分化和免疫反应，它们在分化和维持组织特性中也起着关键作用。miR-183受到差异调节。这个miRNA簇是高度保守的，miR-183在发育过程中对精神健康和癌症具有多种作用，利用多种机制控制发育，能量和新陈代谢以及免疫信号传导。miRNA簇失活的小鼠模型显示视网膜变性，但没有其他表型。在肺癌中，miR-183的过表达抑制生长，而在髓母细胞瘤中也显示出过表达。在恶性神经胶质瘤中，已经描述了miR-183对IDH2和HIF1a表达的作用，但未提供任何机制。
    　　 研究人员将Sema3E确定为miR-183的直接靶标。信号量蛋白是一大类保守的，分泌的和膜相关蛋白，在N末端胞外部分具有信号蛋白域和PSI域。信号量指导分子及其受体神经丛通常在癌症中表达不当。最近发现，Sema3E可通过抑制细胞凋亡途径来抑制乳腺癌中的肿瘤细胞存活，该过程可通过抑制由PlexinD1依赖受体触发的凋亡途径来抑制。与研究人员的发现相似，更高的Sema3E水平与更具攻击性的IDH野生型神经胶质瘤相关，已证明Sema3E水平与人类乳腺癌的转移进程有关。Sema3E沉默可诱导4T1小鼠乳腺癌发生凋亡，这与研究人员的发现一致，即IDH突变的Sema3E细胞对细胞凋亡更敏感，尤其是在内质网应激下。较低的Sema3E表达与较好的存活率相关，因为Sema3E肿瘤与IDH突变密切相关，而IDH突变与较好的临床结果相关。抑制IDH1R132H的酶促作用的药物可以抵消D2HG的生长延迟，凋亡促进作用，因此有可能降低旨在诱导细胞毒性应激和细胞死亡的治疗功效。
 
出国看病概况

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　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
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靶向药物
 

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