出国看病
 
神经胶质瘤细胞与ECM的相互作用
  • 　　神经胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤。它们的高度侵袭性和单个肿瘤内活性致癌途径的异质性使治愈性疗法的发展复杂化，并导致患者预后不良。胶质瘤细胞表达中间丝状蛋白胶质原纤维酸性蛋白以及其替代剪接变体GFAP-o相对于其规范剪接变体GFAP-α的水平，与低级和低级恶性神经胶质瘤相比，IV级高。在这项研究中，高GFAP比可诱导粘着斑中双特异性磷酸酶4的表达。通过专注于DUSP4上游和下游参与细胞与细胞外基质相互作用的途径，发现高GFAP比可使神经胶质瘤细胞更好地侵袭大脑。这项研究支持以下假说，即具有高GFAP比的神经胶质瘤细胞具有高度侵袭性和更恶性的细胞，从而使GFAP替代剪接可调节神经胶质瘤细胞。ECM交互以DUSP4依赖性方式进行。称为神经胶质瘤的神经胶质细胞肿瘤形成了一组异质的原发性脑肿瘤。多形胶质母细胞瘤，也称为IV胶质瘤或星形细胞瘤，是胶质瘤最常见，最恶性的形式，患者预后很差。目前，尽管进行了切除手术，放疗和化疗，但诊断后的中位生存时间为4到20。高侵入性和肿瘤内异质性是治疗反应差的关键因素。侵袭性肿瘤细胞从肿瘤核心移开，逃避治疗并开始复发。由于异质性和代偿性致癌信号传导活性，迄今为止，大多数单分子靶向疗法在临床试验中均失败了。为了改善治疗策略，对肿瘤细胞如何整合信号信息以及与其细胞和蛋白质环境相互作用的更多知识至关重要。
    　　 细胞内和细胞外信号整合的中心作用是细胞的细胞骨架，其由肌动蛋白，微管和中间丝蛋白组成。在肿瘤诊断中，IF蛋白是有价值的标记，因为它们有助于通过其细胞和组织特异性表达来鉴定肿瘤亚型。近来，IF网络动力学在调节肿瘤恶性肿瘤中的功能作用得到了越来越多的关注。不同IF蛋白的上调或下调会改变网络的组成，并改变肿瘤细胞的恶性行为。例如，波形蛋白可调节表征上皮向间质转化的细胞变化，而角蛋白在乳腺癌细胞侵袭中起关键作用。星形细胞瘤中的IF网络由神经胶质纤维酸性蛋白，波形蛋白，合成蛋白和巢蛋白组成。单个IF蛋白表达的变化，翻译后蛋白修饰以及选择性剪接的机制会产生IF蛋白多样性并调节网络的组成和功能。GFAP的选择性剪接很大程度上促进了IF蛋白的多样性，因为已知至少有10种不同的剪接亚型在中枢和周围神经系统中表达。典型的GFAP-α亚型在健康大脑的成熟星形胶质细胞和星形胶质细胞来源的神经胶质瘤中广泛表达。此外，选择性剪接变体GFAP-o在脑室下神经源性星形胶质细胞中特异性表达，具有转化为神经胶质瘤，被发现在神经胶质瘤中表达。GFAP-o的高水平表达会导致IF聚集和神经胶质瘤细胞整个IF网络的崩溃，但是当以较低的内源性水平表达时，GFAP-o可以并入网络并调节与细胞质蛋白的相互作用，如α–B-晶状蛋白。
    　　 在IV级星形细胞瘤中，与低级星形细胞瘤相比，GFAP-o的表达相对于GFAP-α更高。在以前的研究中已经证明，模仿体外GFAP比值的这种增加，可以改变神经胶质瘤的恶性细胞行为，这种行为主要涉及细胞与其细胞外环境之间相互作用的改变。此外，对患者和体外全基因组转录数据的比较表明，高GFAP比值将星形细胞瘤基因表达引导至更恶性的状态，从而使GFAP替代品成为潜在的治疗靶标，需要进一步探索研究高GFAP比如何导致更恶性的神经胶质瘤表型。对GFAP比值增加最强的反应之一是双特异性磷酸酶4。在神经胶质瘤患者中，DUSP4表达与GFAP比相关，而高表达与不良预后相关。DUSP4也称为MAPK磷酸酶2，是一种核磷酸酶，主要靶向MAPK信号通路参与者的磷酸丝氨酸-苏氨酸和磷酸酪氨酸残基。MAPK信号通路是细胞外和细胞内信号通路的整合者，并调节各种与肿瘤恶性肿瘤相关的过程。MAPK途径参与者中的突变和DUSP4靶标ERK和JNK的组成型激活在神经胶质瘤中很常见。DUSP4活性影响细胞迁移，入侵，扩散，细胞外基质降解，以及化疗引起的细胞毒性。目前的研究集中在通过GFAP比值和DUSP4上下游通路参与DUSP4调控，这些通路参与细胞与其细胞外环境的相互作用。出国看病网研究人员使用簇状规则间隔的短回文重复序列相关蛋白9技术指导GFAP替代剪接，并为GFAP比值诱导的细胞与ECM相互作用的变化提供了证据，这与更具恶性的表型，并依赖于DUSP4的表达，并可能通过其表达增强。
    　　 在这项研究中，使用U251恶性神经胶质瘤细胞系的2个亚克隆，通过短末端重复分析确认了其细胞身份。亚克隆之一表达高水平的GFAP，并用于所有GFAP同工型敲低，DUSP4敲低和DUSP4过表达实验。第二个亚克隆表达了低水平的GFAP，并被用来过表达GFAP亚型。将所有细胞系维持在DMEM高葡萄糖[Ham'sF10营养混合物中，补充100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素和10％胎牛血清。表达重组人GFAP-α-内部核糖体进入位点-增强型绿色荧光蛋白，重组人GFAP-o-IRES-mCherry和对照的稳定细胞系如使用慢病毒载体产生表达重组mCherry的品系。为了敲低GFAP亚型，慢病毒载体转导包括靶向短发夹RNA的GFAP-α，shRNA诱导的所有GFAP亚型的敲除和非靶向shRNA对照进行了X-射线诱变以产生稳定的GFAP调节的神经胶质瘤细胞系。为了生成GFAP同工型敲除，使用CRISPR-Cas9对U251-MG胶质瘤细胞基因组进行了工程改造。为了修饰GFAP亚型基因的表达，设计了靶向RNA，该RNA靶向待删除外显子上下游的序列。选择尽可能靠近待缺失外显子区域的起点和末端的靶序列，以防止内含子区域内调节序列的缺失。为了敲除DUSP4，设计了一种gRNA靶向ATG起始密码子后的第一个编码外显子。通过退火专门设计的互补寡核苷酸从100°C冷却至室温：2uM寡核苷酸1、2uM寡核苷酸2、10mMTris，1mMEDTA和50mMNaCl生成gRNA模板。设计寡核苷酸序列以产生特异性突出端，可在室温下过夜连接约20ng质粒，约0.2nMgRNA模板，T4DNA连接酶和T4DNA连接酶缓冲液到pSpCas9-2A-Puro;使用BbsI消化后。通过测序验证了正确的序列。为了产生含有所需遗传修饰的神经胶质瘤细胞系，以1.2×105的密度接种U251-MG细胞。6孔板中的每孔细胞数。接种后二十四小时，将细胞培养基中的青霉素和链霉素消耗掉16小时，并将待删除区域上下的含gRNA的pSpCas9-2A-Puro质粒共转染。使用聚乙烯亚胺。为了产生DUSP4敲低系，将含有gRNA的单个质粒转染到U251-MG细胞中。将未切割的和空的pSpCas9-2A-Puro转染并用作对照。转染试剂分别在转染后16和24h用1ug/ml嘌呤霉素处理96h，以选择转染的细胞。细胞达到约90％密度后，将其转移到T75烧瓶中并保持培养。要生成克隆细胞系，请进行荧光激活细胞分选从7氨基放线菌素D标记的细胞悬液中每孔接种1个细胞以排除死细胞。细胞达到80％的密度后，将细胞传至24孔板，随后24孔板分成两半以继续培养细胞并分离DNA和RNA以进行克隆选择。使用此方法，生成了GFAP-o基因敲除，GFAP-α基因敲除，对照和DUSP4-KO和对照克隆细胞系。
    　　 以DUSP4质粒为模板，将DUSP4克隆到pcDNA质粒中。用接头引物用于创建解淀粉芽孢杆菌的II型限制性内切酶和流感嗜血杆菌的II型限制性内切酶限制性位点。这些限制酶被用于消化pcDNA3.1和PCR产物，并通过连接消化产物来产生pcDNA3.1-DUSP4表达质粒。通过测序验证了正确的序列。随后将pcDNA3.1-DUSP4过表达用于接种聚乙烯亚胺的U251-MG细胞，该细胞以1×104接种转染前24小时的密度。空pcDNA3.1被转染为对照。转染后五天，收获细胞并处理以分离RNA。为了确定CRISPR-Cas9调节的神经胶质瘤细胞系的基因型，从细胞沉淀中分离了DNA。将细胞在5mMTrisHCl中于95°C裂解10分钟，在冰上冷却，并通过在56°C孵育30分钟用10ug/ml蛋白酶K处理。随后将蛋白酶K在95℃下失活5分钟。在包含1ul引物混合物，4ul7.5或12.5ugMgCl2FirePolPCR预混液和Milli-Q。在T100热循环仪中进行以下PCR反应：95°C3分钟，然后在95°C的34个循环中进行30s，54.4°C或51.4°C30s，72°C进行1.25分钟或1.10min，最后一步是72°C10分钟。在含有SYBRSafeDNAGelStain的1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，并使用带有BlueLightBase的E-GelImager系统对凝胶成像。
    　　 为了分离细胞系，将细胞以4×104细胞密度播种在24孔板中的聚D赖氨酸包被的孔上。培养3天后，将细胞在PBS中洗涤并使用Trizol裂解。为了提取RNA，将氯仿添加到裂解物中，并通过在7°C下以12,000g离心15分钟将RNA与蛋白质和脂质分离。随后将RNA在零下20度的2-丙醇中沉淀过夜，并通过在4°C下以16,000g离心45分钟沉淀。用75％的冷乙醇将粒料洗涤两次，并溶解在Milli-Q中。使用VarioskanFlash测量RNA浓度和纯度。根据制造商的方案，使用QuantiTect逆转录试剂盒产生cDNA。在42°C下，用DNAse处理200至500ng的RNA2分钟，然后在含有反转录酶，反转录酶缓冲液和混合液的10ul反应混合物中转化为cDNA。在42°C下孵育30分钟的oligo-dT。将RT在95℃灭活3分钟。对于实时定量PCR，将cDNA在Milli-Q中稀释20倍，然后将1ul加入含有1ul引物混合物，5ulFastStartUniversal的qPCR反应混合物中SYBRGreenMasterMix和3ulMilli-Q。将反应混合物添加到96或384孔板中，使用QuantStudio6FlexReal在40个PCR周期中分别在50°C2分钟和95°C10分钟的温育步骤后测量产物的扩增。实时PCR系统。随后通过将温度从60°C升高到95°C生成解离曲线。根据扩增曲线的对数线性部分，使用QuantStudio6和7FlexReal-TimePCR系统软件v.1.1分析，标准阈值为0.2。基线荧光的校正由系统软件自动确定并校正。表达值通过转化计算使用QuantStudio6Flex实时PCR系统在40个PCR周期中进行分析。
    　　 对于蛋白质分离，需要12×104个细胞或60×104个将细胞分别铺在6孔或15cm培养皿中。细胞在PBS中洗涤，并刮在悬浮液。在悬浮缓冲液中通过超声波浴处理裂解细胞。通过以15,000rpm离心1分钟，将不溶性蛋白质库与不溶性蛋白质库分离。将药丸溶于1次SDS上样缓冲液和2次SDS上样缓冲液添加到上清液中。将样品在95°C加热5分钟，然后将沉淀部分中的DNA通过25号针头进行破碎。然后将上清液和沉淀样品均加载到10％SDS-PAGE凝胶上，并通过电泳分离蛋白质。使用Trans-BlotSD半干转移系统在0.45-uM孔径的硝酸纤维素膜上将蛋白质印迹1h。将印迹在封闭缓冲液中孵育，并在一级抗体中在封闭缓冲液中于4°C孵育过夜。将印迹在100mMTrisHCl，150mMNaCl和0.2％Tween20中洗涤3次，然后在封闭缓冲液中的二抗中于室温孵育1小时。印迹在100mMTrisHCl，150mMNaCl和0.2％Tween20中清洗3次，并在Milli-Q中清洗一次，然后使用OdysseyCLxWestern印迹检测系统。在24孔板中以每块PDL覆盖的盖玻片7.5×104个细胞的密度接种细胞。96小时后，当细胞达到融合状态时，每天更换一次培养基。7天后，除去培养基，并用PBS洗涤细胞。随后，通过在无菌提取缓冲液中于37°C和75rpm孵育15分钟，从细胞衍生的基质剥去细胞。CDM在PBS中洗涤4次并用于免疫染色。将细胞接种在玻璃盖玻片，PDL涂层盖玻片或层粘连蛋白上，密度为。在24孔板中放置5.0×104个细胞。2或24小时后，将细胞在PBS中洗涤3次以去除未粘附的细胞。将粘附的细胞固定在PBS中的4％多聚甲醛中，用Hoechst对细胞核染色，盖上盖玻片后，使用ZeissAxioScope.A1显微镜在3种不同的显微镜下拍摄免疫荧光图像每个盖玻片的面积。使用ImageJSoftwarev.1.52e确定细胞数。
    　　 来自165级IV级癌症基因组图谱的3级发布的RNA测序数据306例低级别神经胶质瘤用于确定神经胶质瘤亚型内的DUSP4表达水平世界卫生组织2016。通过期望最大化计数估计值提取表达水平作为上四分位数标准化RNA-Seq。将复发的肿瘤排除在外，并对重复的肿瘤样品的标准化计数取平均值。对于IV级神经胶质瘤患者，可从加利福尼亚大学圣克鲁斯大学癌症基因组浏览器，根据世卫组织2016年分类系统，可以对144例IV级患者进行分类。对于低度神经胶质瘤，相关突变的数据摘自2015年TCGA网络出版物，可用于282例低度神经胶质瘤。有422例神经胶质瘤患者的生存和无进展生存数据。在Kaplan-Meier生存分析中，通过使用R软件v.3.4.3中的Survival软件包v.2.41-3比较DUSP4表达低于和中位数的患者的生存曲线来确定DUSP4表达的预后价值。使用对数回归分析比较生存曲线。所有统计分析均使用R软件3.4.3版进行。为了检验各组之间的显着差异，首先分别使用Shapiro-Wilk检验和Levene检验，使用R中的均值多重比较软件包v.4.3进行成对正态分布和方差正态性检验数据。满足参数测试的条件后，进行了1次方差分析，然后进行了Tukey的事后真实诚实的显着差异测试。如果不满足条件，则执行非参数Kruskal-Wallis检验，然后进行Nemenyi检验。为了测试两个变量之间的显着相关性，进行了线性回归分析。所有图形均使用ggplot2软件包v.3.0.0生成。
    　　 首先，确认了出国看病网研究人员较早获得的微阵列数据，在调节GFAP比值后，DUSP4基因表达发生了显着变化。在GFAP调节的U251-MG细胞模型中通过qPCR分析确定了DUSP4的表达水平[关于细胞系鉴定。根据调查结果发现，DUSP4在GFAP-α敲除细胞表达显著增加。在这些GFAP-α细胞中，GFAP-α被特异性地敲低，这导致GFAP比增加。在通过重组表达GFAP-o或GFAP-α来改变GFAP比的另一种方法中，DUSP4的表达与对照细胞没有区别。这些结果表明，DUSP4表达最显着地响应由GFAP-α引起的GFAP比值的增加。这是通过一个显著正相关支承，通过GFAP-α内的线性回归分析，测定panGFAP-，和NTC细胞的DUSP4到GFAP比率，但不能达到panGFAP的水平。通过删除GFAP-o特异性外显子，出国看病网研究人员生成了具有低，中和高GFAP比的克隆细胞系或GFAP-α-特定外显子。使用围绕外显子2个gRNA，Cas9产生的切割导致导致编码这些区域的DNA区域的缺失。为了产生克隆细胞系，使用FACS对靶细胞进行单细胞分选。通过转染不靶向gRNA的Cas9构建体产生了两个对照克隆细胞系。选择了两个GFAP-o基因敲除和2个GFAP-α基因敲除克隆株进行进一步鉴定。预期的DNA区域被删除，这表明GFAP-o-KO系由外显子7a的纯合缺失和GFAP-α-KO系由外显子的杂合缺失组成。与ctl和GFAP-α-KO细胞系相比，外显子的缺失导致GFAPomRNA水平显着降低。GFAP-omRNA在GFAP-o-KO细胞40个PCR循环后大多不可检测的。与ctl和GFAP-o-KO细胞相比，外显子的缺失显着降低了GFAP-αmRNA的水平。另外，在GFAP-α-KO系和GFAP-o-KO系之间观察到了克隆差异。GFAP-α-KO1细胞显示出明显的GFAP-o表达下降趋势，而GFAP-α-KO2细胞中的GFAP-α水平则显示出补偿性GFAP-o表达趋势。类似地，在GFAP-o-KO1细胞中观察到GFAP-α水平降低的趋势，而在GFAP-o-KO2细胞中，GFAP-α水平与ctl细胞相当。GFAP亚型表达水平的这些变化导致细胞系之间的GFAP比值存在很大差异。使用此方法创建的GFAP比值的范围很广。显著下调panGFAP水平GFAP-o-KO1并且因为补偿性下调的GFAP-α-KO1系中仅观察到GFAP-α和缺乏GFAP-o上调。Western印迹分析表明，遗传修饰对GFAP亚型蛋白表达的影响类似，因为mRNA表达水平为。GFAP-o-KO1细胞中GFAP-α的补偿性下调，GFAP-α-KO2细胞中GFAP-o的上调以及对panGFAP水平的影响也显示在蛋白质水平上。可溶性和不可溶蛋白库中都存在差异。此外，GFAP蛋白表达的改变导致GFAP网络组成的变化。GFAP-o-KO细胞网络中的GFAP-o掺入减少，而GFAP-o-KO2细胞中存在更多的GFAP-α。同样，GFAP-α-KO细胞中的GFAP-α网络掺入减少，而GFAP-α-KO2细胞中的GFAP-o增加，而GFAP-α-KO1细胞的则减少。在GFAP-α-KO2细胞中观察到IF组件-无能GFAP-o的清除丝状结构，由IF组件能力的波形蛋白的存在。这些结果表明，出国看病网研究人员使用包含不同GFAP网络的CRISPR-Cas9成功生成了具有不同水平GFAP比的细胞系。
    　　 在高GFAP比水平的细胞中DUSP4mRNA表达显着增加。与ctl细胞相比，DUSP4的表达分别在GFAP-α-KO1和GFAP-α-KO2系中增加了10.9倍和7.7倍。线性回归分析显示，在所有细胞系中，DUSP4表达水平与GFAP比值密切相关，而与panGFAP水平的相关性不明显。GFAP-α-KO细胞中DUSP4蛋白的表达是通过这些细胞的黏附特异性诱导的，而不是这种核磷酸酶的预期核内增加。尽管出国看病网研究人员的细胞系中DUSP4的稳态水平较低，但是这与GFAP-α-KO细胞中DUSP4蛋白质水平的总体升高是一致的，并且需要使用蛋白酶体抑制剂埃博霉素进行治疗以防止DUSP4降解并在西方人身上显现DUSP4印迹。DUSP4粘着斑增加伴有细胞极化和清晰可见的肌动蛋白应力纤维，显示为长丝状束，将细胞一端的粘着斑连接到另一端，在ctl和GFAP-o-KO细胞中不太明显。DUSP4蛋白在GFAP-α-KO细胞富含肌动蛋白的粘着斑中的定位，有时甚至超出标记的肌动蛋白。ctl和GFAP-o-KO细胞中的DUSP4蛋白很少定位于粘着斑，并且含量非常低。由于GFAP-o-KO细胞形态平坦且多面体。Ctl细胞由极化和纺锤形GFAP-α-KO细胞和扁平多面体GFAP-o-KO细胞中间的形态组成。
    　　 DUSP4磷酸酶活性的主要目标是MAPK途径球员磷酸化ERK和磷酸化JNK。从ctl，GFAP-o-KO和GFAP-α-KO细胞分离的蛋白质的蛋白质印迹分析表明，只有ERK的一般水平受GFAP亚型调节的影响，并且在细胞系之间pJNK的水平显着不同GFAP-α-KO细胞中的水平升高。继续分析与肿瘤细胞恶性行为相关的MAPK信号通路的上游调节剂，并调节细胞与ECM的相互作用;它们先前被证明受GFAP网络变化的影响，层粘连蛋白111及其整联蛋白受体。编码层粘连蛋白α1链的层粘连蛋白亚基α1与层粘连蛋白的B1和Y1链一起形成ECM分子层粘连蛋白111。在高GFAP比的细胞中LAMA1显着增加。与ctl和GFAP-o-KO细胞相比，GFAP-α-KO细胞的mRNA表达平均增加了15,000倍。由shRNA调节的细胞系和ctl1，GFAP-o-KO2和GFAP-α-KO2克隆细胞均产生细胞来源的ECM，并对层粘连蛋白进行免疫染色。这表明GFAP比值的增加也会诱导层粘连蛋白的分泌以及这些细胞产生的ECM中的聚合反应。整合素B-1，整合素α6和整合素α7的mRNA表达编码层粘连蛋白111受体成分的）在具有高GFAP比的细胞中也显着增加。先前的实验显示GFAP比对层粘连蛋白信号传导活性的下游效应器金属蛋白酶2。MMP2由细胞分泌，降解ECM，诱导细胞入侵，并与神经胶质瘤恶性肿瘤。MMP2在出国看病网研究人员的GFAP调节细胞系之间也差异表达，并在具有高GFAP比的GFAP-α-KO克隆系之一中显着增加。此外，在这两个GFAP-α-KO克隆系中，表达α-2-巨球蛋白可以结合并抑制MMP2的活性形式明显降低，甚至大部分低于检测值。
    　　 因为层粘连蛋白表达111，分泌和受体表达在细胞中以高GFAP比率增加，确定用层粘连蛋白和nonlaminin基材的密合性试验中的细胞的相互作用的强度。贴壁2和24小时后，与ctl和GFAP-o-KO细胞相比，附着在玻璃和PDL上的GFAP-α-KO细胞数量减少。相反，相同数量的GFAP-α-KO细胞具有增加的趋势，在2小时和24小时后均粘附在层粘连蛋白涂层的表面上。这些数据表明，具有高GFAP比的细胞依赖于ECM中的层粘连蛋白来获得强大的表面粘附性。为了确定DUSP4如何参与层粘连蛋白111的信号传导途径，使用CRISPR-Cas9创建了DUSP4敲低的U251-MG细胞系。DUSP4在2种不同的DUSP4敲低细胞系和对照克隆系中的表达。与DUSP4-KO细胞株2相比，DUSP4-KO细胞株1显示出更强的DUSP4mRNA降低。为了在蛋白质水平上可视化DUSP4，将细胞用环氧霉素处理以防止DUSP4降解表明蛋白质水平反映了在mRNA水平上的观察结果，与DUSP4-KO2相比，DUSP4-KO1中DUSP4的敲除作用更强。在DUSP4-KO细胞中，观察到LAMA1mRNA的水平显着下降至通常无法检测的水平，而ITGB1mRNA则显着下降。敲低DUSP4后ITGA6的表达没有降低。但是，与DUSP4-ctl细胞相比，ITGA7和MMP2的表达在DUSP4-KO细胞中也表现出表达降低的趋势，并且MMP2抑制剂A2M显着增加。此外，与DUSP4-ctl细胞相比，DUSP4-KO细胞显示出更扁平，多面体和更圆的形态。这些结果表明，DUSP4的消耗与表达高DUSP4水平的高GFAP比细胞中观察到的相反。这表明在高GFAP比细胞中看到的对细胞ECM相互作用成分的影响取决于DUSP4表达。
    　　 敲除DUSP4后，不同GFAP亚型的mRNA和蛋白质表达显着降低。GFAP-α，GFAP-o和panGFAPmRNA在DUSP4-KO1细胞中显着降低。降低GFAP-α，GFAP-o，并panGFAP表达DUSP4-KO2不太明显，但显著两个GFAP-o和panGFAP与DUSP4-CTL细胞相比。与DUSP4-KO1和DUSP4-ctl细胞相比，这对应于DUSP4-KO2中的DUSP4中间表达水平。与DUSP4-ctl细胞相比，DUSP4-KO细胞的GFAP比没有变化。敲除DUSP4后，GFAP-α，GFAP-o和panGFAP的蛋白质表达也降低了，并且在DUSP4-KO1细胞中再次出现最强烈的GFAP下调。DUAP4过表达时，GFAP亚型的表达水平没有变化。这些结果表明，GFAP表达也依赖于DUSP4。先前显示DUSP4的表达水平在较高级别的星形细胞瘤中升高，并且对于星形细胞瘤III级患者具有预后价值。最近，已经开发了用于神经胶质瘤的新分类系统。该系统包括肿瘤的组织学评估和遗传信息。因此，研究了DUSP4在新定义的神经胶质瘤亚型中的表达。与大多数但不是全部低度神经胶质瘤亚型相比，IV级的DUSP4表达增加。此外，评估了DUSP4在不同神经胶质瘤亚型中的预后价值，并发现了具有异柠檬酸脱氢酶1突变且无亚硫酸氢盐脱氢酶1突变的III级神经胶质瘤患者的生存率降低和无进展生存率降低的强烈趋势。染色体臂1Q和19P和上述位数水平的codeletionDUSP4。该患者组主要由WHO2007年定义的III级星形细胞瘤组成。在所有中度低度IDHmut非编码神经胶质瘤患者中，发现中值DUSP4表达水平高于平均水平的患者的生存概率较差，无进展生存概率明显较差结果。
    　　 恶性神经胶质瘤的高侵袭性和单肿瘤细胞内活跃的致癌信号通路的异质性导致神经胶质瘤患者对治疗的反应不足，肿瘤复发和预后不良。在这项研究中，出国看病网研究人员表明细胞骨架的特定部分，即IF网络，参与了神经胶质瘤的恶性肿瘤。细胞的细胞骨架在细胞外和细胞内信号传导的整合中起着核心作用，对于细胞入侵至关重要。IF网络参与调节包括胶质瘤在内的不同类型肿瘤的恶性肿瘤。在研究中提供了更多的证据表明，通过将GFAP替代剪接变体GFAP-o的相对表达水平改变为规范剪接变体GFAP-α的表达来调节IF网络，有助于神经胶质瘤的恶性特征。在这里显示，与低级神经胶质瘤相比，IV级观察到的胶质瘤细胞中GFAP比值的增加，以DUSP4依赖的方式改变细胞与ECM的相互作用。高GFAP比细胞中观察到的分子变化为它们提供了入侵大脑的适当设备，因此有助于形成更恶性的神经胶质瘤表型。为了成功入侵，神经胶质瘤细胞需要重新排列其细胞骨架，并找到或建立一个支架以继续迁移。它需要工具来与细胞外环境相互作用并坚持。此外，它需要清除细胞外环境中阻碍其迁移路径的障碍，并在细胞向前移动时将其相互作用释放到细胞后端的支架上）。具有高GFAP比的神经胶质瘤细胞中诱导的分子特性，这些分子特性提供了这些工具。首先，观察到肌动蛋白细胞骨架重排。在高GFAP比的电池中存在将细胞前端连接到其后端的透明肌动蛋白应力纤维，与多面体形低GFAP比的电池相比，其具有更多的纺锤形和极化形态细胞。LAMA1的表达和层粘连蛋白的分泌增加，细胞需要适当的粘附。水平的提高ITGB1，ITGA6和ITGA7提供了粘附神经胶质瘤细胞生成的富含层粘连蛋白的支架，并在细胞中诱导信号传导反应，从而导致观察到的pJNK水平升高，DUSP4和MMP2。MMP2水平升高，其抑制剂A2M大幅降低可能会导致电池前部和后部ECM的退化。这些变化共同为细胞做好了适当侵袭的准备。
    　　 在高GFAP比的细胞中，LAMA1表达增加，层粘连蛋白分泌到胶质瘤细胞产生的ECM中，层粘连蛋白依赖性粘附以及层粘连蛋白111受体整合素α6B1和整合素α7B1的高表达水平可能有助于神经胶质瘤恶性和侵入性以不同的方式。首先，因为层粘连蛋白主要存在于成年人脑血管的基底层中，具有较高GFAP比的细胞可能更适合与脑血管系统一起迁移，这是胶质瘤细胞入侵的首选途径之一。其次，因为神经胶质瘤细胞可以创建自己的首选微环境，通过沉积ECM蛋白来侵入大脑，在缺乏含层粘连蛋白的脉管系统的情况下，具有高GFAP比的细胞可通过层粘连蛋白的沉积产生迁移路径。有趣的是，在患者材料中的GFAP阳性神经胶质瘤细胞附近发现了层粘连蛋白沉积物以及在神经胶质瘤动物模型中与迁移的神经胶质瘤细胞和健康脑组织接壤的区域。最后，可溶性层粘连蛋白-111可以通过结合分泌细胞及其邻居的受体来激活信号传导途径。实际上，一些研究支持ITGB1信号的层粘连蛋白111激活可以诱导在具有高GFAP比的细胞中观察到的变化。因此，层粘连蛋白支架的产生以及增加的信号传导都为高GFAP比细胞侵袭大脑提供了工具。
    　　 因为典型的GFAP-α同工型的表达水平比GFAP-o高得多，所以可以认为观察到的归因于GFAP比值增加的效应是GFAP表达普遍下降的结果。但是，不同的证据支持GFAP比的特定作用。首先，panGFAP水平在两个GFAP-o-KO1和GFAP-α-KO1克隆细胞系。因为在GFAP-o-KO1细胞中未观察到具有高GFAP细胞的上述特征，所以它们不能仅由panGFAP降低引起。此外，在GFAP-α-KO2细胞中panGFAP表达没有明显降低，但是观察到明显的高GFAP比相关表型。其次，观察到panGFAP强烈降低的DUSP4-KO细胞不具有高GFAP比相关特征，甚至不包含具有较低GFAP比的细胞特征。第三，在使用shRNA调节GFAP的实验中，与对照细胞相比，观察到了GFAP-α敲除和panGFAP敲除的不同效果。例如，DUSP4，LAMA1和MMP2的增加在panGFAP敲低的细胞中未观察到此现象，与对照细胞相比，通常观察到panGFAP和GFAP-α敲低的变化方向相反。因此，将本研究中观察到的细胞恶性表型归因于GFAP比的增加。观察到的表型是否是IF网络中可溶性GFAP-o蛋白，GFAP-o蛋白相对增加的结果，还是两者都有待进一步研究。在GFAP-α-KO细胞中观察到丝状和可溶性GFAP-o蛋白。但是，缺乏IF解聚剂使该问题的研究复杂化。
    　　 这项研究中获得的结果为DUSP4在调节高GFAP比细胞的恶性特征中发挥核心作用提供了证据。显示DUSP4均由高GFAP比，并且对于这些细胞中观察到的分子变化至关重要。实际上，DUSP4已经与不同类型细胞中的许多恶性肿瘤相关生物过程相关联，对于低度星形细胞瘤的患者预后较差。在这里显示出较高的DUSP4表达水平特别不利于IDH1突变低级肿瘤而无1q19p缺失的患者的神经胶质瘤亚组，因为显着降低的无进展生存期与高水平的DUSP4相关。因此，在这里证实DUSP4与更恶性的神经胶质瘤表型有关。在具有高GFAP比的细胞中，DUSP4蛋白的粘着斑特异性增加。由于已知DUSP4是一种核磷酸酶，并且以前尚未报道过在粘着斑中的表达，因此尚不清楚其在该细胞区室中的功能。因为粘着斑中的平衡磷酸化对于细胞入侵至关重要，该区域的DUSP4磷酸酶活性可能与功能有很大关系。与DUSP4作为pJNK核磷酸酶的已知功能相反，GFAP比高的细胞中pJNK的水平增加了。GFAP-o的神经胶质瘤细胞中pJNK水平升高。当前关于DUSP4定位变化的数据可以解释这些观察结果。有趣的是，尽管pJNK位于大多数神经胶质瘤细胞的核中，将pJNK隔离在细胞质中与胶质瘤迁移增加有关。特定于位置的pJNK改变超出了本研究的范围，但是以前已经报道过通过胶质瘤细胞的IF网络变化来隔离信号分子，因此可能对以后的研究感兴趣。
    　　 这项研究中的DUSP4敲低实验暗示DUSP4在维持具有高GFAP比的细胞的恶性表型中的重要作用。缺少DUSP4会降低基因的表达并改变细胞形态，这都是高GFAP比细胞的特征。这伴随着GFAP表达的强烈降低，表明这些改变可能是由于GFAP的总体缺乏而介导的。但是，与对照细胞相比，在GFAP-o-KO或GFAP-α-KO克隆细胞系中未观察到LAMA1或ITGB1表达降低，这有利于DUSP4降低的直接作用。此外，假设除了粘着斑的胞质功能外，DUSP4还通过与基因启动子在组蛋白乙酰转移酶p300的相互作用中直接调节基因表达，从而促进了神经胶质瘤的恶性肿瘤。通过激活DUSP4上下游的信号通路改变了细胞与ECM的相互作用并为细胞配备了侵袭和可能的治疗逃避的手段，转向GFAP替代剪接以增加GFAP比值可诱导更恶性的神经胶质瘤细胞表型。数据突显了GFAP替代剪接在神经胶质瘤GFAP阳性细胞群功能多样性中的重要作用，并将未来的研究指向该细胞群，并将GFAP替代剪接作为治疗靶标。
 
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