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DNA对人胶质母细胞瘤细胞的作用
  • 　　DNA双链断裂是DNA损伤的最严重形式。用于抗癌治疗的许多抗癌药物都会引起DSB，包括拓扑异构酶2抑制剂。Top2是一种普遍存在的核酶，在DNA胁迫和DSBs形成的超螺旋还原中起着至关重要的作用。有两种不同的Top2亚型：a和B，在人类中约有70％的序列相似性。这两种同工型都是DNA复制，染色体稳定性和姐妹染色单体分离机制所必需的，但是在各种癌症发展过程中观察到Top2a高表达。靶向Top2的药物已在临床上成功用于癌症治疗超过30年。这类抗癌药的典型例子是依托泊苷。它比a主要主要作用于同工型B。不幸的是，这与严重的副作用有关，如高毒性和继发性恶性肿瘤。降低依托泊苷毒性的一种可能方法是在维持抗癌潜力的同时降低剂量。可以通过与其他抗癌药物联合治疗来实现。假设可以通过平行抑制topo2a和癌细胞对DSB致敏来实现此目标。第一种可与一种新型的，有效的和特定的最上方的两个a抑制剂NK314获得。DNA依赖性蛋白激酶催化亚基的抑制剂，涉及非同源DNA末端连接途径的蛋白，可能具有潜在的敏化作用，可提高Top2抑制剂的有效性，由于NHEJ是DNA双链断裂的人类细胞修复的主要途径。分析Top2a和B抑制剂在联合化疗中的治疗作用，并确定癌细胞通过NHEJ修复抑制剂-NU7441对Top2a和B抑制剂联合化疗的敏感性机制。在研究中将胶质瘤细胞系MO59K和MO59J用作体外模型有两个原因。首先，胶质母细胞瘤仍然是姑息性的，预后很差。此外，存在的可用于治疗成胶质细胞瘤的药物的数量有限，由于血脑屏障。BBB的特征在于选择性机制调节跨细胞运输和相邻内皮细胞之间紧密连接的表达。细胞旁运输以及跨细胞运输是非常有限的。只有小分子和高度疏水的具有a的分子可以通过该屏障扩散。其次，这些细胞系提供一种以研究中DNA-PKcs的在涉及DNA损伤识别和修复细胞和分子过程中的作用是有用的模型系统如MO59J是MO59K的突变体形式，而不中DNA-PKcs表达。
    　　 为了确定药物对细胞生存力的细胞毒性作用，进行了CCK-8测定。测试NU7441和B抑制剂的组合是否会影响所研究细胞系的生存能力。将细胞暴露于浓度固定为NU7441的VP-16，NK314浓度不断增加的溶液中，该浓度对本研究中的癌细胞无害。当与最上方的两个a和B抑制剂以及组合NU7441最上方的两个a和B抑制剂。组合处理将MO59K中NK314的IC50值降低了2.23倍 。对VP-16观察到了相似的减小因子。另一方面，NU7441组合对MO59J细胞的存活率没有显着影响，但是出国看病网研究人员观察到用NU7441处理后，存活率显着下降。通常，响应于Top2a和B抑制剂，M059J细胞比M059K细胞敏感。
    　　 组合指数可用于确定药物组合是否具有协同作用。为了评估Top2a和B抑制剂的联合作用是表示加成作用还是协同作用，根据中位效应方程计算了CI值。将细胞暴露于以固定的比率。例如，这意味着将M059K细胞与9.6uM的NK314和323.8uM的VP-16结合。发现与NK314联合处理的所有细胞的CI均显示低于0.1的强CI。这表明NK314和VP-16具有非常强的协同抗癌作用。此外，预孵育NU7441增强该效果为0.25IC50，IC0.550总剂量。选择0.25IC50组合剂量进行进一步研究，使用0.25IC50是因为在该总剂量下观察到了高协同效应，并且使用NU7441的CI降低了很强。请注意0.5IC50剂量也具有期望的特性，但是VP-16的浓度远远超出生理相关浓度的范围。
    　　 单独使用总剂量为 1/4 IC50或与10uMNU7441联合使用的依托泊苷和NK314组合物暴露6h后，进行了彗星试验的碱性测定，以确定DNA损伤的水平和修复效率。两种药物组合药物在两种细胞系中DNA损伤中的增加，并且在所有剂量下，在存在NU7441的情况下，这些水平均增加。加入NU7441后，DNA损伤水平增加了约15％。对两种细胞系均显示出这种效应，表明其不依赖于DNA-PKcs状态。提示NU7441对NK314和VP-16联合治疗的致敏作用与DNA损伤的诱导有关。在无药物培养基中进行修复培养的开始和6小时内，在有和没有NU7441的情况下，暴露于Top2抑制剂的MO59K和J细胞中的DNA损伤程度。NK314和VP-16组合诱导的DNA损伤在6h后得到修复，MO59J细胞的修复在2h后没有改变，并且到培养结束时，DNA损伤保持在相同水平期。在存在NU7441的情况下，彗星试验诱发的未修复DNA损伤的水平显着高于单独使用药物的水平。然而，MO59K的观察到的效果比J细胞更引人注目，表明它是依赖DNA-PKcs状态的。
    　　 NU7441对用Top2抑制剂联合处理的MO59K和J细胞中细胞周期阶段的影响。在MO59K细胞中用NK314和VP-16处理导致G1中的细胞蓄积，而S细胞的数量减少。与对照细胞相比和G2阶段。用NU7441预处理细胞可增强这种效果。观察MO59J细胞的效果完全相反，在MO59J细胞中，S期的细胞蓄积以及G2。NU7441的添加无统计学意义。为了解决NU7441对细胞凋亡的影响，在加入NK314和VP-16组合之前，先将MO59K和J细胞与NU7441预孵育1h。在联合治疗中，MO59K的凋亡率为36％，显着高于对照组和可比的22％。阳性对照。NU7441的添加无统计学意义。对于MO59J细胞，研究人员注意到了类似的趋势，但是凋亡率远低于MO59K细胞。
    　　 星形细胞神经胶质瘤对常用化疗药物的耐药性导致临床反应较差。联合治疗方法是克服癌症耐药性的一种重要策略。该策略涉及同时使用两种具有不同分子靶标的药物。这种方法最重要的挑战是找到两种协同药物。在研究中首次证明Top2a抑制剂NK314与Top2B抑制剂VP-16在两种人胶质瘤细胞系M059J和M059K中具有协同作用。这两种细胞系均分离自一个33岁的患有胶质母细胞瘤未经治疗且对放射线敏感性不同的男性患者。M059J细胞比M059K细胞对辐射更敏感，但是与其他癌细胞系相比，这两种细胞系通常被归类为具有抗药性。有两个原因MO59细胞对辐射的敏感性增加：在移码突变PRKDC基因和miR-100的升高的表达。这些导致DNA-PKcs的缺失和ATM的低表达，从而导致总体DSB修复效率降低。因此，对于所有诱导DSB的药物，都应看到这种差异。观察到MO59K和MO59J细胞对单一和联合用Top2抑制剂治疗的敏感性差异。还观察到DNA-PKcs抑制剂NU7441增强了Top2抑制剂的细胞毒性，但是在缺乏DNA-PKcs表达的MO59J细胞中，这种作用明显较小。这些数据温和地表明在细胞中，NU7441对Top2抑制剂的致敏作用不仅由DNA-PKcs和ATM介导，而且还可能由其他PIKK激酶介导。NU7441是DNA-PKcsPIKK激酶以外的弱抑制剂，缺少具有低ATM表达的DNA-PKcs的细胞对Top2抑制剂更为敏感。缺乏DNA-PKcs的仓鼠细胞对依托泊苷的敏感性是对照细胞的三倍。这些数据强烈表明，DNA-PKcs和ATM对于Top2抑制剂诱导的DNA损伤绝对必要。VP-16诱导的DNA损伤是通过两个不同的DNA修复途径修复DNA-PKcs的依赖性和DNA-PKcs的独立酮。这里应该提到的是，在真核细胞中有两种NHEJ途径，经典途径和替代途径，即备用途径，微同源介导的末端连接或非经典途径。第一个需要DNA-PK和连接酶IV，而第二个则需要PARP1，53BP1，MRE11和连接酶III。修复过程的动力学和保真度也存在差异，从而损害了ncNHEJ。与cNHEJ相比，NcNHEJ速度更慢且更容易出错。NcNHEJ主要活跃于cNHEJ缺陷细胞，但在正常细胞中也存在。不能排除ncNHEJ修复一小部分VP-16诱导的DNA损伤并且它们独立于DNA-PKcs及其抑制剂的可能性。VP-16和NK314联合处理后，观察到类似的效果，其中通过NU7441抑制NHEJ可增强非常强的协同作用。在总剂量为0.25和0.5时可以清楚地看到NU7441的作用，并该作用被消除了。这种差异的可能解释是，Top2抑制剂组合的剩余剂量对MO59胶质瘤细胞毒性很大。
    　　 证明VP-16诱导的DNA链断裂的组合通过彗星试验可见。当在两个细胞中添加NU7441时，DNA链断裂的水平增加，但是这种差异在统计学上并不显着。由MO59K细胞中存在和不存在NU7441的VP-16组合诱导的DNA损伤修复时，观察到统计学上的显着差异。在NU7441存在下，药物诱导的DNA断裂不能有效修复，DNA修复曲线与MO59J细胞获得的相似。它建议NU7441的作用作为抑制剂的DNA修复的。DNA修复动力学曲线的详细分析非常有趣。在精通DNA-PKcs的细胞中，大多数由研究过的Top2抑制剂引起的DNA损伤均可在2h内修复，并在6h内结束，而在缺乏DNA-PKcs的细胞中，在此时间点可检测到10％的DNA损伤。当将NU7441添加到DNA-PKcs熟练细胞中时，研究人员获得了相似的数据。强烈建议在MO59K细胞中，cNHEJ负责修复VP-16诱导的DNA损伤，但也可以通过较慢的ncNHEJ对其进行部分修复。
    　　 假设NU7441抑制DNA-PKcs后未修复的DNA损伤的积累会引起细胞周期的改变。实际上在两种细胞系中均观察到Top2组合处理后细胞周期的变化。但仅在MO59K中，观察NU7441处理后细胞周期进一步改变。并且与细胞DNA损伤反应的公认模型包括DNA修复途径以及细胞周期检查点。这些检查点可在DNA受损时停止细胞周期进程，从而有时间进行修复。由于未修复的DNA损伤阻止了DNA复制或转录，它们还参与了导致细胞死亡的死亡信号传导。这些信号还需要有效的DNA修复途径，因为DNA修复蛋白通常会启动信号。与未修复DNA修复途径的细胞相比，DNA修复途径中的任何改变都会降低这种信号传导的敏感性，并导致DNA修复缺陷细胞的凋亡率降低。研究人员的结果与该模型一致，因为在MO59K细胞观察到的更高的凋亡率比MO59J，拓扑异构酶抑制剂以下另外NU7441的细胞凋亡增加，但在两个MO59细胞中均未观察到此现象。然而，NU7441对通过拓扑异构酶抑制剂的细胞凋亡诱导的影响似乎是有争议的，并强烈不仅取决于类型的癌症，而且上NU7441剂量。
    　　 总之，研究结果首次证明NK314可以克服MO59细胞对VP-16的抗性，而NU7441可以作为VP-16联合治疗的敏化剂。联合的三方化学疗法可以减少与每种单独疗法相关的总毒性，同时增强治疗人神经胶质瘤细胞的抗癌作用。因此，与使用单一疗法或双重疗法治疗胶质母细胞瘤患者并增加其存活率相比，使用三方组合方法可能是有前途的，并且更加有效。跨血脑肿瘤屏障的成功药物递送仍然是一个单独的问题。VP-16穿透血脑肿瘤屏障。没有关于NK314和NU7441的渗透血脑屏障的数据，但是第一个属于苯并菲啶。这类化合物穿越血脑屏障，并在大脑中具有相对较高的浓度。用黑素转铁蛋白抗体或与他莫昔芬结合在NU7441上可以增加BBB的通透性。使用这种方法增强了依托泊苷在BBB中的递送。在最坏的情况下，NU7441可能会被另一种DNA-PKcs抑制剂取代。Wortmannin似乎可以很好地替代NU7441，因为它可以穿透BBB，但是它的效力不如NU7441。
 
出国看病概况

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　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
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靶向药物
 

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