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胶质瘤是最常见和恶性的原发性脑肿瘤
  • 　　溴结构域蛋白BRD4是溴结构域蛋白核转录因子家族的重要成员。它可以通过结合乙酰化组蛋白H3Lys-14，H4Lys-5/8/12和非组蛋白来调节DNA复制和基因转录，从而影响细胞周期。研究表明BRD4功能异常与各种肿瘤的发生和发展密切相关，并且已经开发出许多针对BRD4的抑制剂，并在各种肿瘤的体内外试验中显示出潜在的抗肿瘤作用。然而仅揭示了受BRD4调控的一些靶基因和途径，它们在不同的肿瘤中具有独特性。因此，BRD4在肿瘤进展中的机制仍需深入研究。先前的研究表明，BET溴结构域蛋白是神经胶质瘤细胞增殖所必需的。BRD4通过控制HOTAIR）的表达来促进神经胶质瘤细胞增殖。此外，在神经胶质瘤模型中，与替莫唑胺或依维莫司同时给药时，新型BRD2/3/4抑制剂OTX015表现出添加剂活性的协同作用。靶向BRDs和E2F1的转录程序可维持神经胶质瘤的恶性，BRD9与BRD4相互作用以调节小鼠胚胎干细胞中的幼稚多能性。由于癌症干细胞具有与正常胚胎干细胞相似的特征，即自我更新能力，因此推测BRD4在神经胶质瘤细胞干性中起关键作用。
    　　 在人脑胶质瘤U251细胞通过BRD4调节的靶基因和通路。然而，详细的和具体的目标基因没有进一步证实。尽管lncRNAHOTAIR已被确定为BRD4的靶标，这对于BRD4介导的对神经胶质瘤细胞增殖的作用是必不可少的，但下游效应子或途径在神经胶质瘤中仍被混淆。MiRNA是一种可以通过直接与靶基因结合而抑制靶基因表达的ncRNA。已证明miR-142-5p对多种肿瘤具有抑制作用，例如胰腺癌，非小细胞肺癌和人骨肉瘤。值得注意的是，神经胶质瘤细胞中的miR-142-5p水平上调，并参与了放射抵抗。然而调控miR‐142-5p的机制及其在调节神经胶质瘤细胞干细胞样性状中的作用仍不清楚。在当前的研究中，表明BRD4表达在神经胶质瘤组织中增加并且与神经胶质瘤患者的总体存活呈负相关。在功能上，BRD4敲低减弱了干细胞样特征，其特征是ALDH1活性，主干调节因子的表达和球形成能力降低。机理研究表明，BRD4直接与miR‐142-5p启动子结合，促进其甲基化，从而降低miR‐142-5p水平，从而通过靶向Wnt3a抑制Wnt/B-catenin信号传导。因此，这些结果确定了BRD4/miR-14-25p/Wnt/B-catenin信号传导与神经胶质瘤细胞的干细胞样特征有关。
    　　 获得患者的书面知情同意书，以发表本报告和任何附带的图像。该研究是在医院伦理委员会批准下进行的。从2016年至2019年，在医院外科手术切除后立即从患者中随机收集了37对临床神经胶质瘤及其相邻组织。人神经胶质瘤细胞系U251，U373，U87，T98G，HS683，LN‐319和SW1783购自科学院的细胞库，并在含有10％FBS的DMEM培养基或RPMI1640培养基，DNA甲基转移酶抑制剂购自Selleck.cn。使用Trizol试剂从细胞中提取总RNA。然后使用SuperScriptFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR反向合成cDNA。在带有HieffqPCRSYBRGreenMasterMix的StepOnePlusPCR系统上进行qRT-PCR。mRNA表达水平相对于GAPDH表达标准化。此过程参考先前的研究。简而言之，将神经胶质瘤细胞用胰蛋白酶-EDTA进行胰蛋白酶消化，然后在补充有B27和EGF的DMEM-F12培养基中以500个细胞/孔的非粘附性在24孔板中进行培养。好8天。之后，计数大于50um的球体。Ribobio构建并包装了BRD4过表达和敲低miR-142.5p过表达和敲低慢病毒载体，以及相应的空载体。
    　　 在先前的研究中提到了详细的过程。18简而言之，使用裂解缓冲液裂解细胞。使用BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度。通过10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离20至40ug的蛋白质，然后转移至硝酸纤维素膜并与一抗孵育，然后与二抗孵育。使用NewSuperECL对图像进行显影。使用QuantityOne软件通过密度分析对蛋白质表达水平进行定量，并标准化为B-肌动蛋白水平。具有miR-14.2-5p结合位点或突变的结合位点的Wnt3a3'UTR序列被克隆到pMIR-Report载体中，命名为Luc-Wnt3a-3'UTR-wt和Luc-Wnt3a-3'UTR-mut。为了确认miR‐142-5p对Wnt3a的靶向作用，将上述质粒以及miR‐142-5p的过表达分别进行了共转染。过对于所有转染实验，均使用Lipofectamine2000Reagent将B-gal质粒标准化。根据标准方法，使用ALDH活性测定试剂盒测量ALDH1活性。所有结果均表示为平均值±SD，并使用GraphpadPrism进行分析。使用学生t检验或Tukey-Kramer事后检验来评估差异。P 小于.05或更小被认为具有统计学意义。
    　　 首先表明，在胶质瘤组织中BRD4表达显着增加。此外，在线数据集的分析表明，BRD4表达与神经胶质瘤患者的整体生存呈负相关。此外，在不同的神经胶质瘤细胞系中检查了BRD4的表达，结果表明，相比于U251和HS683，BRD4的表达在U251和HS683细胞中表现出更高的水平。其他细胞系。然后通过慢病毒感染构建了具有BRD4稳定敲低功能的U251和HS683细胞，分别命名为U251-B-kd和HS683-B-kd。通过qPCR和Western印迹分析确认了敲除效率。由于CSCs被认为是肿瘤发生的根源，知道BRD4是否与神经胶质瘤细胞干有关。如预期的那样，BRD4敲低降低了胶质瘤细胞中的ALDH1活性。BRD4组合式降低了主干调节器的表达。此外，BRD4敲低减弱了球的形成能力，如球尺寸和数量的减少所证明。因此，这些结果表明BRD4促进神经胶质瘤细胞的干细胞样性状。
    　　 然后，探索了BRD4的下游效应子，重点研究了已显示与肿瘤细胞干细胞紧密相关的miRNA。TransmiRv2.0数据库包含了ChIP衍生的TF-miRNA调控数据，用于查找受BRD4调控的miRNA。结果表明在神经组织中已将miR‐142-5p确认为BRD4的靶标。推测BRD4可以与神经胶质瘤细胞中的miR-142-5p启动子结合。如预期的那样，ChIP分析表明，BRD4蛋白下拉的DNA中miR-142.5p水平显着富集。此外，BRD4敲低的神经胶质瘤细胞中miR-142.5p水平显着增加。由于DNA甲基化有助于基因表达的下调，因此进一步检测到有或没有BRD4抑制的神经胶质瘤细胞中miR-14-25p的甲基化水平。结果表明，BRD4敲低降低了miR‐142-5p的甲基化水平。此外，荧光素酶报告基因检测表明，胶质瘤细胞中BGL4敲低可增强pGL3的荧光素酶活性，而pGL3的活性未受影响。此外，神经胶质瘤细胞中的miR‐142‐5p水平被DNA甲基转移酶抑制剂上调，并被BRD4过表达减弱。值得注意的是，神经胶质瘤组织中的miR-142.5p水平下调，并且与BRD4表达负相关。这些效应表明BRD4直接与miR-14-25p的启动子结合，影响其DNA甲基化状态，从而降低神经胶质瘤细胞中miR-142.5p的表达。
    　　 出国看病网研究人员进一步评估了miR-142.5p是否具有与BRD4相反的作用。如预期的那样，miR-14-25p水平在神经胶质瘤细胞系中表现出与BRD4表达相反的表达模式。miR-14-25p的过表达降低了胶质瘤细胞中的ALDH1活性，miR142-5p的过表达降低了主干调节因子的表达。此外，miR-142-5p过表达减弱了胶质瘤细胞的球形形成能力，其特征是球形数量和大小的减少。结果表明，miR-142-5p可以抑制神经胶质瘤细胞的干细胞样性状。然后进一步鉴定了miR‐142-5p的下游效应子。生物信息学分析表明，Wnt3a是miR-14-25p的潜在靶标，并且由于Wnt/B-catenin信号传导在CSC进程中起着关键作用，出国看病网研究人员想知道miR-14-25p是否通过靶向Wnt3a来调节神经胶质瘤细胞的干性。，miR-142.5p过表达降低了神经胶质瘤细胞中Wnt3a的表达。一致地，miR-142-5p过表达时，Wnt3a下游效应子B-catenin的表达降低。miR‐142-5p过表达会降低Luc‐Wnt3a‐3′UTR‐wt的萤光素酶活性，而Luc‐Wnt3a‐3′UTR‐mut的萤光素酶活性不受影响。重要的是，尽管miR-142-5p的过表达减少了神经胶质瘤细胞的干细胞样特征，但SKL2001治疗却部分减弱了这种作用。最后，确定BRD4是否通过miR-14.2-5p/Wnt/B-catenin信号传导调节神经胶质瘤细胞的干性。敲除MiR‐142‐5p并在具有BRD4敲除的胶质瘤细胞中添加SKL2001，并证实miR‐142‐5p敲除介导的SSK2001诱导的对Wnt/B-catenin信号传导的作用。发现通过miR-142.5p敲低或SKL2001可以挽救BRD4敲低介导的ALDH1活性下调。无论是敲低miR‐142-5p还是添加SKL2001，它都可以部分逆转BRD4敲低引起的干度调节子表达的下降。此外，miR-142.5p敲低或SKL2001减弱了BRD4敲低对球形成能力的抑制作用。总的来说，研究结果表明BRD4依赖于miR-142-5p/Wnt/B-catenin信号调节干细胞样性状。
    　　 胶质瘤是最常见和恶性的原发性脑肿瘤。目前，手术治疗难以完全切除，神经胶质瘤容易复发。尽管术后放疗和化疗可以在一定程度上提高疗效，但患者的总体预后仍不尽人意。肿瘤异质性是神经胶质瘤抵抗和复发的重要原因。胶质瘤干细胞是发现的最早的CSC之一，它们被认为是一种具有自我更新能力并能分化为其他神经胶质瘤细胞并维持神经胶质瘤生长的细胞。然而，促成神经胶质瘤干细胞发展的机制仍被混淆。在本研究中，发现神经胶质瘤组织中BRD4表达显着增加，并且与神经胶质瘤患者的整体生存呈负相关。此外，通过分析ALDH1活性，主干调节因子的表达以及球形成能力，BRD4的敲低减弱了神经胶质瘤细胞中的干细胞样性状。结合生物信息学分析，发现BRD4通过直接与miR-14-25p启动子结合并促进其DNA甲基化来调节神经胶质瘤细胞的干性，从而抑制了通过靶向Wnt3a来灭活Wnt/B-catenin信号。据出国看病网研究人员所知，这是第一项揭示BRD4在神经胶质瘤细胞干性中的作用的研究。
    　　 MiRNA已显示参与CSC进展。例如，miR-873通过直接与PD-L1结合来抑制乳腺癌细胞的干性；MiR‐139‐5p通过靶向E2‐2降低结肠CSC的干性和转移。MiR-7-5p通过靶向阴阳1来降低耐药性神经胶质瘤细胞的干性并增强替莫唑胺敏感性。在这里首先确定了miR-142-5p减轻神经胶质瘤细胞干细胞样性状的作用和相关机制。结果表明，miR-142.5p直接与Wnt3a结合，从而抑制Wnt/B-catenin信号传导，这是miR-142.5p介导的对神经胶质瘤细胞干性抑制的原因。结合生物信息学分析，通过ChIP和萤光素酶报告基因分析，miR-142.5p被确定为BRD4的靶标，而BRD4增加了miR142-5p启动子的甲基化水平。值得注意的是，最近的一项研究表明BRD4可以直接与miR-216a启动子结合，从而提高其甲基化水平，这是BRD4介导的对胃癌干性的影响的原因。由于一个转录因子可能具有许多靶标，出国看病网研究人员想知道在胶质瘤中是否存在BRD4/miR-216a轴，而在其他肿瘤中是否存在BRD4轴，这应该在将来进行探索。此外，必须指出的是，调控miR-14.2-5p启动子甲基化水平的机制仍不清楚，推测BRD4可能与DNA甲基转移酶DNMT1相互作用，因为已在胃癌中证明了BRD4-DNMT1的相互作用。
    　　 尽管Wnt/B-catenin信号的促进作用已在各种CSC进展中得到了肯定的证实，但其抑制剂尚未在临床试验中，这可能是由于该信号的上游调节剂尚未确定。研究表明，miRNA或其他ncRNA是Wnt/B-catenin信号的重要调控因子，例如miR-103/107通过靶向Axin2和延长Wnt/B-catenin信号传导来增强结直肠癌的干性；LncRNA通过将miR与TCF7L2竞争性结合并增强Wnt/B-catenin信号传导来促进乳腺癌细胞的干细胞样特性。MiR-612通过靶向Wnt/B-catenin信号传导降低肝癌的干性。效果表明，可以探索将miRNA与Wnt信号传导抑制剂联合使用以降低CSC进程，并且可以构建未来的工作来研究miR‐142-5p和Wnt/B联合使用的影响连环蛋白抑制剂对神经胶质瘤细胞干性的影响。总的来说，这项研究确定了一种新型的BRD4轴，可促进神经胶质瘤细胞的干细胞样特性，并为神经胶质瘤的预后和治疗提供潜在的靶点。
 
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海外医疗在国外发展较为成熟，比如在欧美等医疗技术发达国家，很多医院都设有国际病人办公室并配备多语种医学专业翻译人员，就医流程和模式都已相对成熟。在国内，海外医疗虽然还属于新兴行业，但发展势头迅猛，发展潜力巨大，市场前景广阔。
　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
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