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神经胶质瘤细胞增殖被抑制
  • 　　戊二酰亚胺抗生素是链霉菌属产生的一类次级代谢产物。并且特征在于在C-4位置带有多样化侧链的戊二酰亚胺环。最早报道的戊二酰亚胺抗生素是链霉抗生物素蛋白，其最知名的成员是环己酰亚胺，它是真核翻译的抑制剂，也是最常用的抑制蛋白质合成的试剂。基于其抑制真核细胞翻译的特性，一些戊二酰亚胺抗生素具有开发抗肿瘤药和抗病毒药的潜力。例如链霉菌产生的偏头痛素sp。发现MK929-43F1抑制肿瘤细胞迁移，并已用作抗转移药物的药物。
    　　 海洋放线菌是生物活性化合物最丰富的生产者之一，其中大部分来自单一链霉菌属。在出国看病网研究人员正在进行的从海洋相关微生物中发现新型生物活性天然产物的研究计划过程中，海洋链霉菌属。ZZ741是从海洋泥浆样本中分离出来的。从水稻培养基中的ZZ741菌株培养物制备的提取物显示出对神经胶质瘤细胞增殖以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长的抑制活性。在此活性提取物的化学调查导致的11种戊二酰亚胺抗生素。在此研究人员报告了菌株ZZ741的分离和培养以及这些分离化合物的结构阐明和生物活性评估。菌株ZZ741被鉴定为链霉菌。ZZ741基于其16SrDNA序列分析的结果，与数个链霉菌菌株的序列相似。从水稻介质应变ZZ741的质量培养物制备的EtOAc萃取物，通过重复的柱色谱法分离，然后用HPLC纯化，以提供化合物1-11。由CH2Cl2和MeOH的混合物得到无色正交晶体的化合物，其分子式为C15H21NO5，它的紫外光谱对共轭双键的吸收波长为267nm，红外光谱对羰基的吸收光谱为1691cm1HNMR光谱表现出一个杂原子连接质子，一个烯烃质子，两个甲基。所述的分析分子式和考虑表明15个碳原子的存在下其中包括三个羰基，两个烯属碳，一个质子化的碳与氧连接，一个氧亚甲基，两个次甲基，四个亚甲基，以及两个的甲基。在分子式要求的六个不饱和度中，三个羰基和双键占四个不饱和度，其余两个暗示1中有两个环。
    　　 确认相对构型，并将1的绝对构型确定为11R，13R通过单晶X射线衍射分析。通过比较实验性ECD谱图与时间依赖性密度泛函理论计算的ECD谱图，电子圆二色性计算被用于进一步支持1的绝对构型的透视CIF型材1被用于计算ECD，阐明了1的结构是一种新的戊二酰亚胺衍生物，称为链戊二酰亚胺A。其通过HMQC，COSY，HMBC和NOE光谱分析完全分配了C和1HNMR数据。
    　　 在呋喃衍生物4在C-8和C-11环化，并通过一个-CH连接到戊二酰亚胺部分基团，这是不同于呋喃衍生物在1-3它在C-10和C-13处环化，HRESIMS数据表明，化合物5和6的分子式相同，均为C15H21NO6，比4的分子多一个氧原子。4–6的紫外光谱在262nm附近也显示出非常相似的吸收。这些数据表明5和6是4的类似物，但是具有额外的羟基。5和6的结构被鉴定为新的戊二酰亚胺衍生物，分别命名为StreptoglutarimidesE和F。化合物7具有C中的相同分子式HMQC，COSY的详细分析，和HMBC相关性7证明，用在四碳侧链的呋喃环4，通过用在三碳侧链吡喃环代替。根据ECD和CNMR位移计算结果，将7的绝对构型指定为11S，12S，13R。阐明了7的结构作为一种新的戊二酰亚胺衍生物，称为链戊二酰亚胺G。化合物8-10也与戊二酰亚胺部分和环己酮部分戊二酰亚胺衍生物，而不是在呋喃环1-6。对8和9的HRESIMS和13CNMR数据的分析表明，它们具有相同的C15H23NO5式且为异构体。进一步的2DNMR光谱分析表明，两种化合物在C-8处有一个羟基，在C-10处有一个羰基，在C-15和C-16处有两个甲基，第二个羟基的位置不同。8和C-119。因此确定了8和9的平面结构。基于Mosher酯NMR法的结果，确定了C-8和C-12的绝对构型为8的结构因此被鉴定为一个新的戊二酰亚胺衍生物，命名streptoglutarimideH.的相对和绝对构9被分配基于所述NOE相关，则Mosher氏酯NMR分析，以及ECD计算。其绝对配置分配为8R，9R，11S，13S。因此，化合物9被鉴定为新的戊二酰亚胺衍生物，称为链戊二酰亚胺I。这意味着10是一个8和9的脱水类似物。此外NMR光谱分析表明双键的C-8和C-9的存在10，而不是在oxymethineC-8。在NOESY频谱中，NOE相关性强，结构10从而被鉴定为一个新的戊二酰亚胺衍生物，命名为streptoglutarimideJ.的C和HNMR数据的8-10根据它们的HMQC，COSY和HMBC相关性来分配。
    　　 根据HRESIMS数据，NMR光谱分析，Mosher酯的NMR分析以及所报告NMR数据的比较，证明化合物11是已知的链霉抗生物素蛋白A，这是一种从灰链霉菌培养液中分离得到的抗肿瘤和抗真菌化合物。它是先前合成的。
    　　 所有分离的化合物中测定它们对耐甲氧西林的生长抑制活性的金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，和白色念珠菌如在先前的出版物描述通过微量肉汤稀释法。万古霉素，庆大霉素和两性霉素B用作阳性对照。所有11种化合物均具有抗微生物活性，对MRSA的MIC值为9-11ug/mL，对大肠杆菌的MIC值为8-12ug/mL，对白色念珠菌的MIC值为8-20ug/mL。化合物1-11也进行了评价它们对通过磺基罗丹明B测定人神经胶质瘤U87MG和U251细胞的抗增殖活性。阿霉素被用作阳性对照。链球菌戊二酰亚胺H和链霉素A在抑制神经胶质瘤细胞增殖方面表现出强大的活性，IC50值对于8为1.5-3.8uM，对于11为0.05-0.22uM。数据表明链戊二酰亚胺H和链维生素A的抗脑胶质瘤活性。接近阳性对照DOX的活性。已知一些戊二酰亚胺具有抗菌活性。在这项研究中报道的所有新的链戊二酰亚胺A–J均显示出抗菌和抗真菌活性，进一步支持了戊二酰亚胺的抗菌特性。先前已报道已知的链霉抗生物素蛋白A具有翻译抑制活性和针对淋巴瘤的抗肿瘤活性。这项研究报告了链霉抗生物素蛋白A对人神经胶质瘤U87MG和U251细胞的抗增殖活性。
    　　 总之，链霉菌属的海洋放线菌仍然是发现新型生物活性天然产物的重要来源。这项研究报告了10种新的链戊二酰亚胺，所有这些都是15个碳的化合物，其戊二酰亚胺环的C-4位带有不同的侧链。链戊二酰胺A–F的侧链具有修饰的呋喃部分，与已知的戊二酰亚胺抗生素链霉抗生物素和环己酰亚胺不同。所有分离的化合物对MRSA和大肠杆菌均具有抗菌活性，对白色念珠菌具有抑菌作用。链球菌戊二酰亚胺H和链霉素A对人神经胶质瘤U87MG和U251细胞表现出有效的抗增殖活性。人神经胶质瘤U87MG和U251细胞获自中科院细胞研究所。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC43300，大肠杆菌ATCC25922和白色念珠菌。
    　　 ZZ741菌株是9月从中国收集的海泥样品中分离出来的。2016年将样品中的溶液用无菌海水稀释至10-3，10-4和10-5克/毫升的悬浮液。将10–4g/mL悬浮液均匀地铺在培养皿中纱布的固体培养基表面上，然后在28°C下孵育7天。选择一个菌落，并转移到另一个纱布的固体培养基皿中。在28°C下再孵育7天后，将纯菌株ZZ741的菌落转移到纱布的琼脂斜面上，并保存在4°C下进行进一步研究。将来自Gauze琼脂斜面的纯菌株ZZ741菌落接种到500mL锥形瓶中的250mLGauze液体培养基中，然后在摇床上以180rpm的温度在28°C下孵育5天，以制备种子肉汤。将15mL的种子培养液转移至500mL烧瓶中的水稻培养基中，并在28°C下静态培养30天。总共进行了200瓶水稻培养。所有水稻培养物用EtOAc萃取三次。将合并的EtOAc溶液真空浓缩，得到液体提取物，然后将其分散到200mL90％MeOH在H2O中的混合物中。将分散的提取物用己烷分配3次以除去脂质化合物，将剩余的悬浮液真空干燥，得到部分A。
    　　 神父将30M置于SephadexLH-20色谱柱上，用50％MeOH洗脱，得到三份层色谱分析。同样根据其TLC结果，还将50M应用于SephadexLH-20色谱柱，用80％MeOH洗脱，得到四份通过使用Agilent1260HPLC系统在ZorbaxSB-C色谱柱上进行分离，DAD检测为210或280nm，流速为1.0mL/min，化合物11，3和4和9。首先在ODS色谱柱上分离70M，根据TLC分析的结果，用65％MeOH洗脱，得到两部分。然后，神父使用CXTHLC-3000制备型HPLC系统在CT-30色谱柱上进一步分离70M1，紫外检测到280nm，流动相为50％MeOH的H2O溶液，流速为10mL/min，得到四次分数。最后，通过在ZorbaxSB-C谱柱上使用Agilent1260HPLC纯化，流速为1mL/min，并且UV检测为280或254nm，化合物1，2，7和10。将化合物8溶于2mL无水吡啶中，将其分成两等份。到各部分中加入任一的45uLr-MTPA-Cl或小号-MTPA-Cl和然后将混合物在室温下搅拌2小时。通过添加1mL的MeOH来终止反应。每种反应混合物在真空下干燥，得到残余物，将其通过HPLC纯化，得到787-8或8R进行NMR分析。同样，MTPA酯9得到9s和9r，MTPA酯11得到11s和11r。
    　　 通过Merck分子力场利用Spartan的10软件进行了MonteCarlo构象搜索。选择Boltzmann总体超过5％的构象异构体，或从X射线CIF谱图中选择，进行ECD计算。然后使用CPCM可极化导体计算模型在MeOH中的B3LYP水平优化所选构象异构体。该ECD光谱的理论计算，使用TDDFT在B3LYP为化合物的所有的构象6-311水平在MeOH中进行1-10。计算了总共50个激发态的旋转强度。ECD光谱是使用SpecDis1.6和GraphPadPrism7程序通过应用sigma=0.3eV的高斯谱带形状从偶极子长度旋转强度产生的。使用Confab搜索化合物的构象空间，并通过MOPAC2016在PM7的半经验水平上优化了获得的构象。在理论值的B3LYP水平上进一步进行了3kcal/mol能量窗口中构象异构体的优化和频率计算。mPW1PW91的理论水平上计算13CNMR。根据其构型的吉布斯自由能，将获得的每个构象异构体的屏蔽张量平均化为玻尔兹曼。对平均屏蔽张量和实验化学位移进行线性回归，以提供线性关系公式，以将屏蔽张量转换为计算出的化学位移。
    　　 微量肉汤稀释法被用于确定化合物的抗微生物活性1-11对MRSA的生长和大肠杆菌。万古霉素，庆大霉素和两性霉素B用作阳性对照。将微生物在浓度为1×10CFU/mL的96孔板中的MHB培养基中培养，并在37°C与待测化合物孵育12小时后获得MIC值。通过SRB测定法评估了被测化合物抑制人神经胶质瘤U87-MG和U251细胞增殖的活性。阿霉素用作阳性对照。将人神经胶质瘤U87MG和U251细胞分别在含有10％胎牛血清的基本必需培养基和Dulbecco改良的Eagle培养基中培养。将所有细胞在5％CO2湿润的培养箱中在37℃下培养，并将第三代之后的培养细胞用于实验。
 
出国看病概况

海外医疗在国外发展较为成熟，比如在欧美等医疗技术发达国家，很多医院都设有国际病人办公室并配备多语种医学专业翻译人员，就医流程和模式都已相对成熟。在国内，海外医疗虽然还属于新兴行业，但发展势头迅猛，发展潜力巨大，市场前景广阔。
　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
出国看病适应症
靶向药物
 

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