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某些靶向治疗促进胶质瘤细胞生长
  • 　　胶质瘤是中枢神经系统中的一种原发性脑肿瘤，具有高度侵袭性。尽管神经胶质瘤的发病率相对较低，根据出国看病服务机构观察，新诊断的患者人数正在增加。由于神经胶质瘤倾向于侵入周围组织，因此当前的治疗策略无效，因此患者的预后仍然很差。因此，当前迫切需要探索该疾病的病理机制以设计新的治疗干预措施。与前进的知识和微RNA的理解中，miRNA是目前已知如通过翻译抑制和mRNA击穿一类重要的基因表达的转录后调节器的。已证明它通过靶向靶基因的3'-非翻译区参与多种生物学过程，包括细胞增殖，分化，迁移，凋亡，细胞周期调控以及侵袭，发育和代谢。在许多疾病中，尤其是在癌症中，发现了miRNA的异常表达。实际上，已经报道了广泛的miRNA可以作为人类神经胶质瘤的诊断和预后的生物标志物发挥作用。降低的miR-374A的表达与神经胶质瘤进展相关，而增加的miRNA-21，的miR-128或miR-342-3p的表达均与组织病理学等级胶质瘤相关。实际上，发现有超过97个miRNA通过miRNA微阵列异常表达，并通过主要的信号通路参与了神经胶质瘤的发病过程。然而，miR-454-3p在神经胶质瘤中的作用及其潜在机制仍然知之甚少。
    　　 早期生长响应3是C2H2型锌指蛋白EGR家族的成员。它调节基因转录，并且已经发现其参与多种生物过程，包括肌肉，淋巴细胞和神经元的发育，除了癌细胞的生长，迁移，侵袭和转移。因此，异常EGR3表达和分裂情感障碍，精神分裂症，系统性自身免疫，和各种癌症之间的关联已经被先前证明。在肝细胞癌中，通过上调Fas配体表达来下调EGR3表达，促进细胞增殖。相比之下，非小细胞肺癌中KH型剪接调节蛋白降低EGR3表达可抑制细胞侵袭和转移。这些先前的发现表明，EGR3的功能可能会根据所讨论的癌症类型而有所不同。在本研究中，目的是阐明miR-454-3p在神经胶质瘤中的潜在作用，并探讨其潜在机制。这些结果可以加深对神经胶质瘤发病机制的认识，为神经胶质瘤的治疗提供新的分子靶点。
    　　 从40名根据世界卫生组织分类法诊断为胶质瘤的患者中，未进行术前放疗或于2015年1月至2016年12月，在医院接受手术化疗。接受新辅助治疗或辅助治疗的患者被排除在本研究之外。收集肿瘤和邻近的非肿瘤颅内组织样品，并立即在液氮中冷冻。人类神经胶质瘤细胞系U138MG和U251，连同293T细胞购自美国典型培养物保藏中心。正常人星形胶质细胞，A172购自BeNa培养物保藏中心。将U138MG，NHA，A172和293T细胞在补充有10％胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM中培养。而U251细胞则在补充有10％胎牛血清和青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中培养在37°C的含5％CO2的加湿培养箱中。
    　　 合成了miR-454-3p模拟物及其阴性对照，miR-454-3p抑制剂及其阴性对照，用于EGR3的siRNA及其阴性对照。为了过表达EGR3，使用含有BamHI限制性位点使用KOD-Plus-Neo聚合酶从NHA细胞中扩增出EGR3的编码序列。-3'和反向引物，包含EcoRI限制性位点然后亚克隆到pcDNA3.1质粒中。所述模拟物的和miR-454-3p的抑制剂，siEGR3，质粒和它们的阴性对照使用Lipofectamine转染到细胞3000根据制造商的协议。根据制造商的规程，使用mirVanamiRNA分离试剂盒从细胞或组织中提取总RNA。为了测量miR-454-3p表达的水平，根据制造商的方案，使用TaqManMicroRNA逆转录试剂盒进行逆转录。为了确定EGR3的mRNA水平，使用带有gDNA橡皮擦的PrimeScriptRT试剂盒将总RNA反转录为cDNA。定量PCR使用SYBR进行PrimeScriptRT-PCR试剂盒根据使用AppliedBiosystems公司制造商的协议在以下热循环条件下的7500Real-TimePCR系统：在95°C下初始变性10分钟，然后在95°C下进行40次循环5秒，在60°C下进行30次循环30秒U6snRNA和GAPDH分别用作miR-454-3p和EGR3的参考基因。使用MTT和集落形成测定法测量细胞生长。对于MTT分析，将约3,000个细胞/孔接种到96孔板中，然后在指定的时间向每个孔中加入20ul溶于PBS的MTT，再孵育4小时。然后小心地除去上清液，并向每个孔中加入150ulDMSO，随后将平板摇动10分钟以溶解甲maz晶体。然后使用ThermoScientificMultiskan在每孔中测量490nm的光密度。为了进行集落形成测定，将1,000个细胞接种到6孔板的每个孔中，并培养14天。随后在室温下使用10％甲醛固定菌落5分钟，并在室温下使用0.1％结晶紫将其染色30秒钟。使用光学显微镜计数每种条件下的菌落数。
    　　 对于双荧光素酶报告基因测定，将4,000个293T细胞接种到96孔板中，并将编码EGR3的野生型或突变型3'UTR的pMirGLO质粒共转染到20nM的细胞中任一的miR-454-3p模拟物或NC使用Lipofectamine3000和萤火虫海肾萤光素酶活性进行测定使用双荧光素酶转染后24小时根据制造商的方案报告基因检测系统。萤火虫萤光素酶活性被标准化为海肾萤光素酶活性。每个实验独立重复三遍。对于蛋白质印迹，将组织在RIPA缓冲液中匀浆，从中分离蛋白质样品。使用皮尔斯量化后将双泳宁酸蛋白质测定试剂盒，每泳道40ug总蛋白质样品进行10％SDS-PAGE，然后转移到PVDF膜上。然后在室温下用溶于PBS的5％脱脂牛奶将膜封闭1小时，然后与针对EGR3的一抗和GAPDH在4°C过夜。随后，将膜用带有Tween-20的tris缓冲盐水洗涤3次，每次3分钟，每次5分钟，然后在辣根过氧化物酶偶联的二抗中孵育，在室温下放置1h。使用增强的ECL试剂盒可视化蛋白带，并使用ChemiDocTMXRS+系统捕获蛋白带。使用ImageJ对条带进行定量，并根据GAPDH进行标准化。使用GraphPadPrism6软件进行统计分析，数据表示为平均值±SD。使用Student'st检验分析两组之间的差异，而对>3组进行ANOVA后的Tukey多重比较检验。并使用Kaplan-Meier方法构建生存曲线，并通过对数秩检验进行比较，根据miR-454-3p的中位表达将高表达组和低表达组分开。P小于0.05被认为表明具有统计学意义的差异。
    　　 为了研究miR-454-3p在人类神经胶质瘤发病机理中的作用，使用RT-qPCR比较了40例患者颅内组织中神经胶质瘤和相邻非肿瘤样品中miR-454-3p的表达水平。miR-454-3p的表达水平与肿瘤大小和WHO分期有关。与邻近的正常组织相比，在胶质瘤组织中的miR-454-3p表达明显更高。总体生存期分析显示，miR-454-3p表达水平较高的患者与总体生存期明显缩短有关。结果表明，miR-453-3p可能与胶质瘤的发生有关。为了进一步确定miR-454-3p在神经胶质瘤细胞中的功能，在U251，U138MG和A172神经胶质瘤细胞系和NHA细胞中测量了miR-454-3p的表达水平。当与NHA细胞相比时，发现在胶质瘤细胞中miR-454-3p表达显着增加，其幅度在U251细胞中最大。
    　　 进行MTT和集落形成测定以确定miR-454-3p对细胞增殖的影响。考虑到U138MG和U251细胞中miR-454-3p的表达水平不同，首先分别用miR-454-3p模拟物或抑制剂转染U138MG和U251细胞。与相应的阴性对照相比，用miR-454-3p模拟物转染的U138MG细胞中miR-454-3p的表达水平显着增加；相反，与相应的NC-in相比，用miR-454-3p抑制剂转染后，U251细胞中的miR-454-3p表达显着降低。MTT分析显示miR-454-3p过表达显着增加了U138MG细胞的活力，而miR-454-3p敲低显着降低了U251细胞的活力。集落形成试验显示出一致的结果。与用NC转染的U138MG细胞相比，用NC转染的U138MG细胞表现出明显更多的集落，而转染了U251细胞使用miR-454-3p抑制剂可显着降低菌落数。这些结果表明，miR-454-3p的过表达增强了体外人胶质瘤细胞的生长。使用TargetScan数据库预测了miR-454-3p的潜在靶基因。检测到miR-454-3p在EGR3的3'UTR上的潜在结合位点。为了验证这一点，使用编码EGR33'UTR的野生型或突变序列的质粒进行了双重荧光素酶报告基因检测。与野生型EGR33'UTR和miR-454-3p模拟物共转染的细胞的相对荧光素酶活性显着低于与NC和野生型EGR33'UTR共转染的细胞。然而，与miR-454-3p模拟物共转染的细胞和EGR33'UTR突变体序列的相对荧光素酶活性相比，与NC和EGR33'UTR的突变体序列共转染的细胞没有显着差异。根据RT-qPCR分析，与转染NC的细胞相比，转染miR-454-3p模拟物的U138MG细胞中EGR3mRNA的表达水平显着降低。相反，与用NC-in转染的细胞相比，用miR-454-3p抑制剂转染显着降低了U251细胞中EGR3的表达。与用NC转染的U138MG细胞相比，用miR-454-3p模拟物转染显着降低了EGR3蛋白的表达水平，而用miR-454-3p抑制剂转染与转染NC-in的细胞相比，U251细胞中的EGR3蛋白表达显着增加。这些结果表明EGR3是miR-454-3p的靶基因。
    　　 为揭示EGR3在神经胶质瘤肿瘤中的功能和意义，使用RT-qPCR和Westernblot分析了EGR3在神经胶质瘤和邻近正常组织中的表达水平。与邻近的正常组织相比，神经胶质瘤组织中EGR3mRNA的表达和蛋白质显着降低。使用MTT和集落形成试验进一步研究了EGR3对神经胶质瘤细胞增殖的影响。首先通过转染表达EGR3的质粒在U138MG细胞中过表达EGR3，然后通过siRNA转染在U251细胞中敲低EGR3。使用RT-qPCR和Westernblot分析证实转染效率。与转染阴性对照载体的细胞相比，EGR3过表达显着降低了U138MG细胞的活力，除了显着降低了U138MG细胞的集落数。相比之下，转染siEGR3后，与转染siNC的U251细胞相比，U251细胞的存活率显着提高，集落数也显着更高。基于从本研究中已经获得的发现，假设miR-454-3p可以通过靶向和调节EGR3表达来促进神经胶质瘤细胞的增殖。仅用miR-454-3p模拟物转染U138MG和U251细胞，或仅用miR-454-3p模拟物和EGR3质粒共转染。用miR-454-3p模拟物转染可显着降低EGR3表达，这可通过与EGR3质粒共转染来逆转。此外，MTT和集落形成分析的结果表明，用miR-454-3p模拟物转染可提高细胞活力和集落形成，但在U138MG和U138MG中与EGR3质粒共转染可逆转U251电池。这些结果表明，miR-454-3p通过负调节EGR3的表达促进神经胶质瘤细胞的增殖。
    　　 胶质瘤是中枢神经系统中常见的恶性肿瘤，从诊断开始，大多数患者的总体预后约为1年。由于高侵袭率，目前可用于神经胶质瘤的联合疗法的益处有限。因此，必须探索诊断和治疗该疾病的病理机制和新的治疗策略。先前的研究表明，与健康对照相比，神经胶质瘤患者的血浆miR-454-3p水平上调，其中高miR-454-3p表达的神经胶质瘤的预后明显低于低miR-454的神经胶质瘤。确实，有越来越多的证据表明，miRNA的异常表达与包括癌症在内的许多疾病的发病机制有关。许多研究先前已发现了miR-454-3p在胃癌和骨肉瘤。这些结果表明，miR-454-3p的表达谱在不同类型的癌症中是不同的。在本研究中，发现与邻近的正常组织相比，神经胶质瘤组织中的miR-454-3p表达上调，这与先前在血浆中发现的结果一致。此外，先前在肝细胞癌和三阴性乳腺癌中也发现了miR-454-3p表达增加与预后不良之间的关联。两者合计，这些结果表明，miR-454-3p可能作为胶质瘤的潜在预后生物标志物，尽管miR-4543-3p在神经胶质瘤中的作用仍然未知。
    　　 由于细胞增殖是癌症病理生理学的最重要标志之一，因此本研究评估了miR-454-3p对神经胶质瘤细胞生长的影响，并发现miR-454-3p的过表达可以显着促进细胞生长。EGR3随后被确定为miR-454-3p的直接靶标，其中miR-454-3p的过表达抑制了EGR3mRNA和蛋白质表达。还发现EGR3的过表达在体外逆转miR-454-3p模拟物诱导的细胞增殖。先前的研究报道EGR3在大脑皮层，基底神经节和神经肌肉纺锤体中普遍表达。先前已在前列腺癌中证实了增加的EGR3表达诱导的IL-6和IL-8表达，表明EGR3在肿瘤发生中也起重要作用。值得注意的是，与邻近的正常组织相比，神经胶质瘤组织中的EGR3也被下调，体外EGR3的敲低促进了神经胶质瘤细胞的增殖。
    　　 先前已经发现，通过miR-454-3p模拟物的转染，miR-454-3p在肝星状细胞中的过表达可以通过靶向SMAD4使肝星状细胞失活，而SMAD4参与转化生长因子-B信号传导。miR-454-3p的过表达也可以通过靶向N-myc下游调控的基因2来促进前列腺癌细胞的生长，而miR-454-3p的表达上调则可以通过直接靶向PTEN来促进NSCLC的发展。这些结果表明，miR-454-3p通过与多个靶标结合而参与许多信号传导途径的调控。因此，miR-454-3p在神经胶质瘤中的作用也可能是通过其他信号传导途径进行的，尚需进一步研究。总而言之，本研究是第一个通过负调节EGR3表达来证明miR-454-3p参与神经胶质瘤细胞增殖的研究。这些发现为这种疾病的潜在生物学特征提供了宝贵的见解，并可能为开发可能的新型治疗靶标提供途径。
 
出国看病概况

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　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
出国看病适应症
靶向药物
 

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