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脊索瘤进展的新细胞培养系统
  • 　　脊索瘤是一种罕见的恶性骨肿瘤从脊索细胞起源，如图导致巨额在脊索瘤，所述短尾转录因子的T-基因的高表达水平这也是脊索发展的重要调节剂。脊索瘤始于脊柱，从颅骨到骶骨区域。脊索瘤的总发生率是低的，它被定义为罕见疾病。转移发生在高达40％和复发性疾病是频繁。诊断后中位生存期为6-7年。有用于新颖疗法，如靶向PDGF的功效一些旁证或EGF受体或CDK4/6，但到现在为止没有这些潜在疗法已被批准。目前的治疗策略仍然是手术与放疗结合。肿瘤组织学上分为几个子组指示了相当间和个体内差异。在其他瘤形成中，已知这种多样性对治疗结果和病变对不同治疗剂的反应具有影响。人们对脊索瘤的这种异质性知之甚少，尤其是因为缺乏合适的细胞培养模型。在这里，研究人员提出了细胞系U-CH17P，U-CH17M和U-CH17S，它们分别来自同一患者的原发性骶骨脊索瘤，皮肤转移和软组织转移。该细胞培养模型可用于获得脊索瘤发展，其异质组成和导致转移的因素的新见解。
    　　 直接在手术切除后，处理肿瘤组织用于细胞培养。机械切碎后，用胶原酶部分消化小肿瘤块。将细胞在含有10％胎牛血清的Iscove'sModifiedDulbecco'sMedium/RPMI1640，2mM谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素中培养，并在37℃培养。37℃和5％CO2。使用部分胰蛋白酶消化技术和多个传代培养步骤选择性地将肿瘤细胞与成纤维细胞分离，直到细胞培养物仅由具有特征性生理细胞质的脊索瘤细胞组成。通过免疫细胞学测试验证Brachyury的表达100％肿瘤细胞阶段。所有执行的方法和实验均符合联邦医学委员会伦理委员会的指导原则。该研究是根据“赫尔辛基宣言”进行的。所有实验方案均根据乌尔姆大学当地伦理委员会进行和批准。
    　　 对于总蛋白质分析，将细胞在含有两种磷酸酶的Tris-NaCl-Triton-X100缓冲液中裂解。和蛋白酶抑制剂混合物。在液氮中孵育3分钟后，将裂解物在14,000rpm，4℃下离心15分钟。在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离20ug总蛋白质，然后应用半干法电印迹到硝酸纤维素膜上。使用以下一抗：抗Brachyury和抗B-肌动蛋白。与适当的二级辣根过氧化物酶偶联抗体孵育后，使用K005AP/RED检测系统，应用抗生物素蛋白-生物素-复合物-方法，对福尔马林固定和石蜡包埋的组织切片进行免疫染色。使用以下抗体：Brachyury，上皮膜抗原，波形蛋白，细胞角蛋白，Ki-67，S100-蛋白质。
    　　 表达分析在生物学一式三份中进行。从细胞培养物中分离总RNA，彼此之间具有2-3次传代的时间延迟，以避免培养和群体倍增依赖性测量假象。多层测试在层次聚类分析和无监督聚类中紧密组合在一起，表明没有基本的细胞培养依赖于细胞系表达模式的变化。使用RNeasyMini-Kit从细胞系中提取总RNA。使用2100生物分析仪进行质量和数量控制。使用Human4x44KWholeGenomeMicroarray，根据Agilent基于单色微阵列的基因表达分析方案进行Cy-3标记和样品杂交。至少分析每个样品一式两份，并通过SureScan微阵列扫描仪捕获信号。使用Genespring12.1软件分析产生的数据，使用欧几里德相似性度量和质心链接规则执行分层聚类。差异表达的基因具有统计学意义与最近公布的9个骶骨脊索瘤细胞系的表达数据进行比较。差异表达的基因具有统计学意义。
    　　 通过根据适应的标准方案监测软琼脂中单细胞的生长行为来测量细胞系U-CH17P，-M和-S的锚定非依赖性增殖。对于专门的培养基，制备IMDM和RPMI1640的两倍浓缩混合物并与1％LMP琼脂糖混合，以在培养基中得到0.5％琼脂糖的终浓度。将6孔细胞培养板的孔用1.5mL该混合物在4℃下包被过夜。在接种细胞之前将温度升至37℃持续30分钟。分离细胞系的细胞，计数并制备细胞悬浮液。将等量的细胞悬浮液和1％琼脂糖在37℃下混合，在0℃下获得10,000个细胞/mL的悬浮液。5％琼脂糖。将约1mL该混合物转移到6孔板的每个孔中。使混合物在室温下固化。然后，在顶部添加200uL培养基。考虑到脊索瘤细胞的缓慢增殖，特别是当以低密度接种时，将细胞在37℃下孵育49天，然后监测集落。每周两次，加入100uL培养基。孵育期后，对菌落计数并使用ImageJ软件测量菌落面积。对于每个细胞系，进行六次独立实验。
    　　 脊索瘤细胞系由原发肿瘤的活组织检查和38岁男性高加索人患者的两个不同转移瘤建立。在活组织检查后8周切除残留的原发肿瘤和转移组织。切除的原发肿瘤大小为22cm×18cm×9.9cm。转移的直径分别为1.5和2.7cm。在第一次活检之前，同时直到肿瘤切除，患者没有接受专门治疗。肿瘤切除后，患者接受放疗和伊马替尼全身治疗。患者在切除肿瘤后9个月死亡。
    　　 原发肿瘤的组织学与经典，梭形细胞，软骨样和间变区域是异质的。皮肤转移主要地是古典，physaliferous类型的，而软组织转移是梭形细胞亚型的。所有病变强烈表达短尾。U-CH17P由原发肿瘤确定，U-CH17S来自皮肤转移，U-CH17M来自软组织转移。为了达到纯肿瘤细胞阶段，将U-CH17P培养9个月，转移细胞系分别在培养3个月后被认为是纯细胞培养物。遵循稳定细胞系的指导原则，在进行实验之前培养细胞系大于50次群体倍增。短串联重复分析证实了来自同一患者的不同细胞系。所有三种细胞系都检测为支原体污染阴性。衍生细胞系的形态主要反映起源组织的外观。细胞系的形状不同。U-CH17P和U-CH17M都显示出梭形细胞样形态，特别是在培养高密度时。相互比较，U-CH17P的单细胞趋于更大和更突出。许多U-CH17P细胞具有两个细胞核，而大多数-M细胞是单核细胞。该UCH17S细胞似乎比其他线更小和更少physaliferous和成长为一个扁平细胞层。了Brachyury的表达是保守的。Western印迹分析也证实了这一点。与其他脊索瘤细胞系相比，U-CH17P，-M和-S的群体倍增时间高度依赖于细胞密度。发现细胞系最佳生长的最佳初始细胞密度为12,000-24,000个细胞/cm2。U-CH17M和U-CH17S的PD平均为约3，对于U-CH17P为约6-9天。在非常低的密度下，U-CH17P细胞比U-CH17M和-S更容易增殖。但是所有三种细胞系都需要大于10天才能翻倍。所有三种细胞系都具有二倍体染色体组，如通过FISH分析的着丝粒计数和在细胞周期分析中比较肿瘤细胞与对照成纤维细胞的总DNA量的组合所示。FISH分析显示至少有一份CDKN2A丢失已知是脊索瘤的典型基因组畸变。在免疫细胞学上，所有细胞系对波形蛋白和细胞角蛋白都是强阳性的。S100蛋白和上皮膜抗原在三种细胞系中表现出不同的表达，表明线之间的明显差异。在细胞周期分析中，细胞向细胞周期阶段的分布没有根本差异。只有具有单核的U-CH17P细胞似乎具有从G0/1-到S期的总细胞的约10％的移位。这可能是由于估算组合峰中单核和双核细胞数量所需的计算模型）。可以假定三种肿瘤细胞系的细胞周期没有显着差异。为了确定细胞的克隆性和致瘤性，进行了在软琼脂和球状体形成测定中的生长实验。
    　　 使用软琼脂实验测试细胞系的不依赖贴壁的增殖能力。虽然所有三种细胞系能够在软琼脂中增殖，亲代肿瘤衍生的细胞系U-CH17P形成不是UCH17M和U-CH17S显著更多集落，U-CH17P的菌落直径比其他线。这表明细胞系的不依赖锚定的增殖与锚定依赖性增殖不同。U-CH17P显示出比-M和-S具有更长的群体倍增时间。在球状体形成测定中，U-CH17P也形成最多数量的球状体。尽管U形CH17M和U-CH17S能够在球状体生长，也两种细胞系中表现出较低的显著倾向形成这些立体空中生长结构。通过U形CH17M和-S产生的球状体的尺寸。所有三种细胞系都能够形成球状体。与转移酶衍生系U-CH17M和-S相比，U-CH17P球状体的数量高得多，这表明原发性肿瘤衍生细胞系内的肿瘤干细胞数量更多。球状体的不同大小反映并证实了经典细胞培养物中细胞系的增殖速度。转移来源的细胞系倾向于比来自原发性肿瘤的细胞系更快地增殖。
    　　 出国看病网研究人员使用全基因组方法来比较细胞系的染色体改变与相应的肿瘤材料。增益和衍生的细胞系的UCH17S和U-CH17M的转移损失适合在始发组织中检测的像差。大多数皮肤转移组织的改变在U-CH17S中是保守的，例如染色体1q，2,5p，6,7,8,12,15,16,17,19,20q和X上的增加。只有很小的差异存在例如，在所述细胞系中染色体5q的。U-CH17M显示出与软组织转移相当的畸变。只有少数染色体的改变不同，例如中，在染色体9和22的额外损耗在细胞系中。两种转移细胞系的拷贝数变化非常少，即9,11,14,15,16q和19q染色体上的增加。一方面，这指出了两条线的共同起源。另一方面，它表明两种细胞系在遗传基础上可以清楚地区分开来。原发性肿瘤组织来源的细胞系U-CH17P具有非常不同的改变特征，主要包括损失。增益只在10便士和16。这表明原发性和转移性线之间的资本差异。比较原发肿瘤组织与那些U形CH17P的的变化表明，不象到转移线，像差重叠的数量是相当低的。除了在染色体9上的损失之外，在U-CH17P中检测到的几乎所有损失都存在于相应的组织中。这表明在原发性肿瘤组织内存在不同的克隆。转移的染色体变化进行了比较，那些原发肿瘤组织的。分析显示原发肿瘤组织中所有现有的增益都被转移细胞系的增益所覆盖。显示出原发肿瘤的所有基因组改变存在于所述细胞系检测出的总结像差。
    　　 研究人员对新建立的脊索瘤细胞系进行了基于微阵列的基因表达分析。U-CH17细胞系在12个脊索瘤细胞系的比较表达分析中清楚地聚集在一起。从同一条线分离的独立探针的多次测试之间的密切关系证明了表达分析的可靠性。U-CH17细胞系形成一个独特的亚家族，证明这些细胞系之间的关系比其他脊索瘤细胞系更紧密。它们可以清楚地彼此分开，证实它们作为独立细胞系的特征。寻找原代细胞系和转移细胞系中差异表达的基因，进行倍数变化分析。了U-CH17P和转移株系之间20个最差异表达的基因。发现与初级系相比最高表达的基因是碳酸酐酶，黑素瘤相关抗原C2和单胺氧化酶B。转移细胞系中下调最低的基因是DLEC1，NTRK2和PPP2R2B。可以在肿瘤进展体外模型中发现各种基因的基因表达的显着差异。
    　　 由于脊索瘤非常罕见，检查大群的可能性有限。新的脊索瘤细胞系的建立对于促进对引起脊索瘤，其转移和复发的发生的潜在机制的理解是至关重要的。从2000年初开始，建立了第一个脊索瘤细胞系。以大于10行从骶骨和clival初级脊索瘤始发。缺乏反映转移性疾病复杂性的模型系统。U-CH17模型系统是研究转移性脊索瘤的基本细胞和遗传背景的独特实例。在形态学水平上，研究人员显示分离的细胞系的形状与所描述的脊索瘤的异质性不相符。这形态多样性是通常存在于原发肿瘤，但在其本身呈现相当更均匀的转移减少。这可以解释为脊索瘤细胞能够通过激活不同的途径或原发性脊索瘤本身在不同阶段之间切换由不同的肿瘤亚克隆组成，具有形成转移的不同倾向。研究人员通过比较从原发肿瘤组织分离的DNA的基因组谱，同一患者的两个转移瘤和通过阵列比较基因组杂交从这些组织建立的相应细胞系来测试这些假设。研究人员表明转移细胞系的遗传物质的获得和损失的基因组景观与相应组织的基因组景观非常相似，并且两个转移体共享许多但不是所有遗传变异的特征。相原发性肿瘤及其衍生细胞系的比较显示，组织中检测到的基因组变化的仅一部分被细胞系中检测到的变化所覆盖。这表明分离的细胞系在建立过程中丧失了许多遗传变异，或者原发肿瘤已经由具有区别性遗传改变的亚克隆组成。研究人员比较了原发肿瘤与转移细胞系的收益和损失情况。在这些细胞系中发现的变化覆盖了原发肿瘤的改变，这些改变不能归因于原发性肿瘤细胞系。研究人员假设在原发肿瘤中存在至少三个明显不同的脊索瘤克隆。这些克隆中的两个在患者中形成转移。因此，转移来源的细胞系是与源自原发性肿瘤的第三系相比具有更高转移倾向的脊索瘤克隆的实例。
    　　 锚定非依赖性细胞生长和致瘤性的测试显示不同细胞系的不同趋势。在软琼脂测定中，U-CH17P能够建立更多的集落，其大小比转移来源的细胞系更大。这表明U-CH17P单细胞具有更高的存活和重建肿瘤的能力，而不依赖于肿瘤的微环境。在非常低的细胞密度下，与标准细胞培养物中的其他两个细胞系相比，U-CH17P细胞似乎增殖更快。在软琼脂测定中，将细胞分离成单细胞阶段而不与其他细胞显着接触。软琼脂培养中较大的菌落符合U-CH17P细胞在低接种密度下增殖更快的趋势。
    　　 在拷贝数的相反变化补充了误导性的正常信号。U-CH17S在9号染色体上显示出明显的增益，而U-CH17M和U-CH17P在该染色体上有损失。在原发性肿瘤组织的DNA谱中，染色体9似乎没有拷贝变异。这可以被视为对基础克隆的相反拷贝变化的总结。FISH分析显示CDKN2A至少丧失，CDKN2A是脊索瘤的遗传标志。U-CH17M和U-CH17S在染色体12的一个拷贝中具有明显的增益，而原始肿瘤组织谱和U-CH17P都没有显示该染色体的任何拷贝数变异。这暗示另一种脊索瘤克隆的存在类似于作为细胞系建立的克隆，但是作为独特的染色体标记物具有染色体12缺失。原发性脊索瘤的异质性是由于亚克隆确实与其相关但仍然可以清楚地区分开来。
    　　 脊索瘤细胞系的原发性脊索瘤和形态学上不同的单个细胞的形态学不同的亚型可以通过几种基因的不同表达来分类。这被解释为分别在肿瘤或肿瘤细胞系内激活开关的途径。这并不排除混合不同克隆的可能性。研究人员对三种U-CH17细胞系进行了表达谱分析，并将它们相互比较，并与其他9种脊索瘤细胞系进行比较。无监督的层次聚类揭示U-CH17细胞系聚集在一起，暗示与其他脊索瘤细胞系相比更紧密的关系。虽然与源自其他脊索瘤的线更紧密相关，但是通过不同基因的表达的不同，U-CH17系明显不同。对可能参与转移的基因感兴趣。将U-CH17S和U-CH17M细胞系分组，并测试细胞系U-CH17P的表达差异。先前已经描述的几种基因已经被描述为对肿瘤生长，肿瘤细胞的迁移或通常与转移性疾病相关的基因的影响被发现在源自转移的细胞系中高度失调。碳酸酐酶III，其表达被证明对SK-Hep1肝细胞瘤细胞中的细胞生长和侵袭性具有影响，显示与原发性脊索瘤细胞系U-CH17P相比，转移系中的上调超过1,000倍。已知其他高度上调的基因如MAGEC2和DSCR8分别参与乳腺癌和黑素瘤的转移性疾病。下调DLEC1在鳞状细胞癌，前列腺腺癌，发现和淋巴瘤而分泌型卷曲相关蛋白4的下调与减少的细胞凋亡相关。发现这些失调的基因与癌症或癌症相关的机制直接相关，如迁移，增殖和凋亡，这些都是U-CH17作为脊索瘤癌症进展模型的可用性，以启发迄今为止未知的转移和进展机制。罕见的肿瘤实体。
 
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　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
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