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胚胎转录因子赋予脊索瘤化学抗性
  • 　　脊索瘤是一种罕见的骨肿瘤，优先影响颅底和脊柱的骨骼。脊索瘤起源于胚胎脊索的遗留物，主要胚胎轴向结构位于骨干之前，具有组织学特征并表达脊索细胞的特征基因。脊索细胞通常在出生后在椎骨轴和颅底持续存在。很少，这些细胞经历恶性转化，导致脊索瘤的形成。脊索瘤既是散发性的又是遗传性的。Brachyury蛋白在脊索形成中起关键作用，由T基因编码，最近由于其与家族性脊索瘤的关联及其在上皮-间质转化中的作用而受到广泛关注。
    　　 首次在小鼠中描述了brachyury突变作为影响尾长的突变。缺乏T基因的小鼠胚胎未能形成脊索，后部区域和尿囊;这些胚胎在妊娠大约10天后死亡。436个氨基酸的蛋白质，并且在脊椎动物中高度保守。斑马鱼没有尾巴基因突变的表型模拟小鼠brachyury突变胚胎，因为他们缺乏分化的脊索和尾部区域。Brachyury通过其称为T-box的N末端结构域与特定DNA序列结合。除了其在早期胚胎发育中的功能外，Brachyury还可在肿瘤发生中起关键作用。短尾通过抑制E-钙粘蛋白表达调节人肺肿瘤中的EMT。Brachyury通过调节NANOG表达来维持结直肠癌干细胞的“塑性状态”。它在脊索瘤中的功能受到了很多关注。Brachyury是脊索来源的癌症的特异性标志物，是脊索瘤的诊断标志物。brachyury中常见的单核苷酸多态与脊索瘤密切相关。含有T基因的6q27染色体区域在家族性脊索瘤中复制。染色体区域7q33也与家族性脊索瘤相关。
    　　 脊索瘤的治疗具有挑战性，手术切除肿瘤组织是首选。最近的一份报告表明靶向治疗对脊索瘤的疗效。由于对当前化学疗法的抗性，脊索瘤患者的局部复发率仍然很高。一些基因参与脊索瘤化疗耐药，如缺氧诱导因子1和多药耐药相关蛋白1。Brachyury参与某些癌症干细胞的化疗耐药性。敲除Brachyury可增加腺样囊性癌细胞对化疗和放疗的敏感性。脊索瘤化疗耐药的分子机制仍然难以捉摸。使用脊索瘤细胞系来研究胚胎转录因子Brachyury在调节紫杉醇敏感性中的功能。下调Brachyury表达使细胞系对紫杉醇诱导的细胞凋亡更敏感。通过微阵列分析鉴定Brachyury调节的基因。提供证据表明碳酸酐酶9充当Brachyury靶基因并且参与脊索瘤对紫杉醇诱导的细胞凋亡的抗性。
    　　 在手术前没有辅助治疗史的患者术中获得脊索瘤样本。在手术切除后立即将样品置于冰上并运送至实验室。将肿瘤组织切碎，用PBS充分洗涤，转移到100-mm培养皿中，并在含有10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中于37℃，5％CO2培养。
    　　 在合成cRNA并用Cyanine-3-CTP标记之前，将总RNA转录成双链cDNA。然后将标记的cRNA杂交到微阵列上。洗涤后，使用AgilentScannerG2505C扫描阵列。应用特征提取软件分析阵列图像以获取原始数据。Gene-spring用于完成原始数据的基本分析。首先使用分位数算法对原始数据进行归一化。选择所有条件中任何1个中至少100％的值具有“检测到”中的标记的探针用于进一步分析。通过倍数变化和变异来鉴定具有差异表达的基因用t检验计算P值。倍数变化大于等于2.0且P值≤0.05被设定为上调和下调基因的阈值。
    　　 将裂解物在ChIP稀释缓冲液中稀释，并与鲑鱼精子DNA/蛋白A琼脂糖浆一起孵育以除去非特异性背景。将染色质溶液依次与RNAPolII抗体和抗fl抗体一起温育，并在4℃下旋转过夜。为了沉淀珠子，将溶液离心。IgG用作阴性对照。剩余的蛋白质被蛋白酶K消化。用苯酚/氯仿/异戊醇提取DNA，用0.1体积的3M乙酸钠和2体积的含糖原的乙醇沉淀。CA9启动子内的侧翼潜在结合位点被设计用于基因组片段的PCR扩增。使用2.0％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物。
    　　 用PBS洗涤细胞，并使用RIPA裂解缓冲液制备细胞裂解物。蛋白质样品在10％SDS-变性的聚丙烯酰胺凝胶上分离。进行免疫印迹并使用以下抗体：兔抗Brachyury抗体，兔抗CA9抗体和小鼠抗β-肌动蛋白抗体。使用Odyssey扫描仪显现印迹。切下50个脊索瘤样品的福尔马林固定，石蜡包埋的3-μm组织切片。两个相邻切片分别用Brachyury或CA9一抗染色。使用标准方案进行免疫染色。将样品脱石蜡，在二甲苯中脱蜡，并在梯度乙醇系列中再水合。将切片浸入1μMEDTA缓冲液中，并通过微波样品进行25分钟的热诱导表位修复。通过将样品浸入0.3％甲醇过氧化氢溶液中15分钟来阻断内源性过氧化物酶活性。将载玻片在正常非免疫血清中孵育30分钟以减少抗体的非特异性缀合。将Brachyury一抗和CA9一抗分别加入相邻的载玻片中，并在4℃温育过夜。使用ABC试剂盒染色载玻片，然后用苏木精复染色。为了确保IHC染色的特异性，省略一抗的切片用作阴性对照。为了评估CA9和Brachyury免疫反应性，两位独立的病理学家在200×放大倍数下选择代表性视野，并计算阳性染色细胞的百分比。CA9的免疫活性评估如下：得分0，无染色细胞;得分1+，局部阳性染色或弱阳性，少于25％的细胞;得分2+，超过25％的细胞中度阳性染色;并且在超过25％的细胞中得到3+，强阳性染色。对于Brachyury，阳性染色的强度基于0至3的评分。阳性染色细胞的百分比也基于以下标准评分：0，无染色;1，不到25％的肿瘤细胞染色阳性;2，25-75％的肿瘤细胞呈阳性染色;3，超过75％的肿瘤细胞染色阳性。两位病理学家选择了五个高倍视野来检查和计算细胞的免疫反应性。然后加入免疫活性和染色阳性的得分以得到样品的表达评分。然后加入免疫活性和染色阳性的得分以得到样品的表达评分。
    　　 使用膜联蛋白V-荧光素异硫氰酸酯和碘化丙啶进行凋亡测定。简言之，将PCH1和H460细胞离心，用冷结合缓冲液洗涤，并重悬于200μl结合缓冲液中。在4℃下在黑暗中孵育15分钟后，将FITC缀合的膜联蛋白V加入到每个样品中。洗涤细胞，并在孵育5分钟后向混合物中加入PI。立即在FACSCalibur上对细胞进行流式细胞术分析。测定每组中早期或晚期凋亡细胞的百分比。
    　　 来自基于细胞的实验的所有数据均来自至少三次独立实验，并记录为平均值±标准偏差。为了比较两组以上的方法，使用单向ANOVA;对于其他结果，使用Student'st检验评估组间差异。使用Spearman秩检验评估Brachyury免疫反应性和CA9免疫反应性之间的关联。P值小于0.05被认为具有统计学意义。
    　　 为了研究脊索瘤化疗耐药的分子机制，出国看病网研究人员从人类肿瘤组织中产生了两种原代细胞系。成功产生了两种细胞系PCH1和PCH2。RT-PCR结果表明这两种细胞系表达了脊索瘤特异性标志物brachyury，检测了其他癌细胞系中的T基因表达，发现它在H460细胞中表达，但在U2OS细胞中没有表达。成功地产生了两个脊索瘤细胞系以评估脊索瘤的生物学行为的分子机制。敲除Brachyury可增加腺样囊性癌细胞对化疗和放疗的敏感性。Brachyury在超过90％的脊索瘤中表达。Brachyury是否在脊索瘤对紫杉醇等常见化学疗法的抗性中起着重要作用。研究人员检测了T基因表达降低或强制过表达后的细胞活力。在PCH1细胞中siRNA可有效降低Brachyury蛋白水平。当用不同浓度的紫杉醇处理PCH1细胞时，对照PCH1细胞和Brachyury敲低细胞的细胞活力以剂量依赖性方式降低。Brachyury敲低使细胞对紫杉醇处理敏感，表明Brachyury可以保护细胞免受紫杉醇诱导的细胞凋亡。通过流式细胞术分析进一步验证了该结果。流式细胞仪数据显示，62％的Brachyury-knockdown细胞经历凋亡，而只有0.63％的对照PCH1细胞经历凋亡。在H460细胞中获得了类似的结果。
    　　 研究人员假设Brachyury靶基因参与紫杉醇诱导的细胞凋亡，因为Brachyury是一种转录因子。因此，研究人员使用微阵列分析检查了对照细胞系和Brachyury敲低细胞系之间基因表达的全局变化。共有1472个基因显着改变了至少2倍。通过RT-PCR进一步证实表达显着改变且与肿瘤发生有关的基因。在PCH1细胞中抑制Brachyury表达后，检测到这些基因的表达变化，Brachyury表达改变了PCH1和U2OS细胞对紫杉醇的敏感性，表明该活性不依赖于细胞类型。努力探索参与紫杉醇敏感性的Brachyury的靶基因。比较了Brachyury过表达或敲低后不同细胞的基因表达谱。Brachyury诱导的改变的表达对于不同细胞系之间的一些基因是一致的。例如，在PCH1和U2OS细胞中强制Brachyury表达后，HHIP和EPHA5表达降低并且CA9和Radsxms1表达增加。GO分析和以前的研究表明，CA9是细胞凋亡相关基因。表明CA9水平可以预测乳腺癌患者对化疗的反应。CA9的抑制促进了人癌细胞中药物介导的细胞凋亡。
    　　 脊索瘤是一种罕见的骨癌。出生后，一些脊索细胞保留在颅底，椎骨和尾骨的骨骼中。这些细胞会发生变化，从而引起脊索瘤。手术切除仍然是脊索瘤的主要治疗方法，因为化疗耐药性很常见。鉴定涉及脊索瘤对化学疗法的抗性的因子或信号途径是改善患者预后所必需的。研究人员产生了表达脊索瘤标志物的原发性脊索瘤细胞系。在这些细胞系中观察到高水平的Brachyury表达。原代细胞系具有限制，它们在3-6代传代后通常被成纤维细胞淹没。原发性脊索瘤细胞系仅用于第2代至第6代的实验。作为转录因子，Brachyury在癌症发展中起着关键作用。Brachyury通过抑制E-钙粘蛋白表达诱导EMT，这是癌转移的关键步骤。Brachyury在癌症化学抗性中的作用。Brachyury敲低不仅抑制腺样囊性癌干细胞的迁移和侵袭，而且通过下调ATP结合盒转运蛋白等药物转运基因来抑制化疗抗性。Brachyury可以结合p21基因启动子区域的半个T-box共有位点，并影响癌症对化疗的敏感性。
    　　 虽然Brachyury表达水平与脊索瘤活力密切相关，但其对脊索瘤化疗耐药的影响尚未被描述。原发性脊索瘤细胞系研究了其在化疗耐药中的功能。当Brachyury表达被敲低时，脊索瘤细胞系对紫杉醇诱导的细胞凋亡变得敏感。Brachyury过表达在用紫杉醇治疗后赋予脊索瘤细胞存活优势。该观察结果不限于脊索瘤细胞，因为在过表达Brachyury水平后U2OS细胞表现出降低的敏感性。Brachyury在腺样囊性癌细胞中的作用相似。表明Brachyury在脊索瘤化学抗性中起作用。在大多数脊索瘤中过度表达，Brachyury可能是脊索瘤对当前化学疗法不敏感的重要分子机制。作为对中胚层形成和致癌作用具有广泛影响的转录因子，Brachyury可通过调节特定基因的表达参与该过程。
    　　 在PCH1和U2OS细胞中都鉴定出Brachyury靶向的一些常见基因，包括CA9。碳酸酐酶是一大类锌金属酶，可催化二氧化碳的可逆水合作用。在正常条件下，CA9可通过其酶活性保持酸碱平衡。在缺氧条件下，CA9表达被缺氧诱导因子1上调并增强肿瘤环境的酸化，从而促进癌细胞的存活。锌指E-box结合同源框1可以直接结合CA9启动子，转录调节CA9表达。ChIP分析表明CA9转录由Brachyury直接调节。IHC染色进一步支持了Brachyury和CA9之间的正相关。Brachyury被确定为控制CA9表达的新因子。促进化学抗性被认为是CA9在肿瘤发生中的重要功能。高CA9水平降低各种恶性肿瘤[化疗敏感性通过干扰肿瘤微环境。CA9抑制剂减少几个肿瘤的生长和转移。GO分析表明CA9是导致细胞凋亡的关键因素，CA9可能参与了Brachyury介导的紫杉醇抗性。PCH1细胞中CA9的敲低降低了Brachyury诱导的紫杉醇抗性。CA9也可以是脊索瘤治疗的药物靶标。
    　　 该研究提供了CA9是Brachyury靶基因的证据。CA9与Brachyury介导的紫杉醇敏感性有关，暗示CA9参与癌症的化学疗法抗性，包括脊索瘤。需要进一步的研究来确定CA9参与脊索瘤化疗耐药的机制及其在脊索瘤治疗中的价值。
 
出国看病概况

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　　 从中国经济发展水平和消费能力预测，未来10年时间，海外医疗市场及其相关产业的市场的巨大潜力，有可能超过数百亿美元。
出国看病适应症
靶向药物
 

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