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多发性骨髓瘤是致命恶性肿瘤
  • 　　多发性骨髓瘤是成熟血浆B细胞的致命恶性肿瘤。在OvertMM之前是一个癌前期阶段，意义不明的单克隆丙种球蛋白病，可以进展为OvertMM并最终发展为致命性骨髓瘤。在癌前期MGUS细胞中检测到的遗传改变可能是启动事件。这些可分为两种主要亚型，最常见的是非重叠：超二倍体骨髓瘤的特征在于大多数奇数染色体的三体，而非HRD骨髓瘤经常涉及免疫球蛋白重链易位。这些癌基因通过将它们置于一个或两个强大的B细胞特异性IGH的控制之下来上调靶癌基因增强区;在MM中检测到继发性遗传事件，但不是其前体阶段，并且被认为可以推动疾病进展。最常见的继发事件包括MYC易位，涉及KRAS，NRAS和DIS3的单核苷酸变体和拷贝数变体，其扩增染色体臂1q或删除1p，6q，13,14q或16q。
    　　在预后模型中利用了这种遗传病变的多样性，该模型将国际分期系统与CNV，SNV和易位的发生率相结合。这种ISS-MUT模型在检测早期死亡率和进展方面提高了ISS的精确度。其他研究强调了突变类型中变异的背景依赖性预后意义。例如，已经发现染色体的三体性消除了与t易位相关的较差的总体存活率。这些结果突出了CNV，SNV和易位之间相互作用的预后影响-共同发生突变的潜在可能减轻其他不良结果意味着测试患者所有三种类型的突变可能有助于更准确地靶向化疗方案对未来的特定患者亚组。
    　　检测骨髓瘤相关突变可以通过外显子组测序完成，针对疾病相关基因子集的方法应该减少计算分析，促进更快地返回临床结果，并在固定预算下实现更深层次的排序。临床测序随着频率的增加进行均可商和通过癌症中心。在MM的特定背景下，基于扩增子的77基因小组检测CNV和SNV。这扩展了早期的面板，用于跟踪47个基因的突变进化。其他的努力集中在IGH重排和易位：轨迹的基于扩增子测序有效地检测微小残留病，而基于捕获方法已被用来发现IGH和MYC易位。
    　　类似的富集技术可用于同时检测CNV，SNV和易位。该方法涉及IGH基因座的靶向测序和涉及MM或其他癌症的246个基因。该平台用于分析14个MM细胞系和5个初级样品。成熟这些方法将需要对相关生物信息学方法进行广泛验证和调整。出国看病网研究人员开发了一个相关的MM特异性靶向测序平台，并对95个原发肿瘤样本进行了验证，其中44个先前已经过外显子组测序，其中22个先前通过荧光原位杂交进行了测定。研究人员通过这些外显子组测序和FISH结果证明了该平台的高度一致性。调整计算CNV和易位调用方法的新方法。这些优化的方法促进了跨突变类型的综合分析，揭示了涉及CNV，SNV和易位的互斥和共现的模式。具有IGH的IGLL5和在IGLL5中检测到的高频突变。这些IGLL5突变与RAS突变相互排斥并且与疾病进展相关，表明IGLL5可能参与疾病发病机理或作为高风险MM的生物标志物。
    　　研究人员开发了一种特定于MM的定制捕获测序平台，能够检测CNV，SNV和易位。研究人员设计了覆盖3.3Mb基因组空间的寡核苷酸探针，并与外显子，非翻译区和465个基因的剪接位点互补，这些基因在MM中表达：1）注释为癌症基因，2）在DNA修复或B细胞生物学功能，3）以大于3％的频率发生突变在已发表的研究，4）具有在热点簇突变。为了检测IGH易位，还设计了探针在整个基因座上以无偏的方式平铺，包括在变量内，分集，连接和恒定/开关区域。还设计了针对经典IGH易位配偶体的外显子区域的探针。为了捕获继发性MYC易位，在MYC基因座的外显子和内含子区域铺设探针。
    　　使用该平台对从95个肿瘤和配对的正常样品中分离的DNA进行测序。专门选择这些样品以验证研究人员的平台并调整研究人员的计算方法，因为它们的子集先前经历了外显子组测序或FH的IGH易位分析。在整个肿瘤样本中实现了104×的平均测序深度，并且在正常情况下实现了107×的平均测序深度样本。
    　　平台跨染色体臂和465基因的广泛覆盖促进了染色体水平，臂水平和局灶性CNV的检测。研究人员使用CopyCAT2从肿瘤与正常测序深度的每探针比率计算地识别这些事件。开发了一种过滤CNV呼叫的方法，其比率低于从二倍体区域估计的噪声水平。确定了全方位的CNV，从基因组规模的超二倍体到焦点事件，包括包含BRCA2的纯合缺失。检测到的臂水平事件包括与预后不良相关的事件，例如amp，del，del和del。研究人员使用LUMPY检测到IGH易位，并再次开发了过滤策略以减少可能的误报。研究人员基于支持分裂读数和不一致配对末端读数的阈值来过滤推定的易位。研究人员使用机器学习方法和可用的FISH数据调整阈值以最大化精度，导致精度为100％并且召回率为64％。然后平台接近预期频率检测典型IGH易位并主要发生在IGH恒定区内，但也发生在端粒内。IGHM开关区域偶尔在D和J区域内。值得注意的是，t易位中的一个发生在恒定区域内，但在所有常数和开关区段之外。该研究发现在这些区域的每一个内发生IGH易位。V区域内的易位没有通过过滤步骤。
    　　为了优先考虑新的IGH易位作为潜在的驱动突变，研究人员在每个染色体断裂点的1Mb内鉴定了癌症相关基因。进一步分析具有最大总证据的两个带注释的易位。第一个是涉及染色体11,13和14的复杂易位.13号染色体上的推定断点位于FLT3附近;研究人员验证了染色体13q12.2确实通过PCR转移到14号染色体上的IGH。第二个高度支持的易位的断点t位于IGH和IGLL5内，其由免疫球蛋白h轻链基因座跨越。为了验证这种易位，研究人员对从检测到它的患者分离的DNA进行了假定断裂点的PCR扩增。在CD138+肿瘤细胞中检测到预期大小的PCR产物，但在外周血单核对照中没有检测到。肿瘤特异性PCR产物的重新测序和作图证实了跨越染色体14和22的相互易位。在两个衍生染色体上缺失小区域，因此可用于选择性扩增相应的野生型染色体。研究人员在这些缺失的区域内设计了引物并用它们进行PCR扩增，这证实了肿瘤样本中每个WT染色体的一个拷贝的保留。
    　　为了寻找额外的IGLL5易位，研究人员放宽了研究人员的过滤限制，并发现了由LUMPY预测的第二个样本，以便在易位时，尽管没有DNA可用于验证。预测经验证的t易位将u和3'增强子与DERL3并置。检查部分重叠的84名MM患者的RNA-seq表达数据，寻找在22号染色体预测断点的1Mb内过表达DERL3和其他癌症相关基因的证据。DERL3的外围表达在这些样品中的六个中，包括具有推定的t易位的第二个样品。相对于癌细胞系百科全书中的其他癌症类型，DERL3在MM中过表达，其他B细胞恶性肿瘤也报道了高表达。队列和CCLE中检查了IGLL5的表达。IGLL5在研究人员具有RNA-seq数据的推定易位样品中，表达位于第82百分位数，尽管相对于平均表达没有显着提高。CCLE中MM细胞系中的IGLL5表达仅次于Burkitt的淋巴瘤细胞系;并且与DERL3一样，B细胞恶性肿瘤中的IGLL5表达高于其他癌症类型。这些数据表明DERL3可能通过IGH易位或其他未知机制在MM中失调。
    　　MYC易位的FISH验证数据无法用于调整LUMPY参数，内部和染色体间MYC易位被称为高假阳性率。为了准确检测体细胞MYC易位，，用于过滤正常样品中称为假定的MYC易位。将该方法应用于肿瘤样品导致5个染色体内和2个非IGH染色体间MYC易位，其中一个样品具有一个染色体内和一个染色体间易位。染色体内易位涉及邻近基因PVT1和POU5F1B。所有肿瘤样品都具有至少一个体细胞突变，每个样品具有20个突变的平均值。总共443个基因在一个或多个样品中具有非同义突变;581个基因在一个或多个样本中具有任何类型的突变。95个肿瘤样本中有94个具有预测由Poly-Phen2或SIFT有害的突变，每个样本具有12个有害突变的平均值。在24个实例中，研究人员观察到一个携带多个先前与癌症相关的突变的基因。这发生在17个基因的13个样本中，包括KRAS和RB1;两者都是最常见的。
    　　为了确定MM是否具有生物学意义的深亚克隆变体，研究人员对15个肿瘤进行了额外测序和配对正常样本。在原始或随后的深度测序中发现的变体的等位基因频率。为了关注可能具有生物相关性的高可信度事件，研究人员删除了沉默变体，即内向，基因间或侧翼区域的变异，IGH中的变异，或者至少在一项研究中被至少一个呼叫者标记为可能的种系变体的那些。这导致原始测序研究中的57种变体和随后研究中的67种变体。两项研究共享的变异等位基因频率高度相关。这两项研究中独有的绝大多数变异体都具有较低的VAF：原始研究中独有的四种变异体之一的VAF小于10％，尽管所有变异等位基因数均为3或更少支持读数，而12随后研究中独有的14种变体的VAF小于10％。虽然通过额外的测序发现了相对较少的新变体，但这些确实包括在基因KRAS，HECW1和ZFHX4中的COSMIC中的几个注释。
    　　这些结果在对44个样本中发现的变体进行了比较，这些样本经过基于捕获的测序，之前进行外显子组测序。两项研究中发现的1,450个突变具有高度相关的VAF。一项研究独有的大多数变异体具有低VAF：基于捕获的研究所特有的112种变体中的79种和基于外显子组的研究中独特的2,113种变体中的2,066种具有VAF小于10％。
    　　为了进一步探索测序深度的影响，研究人员对15个深度测序样品的测序读数进行了下采样，在下采样读数上称为变体，并在下采样和完整数据集中绘制了过滤后的变体总数。如所预期的，变体的数量与测序深度相关。超过最终测序深度的约25％，发现的变体数量的增加是微不足道的。在后面重新测序的15个原始捕获结果的上述情况下，在甚至更低的92×深度处观察到类似的性能。低至100倍的深度可以捕获大部分感兴趣的变体，超过300倍的覆盖率将导致收益率急剧下降。
    　　CNV，SNV和易位的综合分析突出了突变类型内部和之间的互斥和共存模式。排除明显的超突变样本后测试了这些模式的显着性，以提高统计功效。检测到互斥性在超二倍体和t之间。检测了CNV和SNV之间的交叉突变型排他性即两种RAS突变和FAM46C与del。IGLL5是研究人员数据集中第三个最频繁突变的基因，其中IGLL5突变富含c-AID特征;40个检测到的IGLL5中有38个SNV发生在氨基酸位置1至100，在任何注释的蛋白质结构域之外。剩余的两个发生在免疫球蛋白C1-结构域中。在突变IGLL5相互排斥的RAS突变，具有朝向相互排斥的趋势与KRAS，NRAS，和FAM46C，独立地。IGLL5二倍体位点的突变中值VAF为58％，第一个四分位数VAF为39％，表明大部分可能是克隆的。最后，研究人员发现IGLL5SNV与疾病进展相关。
    　　研究人员开发了一种基于捕获的MM特异性测序平台，针对465种检测CNV，SNV和易位的基因。研究人员使用该平台对95个肿瘤/正常对进行测序，并使用外显子组测序和FISH数据验证其检测SNV和易位的能力。在开发用于减少假阳性的定制计算方法之后，研究人员检测了CNV和预期频率下的已知IGH易位并发现了罕见的新型染色体易位。通过对15对进行深度测序，研究人员发现通过测序深度发现的非沉默变体数量略有增加。对于95对的完整群组使用更适度的测序深度，可以实现许多科学和一些临床目标。尽管已经公布了相当多的频率。这种差异可能部分是由于样本大小，疾病阶段，测定和测定优化/调整的差异。使用FISH的早期研究报道了50％的原发性肿瘤中复杂的MYC异常，分析的样本很少和先进。我的C在使用FISH-15％的新诊断MM患者中检测到的易位频率与研究人员观察到的更相似。
    　　IGLL5通过在MM两个点的替换和易位突变的。基因座内的SNV可能是由免疫球蛋白h轻链基因座的体细胞超突变引起的，其跨越IGLL5。实际上，研究人员在IGLL5中看到了AID诱导的突变的富集，正如先前在慢性淋巴细胞白血病中观察到的那样，其中该基因经常突变。非同义IGLL5突变与RAS突变相互排斥并与疾病进展相关。并且中值VAF为58％，可能存在于创始克隆中。这些发现表明IGLL5突变可能有助于骨髓瘤发病机制，但没有其他数据，其功能意义仍然未知。突变和易位不会反复影响IGLL5蛋白中特定残基的事实支持功能丧失模型，但另一种假设是IGLL5突变仅仅是高风险疾病的生物标志物。
    　　研究人员观察到IGLL5易位至两个患者样品中的IGH基因座。据报道，在B细胞及其相关疾病中IGH与两个轻链基因座之间的易位：IGL/IGH易位已报道在非霍奇金淋巴瘤和活化B细胞中，提出易位是由非同源末端连接的缺陷诱导IGL基因座上的VJ-重组相关的断裂和类别转换重组相关的IGH休息。由于易位没有明显的选择性优势，这些易位只是反映了两个频繁破碎和空间近端位点所呈现的机械机会。已经在B细胞淋巴瘤和患者衍生的B淋巴母细胞样细胞系中检测到与IGK合用的IGH易位，后者可能归因于患者先前用DNA损伤性烷化剂的长期治疗。检测到的易位仍然可能通过选择IGLL5下游的大型超级增强剂发挥作用。发现在MM1.SMM细胞系中有活性。它在IGLL5和BCR之间的位置将其置于研究人员验证的t易位的der染色体上。这种超级增强子可以放大IGH增强子在上调转移到14号染色体上的邻近基因表达的作用。这样的基因DERL3在MM肿瘤中相对于其他癌症类型的上调，和具有第二推定t易位的样品，具体而言。过度表达DERL3通过增加蛋白酶体内的内质网相关降解，可以在MM中发挥作用。DERL3在ER中形成输出通道，通过该输出通道命运用于降解的错误折叠的蛋白质到达蛋白酶体。蛋白酶体抑制剂硼替佐米在MM细胞中非常有效。如果相反促进而不是抑制蛋白酶体的活性，DERL3过表达可能赋予MM细胞选择性优势。未来的实验需要破译IGLL5易位的重要性和DERL3过表达的重要性。
    　　除了检测已知突变，该平台被设计成能够发现：研究人员查询465倍的基因，更大的一组比以前目标平台测定，研究人员在整个V平铺，D和J区域，而不是将探针限制在这些区域内的注释区段试图检测涉及基因座的区段间区域的易位。需要额外的经验来评估这些设计决策。例如，缺乏涉及J区域的推断易位可能表明用于平铺该~700Kb区域的探针在其他地方得到更好的投资。该平台的未来版本应该提供目前缺乏的染色体臂Yq覆盖，尽管串联丰富的acrocentric染色体臂仍然难以捕获。另外，针对常见SNP的靶向探针将能够检测给定基因座处的等位基因特异性倍性，这将促进基于SNV的克隆进化推断。
    　　突变和表达数据，与ISS阶段相结合，已被证明可以提高单独ISS阶段的预后准确性。事实上，最近的两个众包比赛并DREAM挑战;使用单一平台来分析CNV，SNV和易位的容易性将促进这些和相关的努力。相同的探针可用于进行靶向RNA测序，这也将为这些研究提供跨样品的比较基因表达。
 
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